CN107249608A - 使用祖细胞治疗视网膜变性 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用祖细胞以及得自祖细胞诸如产后衍生细胞的条件培养基治疗和减轻视网膜变性的方法和组合物。本发明还公开了保护视网膜细胞并抑制视网膜细胞诸如感光细胞的凋亡的祖细胞分泌的营养因子及其它试剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月16日提交的美国临时申请序列号62/092,658和2015年10月2日提交的美国临时申请序列号62/236,732的优先权,其各自全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及眼科疾病和病变的基于细胞的治疗或再生性治疗的领域。具体地,本发明提供使用祖细胞诸如脐带组织衍生的细胞和胎盘组织衍生的细胞以及由那些细胞制得的条件培养基来再生或修复眼部细胞和组织的方法和组合物。
背景技术
作为身体一个复杂而敏感的器官,眼可经受多种疾病和影响其发挥正常功能的能力的其它有害病症。这些病症中的许多与特定眼部细胞以及由那些细胞所构成组织的损伤或变性相关联。作为一个示例,视神经和视网膜的疾病和变性病症是全世界导致失明的主要原因。角膜、晶状体和相关眼部组织的损伤或变性是世界范围内视力丧失的另一个重要原因。
视网膜包含七个交替的细胞和突起的层,将光信号转换为神经信号。视网膜感光细胞和相邻的视网膜色素上皮(RPE)形成在许多病变中因基因突变或环境条件(包括年龄)而变得不平衡的功能单元。这通过细胞凋亡或继发性变性而造成感光细胞损失,其导致视觉进行性恶化且在一些情况下导致失明(综述参见例如Lund,R.D.等人,Progress inRetinal and Eye Research,2001;20:415-449)。属于该模式的两类眼部病变是年龄相关性黄斑变性(AMD)和色素性视网膜炎(RP)。
在50岁或更年长的那些美国人中,AMD是视力丧失的最常见原因,并且其随年龄增长而愈加普遍。AMD的主要病变似乎是由于RPE功能障碍和特征为类脂沉积、蛋白质交联和对营养物质的渗透性减小等等的布鲁赫氏膜改变(参见Lund等人,2001,同上)。多种因素均可导致黄斑变性,包括基因构成、年龄、营养、吸烟和暴露于目光或其它氧化应激反应。非渗出性或“干”形式的AMD占AMD病例的90%;其它10%为渗出性或新血管形式(“湿”AMD)。在干性ADM患者中,视网膜色素上皮(RPE)逐渐消失,从而导致外接区域萎缩。因为感光细胞损失是RPE消失的结果,所以受到影响的视网膜区域几乎没有或没有视觉功能。
AMD的当前疗法例如包括诸如激光治疗和药物干预的方法。激光束通过转移热能破坏黄斑下的渗漏血管,从而减慢视力丧失速度。激光治疗的缺点在于光束递送的高热能也破坏了邻近的健康组织。Neuroscience第4版(Purves,D等人2008)叙述“目前无法治疗干性AMD。”
人类的RPE移植尚未取得成功。例如,Zarbin,M,2003叙述“随着正常老化,人布鲁赫氏膜(尤其是在黄斑下区域中)发生多个变化(例如,厚度增加,ECM和脂质沉积,蛋白质交联,非酶促形成陈旧性糖化作用终产物)。这些变化以及附加变化是由于AMD可减小ECM配体(例如,层粘连蛋白、纤粘蛋白和胶原IV)的生物利用率并导致患AMD的眼中RPE细胞的存活极差。因此,虽然人RPE细胞表达连接这些ECM分子所需的整联蛋白,但老年黄斑下人布鲁赫氏膜上的RPE细胞存活却变差。”(Zarbin,MA,Trans Am Ophthalmol Soc,2003;101:493-514)。
色素性视网膜炎主要被认为是遗传性疾病,其中超过100个突变与感光细胞损失相关联(参见Lund等人,2001,同上)。虽然大多数突变以感光细胞为目标,但一些突变仍直接影响RPE细胞。这些突变一起影响诸如感光细胞与RPE细胞之间的分子运输和光传导的过程。
其它较不常见但仍使人衰弱的视网膜病变还可包括导致视力丧失和失明的进行性细胞变性。这些包括例如糖尿病性视网膜病和脉络膜新生血管膜(CNVM)。
用于组织修复和再生的基于干细胞的治疗的出现为多种前述细胞退行性病变及其它眼部病变提供潜在治疗。干细胞能够自我更新和分化以产生多种成熟的细胞谱系。此类细胞移植可用作重构靶组织从而恢复生理和结构功能的临床工具。干细胞技术的应用非常广泛,包括组织工程、基因治疗递送和细胞疗法,即,生物治疗剂经由产生或包含这些药剂的外源提供的活细胞或细胞组分递送至靶位置。(综述参见例如Tresco,P.A.等人,Advanced Drug Delivery Reviews,2000,42:2-37)。
最近已显示产后衍生细胞改善视网膜变性(US 2010/0272803)。皇家外科医学院(Royal College of Surgeons,RCS)大鼠具有影响外节段吞噬作用的酪氨酸受体激酶(Mertk)缺陷,从而导致感光细胞死亡。(Feng W.等人,J Biol Chem.,2002,10:277(19):17016-17022)。已发现将视网膜色素上皮(RPE)细胞移植到RCS大鼠的视网膜下间隙限制感光细胞损失的发展并且维持视觉功能(US 2010/0272803)。也已证明产后衍生细胞可用于促进感光细胞挽救并因而保留RCS模型中的感光细胞(US 2010/0272803)。将人脐带组织衍生的细胞(hUTC)经视网膜下注入RCS大鼠眼中提高视敏度并且改善视网膜变性(US 2010/0272803;Lund RD等人,Stem Cells.2007;25(3):602-611)。此外,采用源于hUTC的条件培养基(CM)处理恢复了体外营养不良RPE细胞中的ROS吞噬(US 2010/0272803)。
吞噬细胞清除凋亡细胞是正常生命的组成部分,并且该过程中的缺陷可对自身耐受性和自身免疫性具有重要意义(Ravichandran等人,Cold Spring Harb PerspectBiol.,2013,5(1):a008748.doi:10.1101/cshperspect.a008748.综述)。识别并除去凋亡细胞主要由专业吞噬细胞(受体结合病原体进行吞噬)诸如巨噬细胞、单核细胞及其它白细胞以及非专业吞噬细胞(吞噬作用并非主要功能)诸如上皮细胞、RPE细胞、内皮细胞介导。迄今为止,已鉴定出多个“吞噬我”的信号,包括表面蛋白糖基化的变化或表面电荷的变化(Ravichandran等人,Cold Spring Harb Perspect Biol.,2013)。磷脂酰丝氨酸(PS)的外在化是细胞凋亡的标志,并且是研究最透彻的“吞噬我”信号(Wu等人,Trends.Cell Biol.,2006,16(4):189-197)。“吞噬我”信号直接地(如同PS受体)或间接地经由桥分子和辅助受体由吞噬细胞的吞噬受体识别出(Erwig等人,Cell Death.Differ.,2008;15:243-250)。桥分子乳-脂肪-小珠-EGF-因子8(MFG-E8)、生长抑制特异性蛋白6(Gas6)、蛋白质S、血小板反应蛋白(TSP)、载脂蛋白H(先前被称为β2-糖蛋白I、β2-GPI)均与凋亡细胞表面上的PS结合。MFG-E8可随后由αvβ3和αvβ5整联蛋白通过其RGD基序识别出(Hanayama等人,Science,2004,304:1147-1150;Borisenko等人,Cell Death Differ.,2004;11:943-945),Gas6由Ax1、Tyro3和Mer家族的受体酪氨酸激酶识别出(Scott等人,Nature,2001;411:207-211)并且载脂蛋白H由β2-GPI受体识别出(Balasubramanian等人,J Bio Chem,1997;272:31113-31117)。其它桥分子连接至所识别的凋亡细胞表面上改变的糖和/或脂质,例如凝集素家族的成员表面活性剂蛋白A和D(Vandivier等人,J Immunol,2002;169:3978-398)。
凝集素家族的分子然后通过如下方式被识别出:其胶原尾部与钙网蛋白(CRT)相互作用,进而发出信号以使吞噬细胞通过低密度脂蛋白(LDL)-受体-相关蛋白(LRP-1/CD91)摄取(Gardai等人,Cell,2003;115:13-23)。又如,所鉴定的第一桥分子为血小板反应蛋白(TSP)-1(Savill等人,J Clin Invest,1992;90:1513-1522),细胞外基质糖蛋白被认为与凋亡细胞上的TSP-1结合位点结合,并然后与包含αvβ3和αvβ5整联蛋白和清道夫受体CD36的吞噬细胞上的受体复合物结合。膜联蛋白I属于膜联蛋白家族的Ca2+-依赖性磷脂-结合蛋白并优先位于质膜的胞质面。膜联蛋白I示出与PS共同定位。
RPE的ROS吞噬作用对视网膜功能至关重要(Finnemann等人,PNAS,1997;94:12932-937)。据报道参与RPE吞噬ROS的受体包括清道夫受体CD36、整联蛋白受体αvβ5、受体酪氨酸激酶(称为Mertk)和甘露糖受体(MR)(CD206)(Kevany等人,Physiology,2009;25:8-15)。Finnemann发现,分离的ROS具有外化的PS,该外化PS的阻断或移除降低了RPE在培养中对其的结合和吞噬(Finnemann等人,PNAS,2012;109(21):8145-8148)。然而,对RPE吞噬作用的了解仍知之甚少。
发明内容
本发明提供适用于眼科疾病和病变的基于细胞的治疗或再生性治疗的组合物和方法。具体地,本发明的特征在于治疗眼科疾病或病症的方法和组合物,包括用祖细胞如产后衍生细胞以及由那些细胞产生的条件培养基再生或修复眼部组织。产后衍生细胞可为脐带组织衍生的细胞(UTC)或胎盘组织衍生的细胞(PDC)。
本发明的一个方面是治疗眼科疾病的方法,包括向受治疗者施用祖细胞,或者由祖细胞群制得的条件培养基,其中所述细胞分泌桥分子。在本发明的一个实施方案中,桥分子由条件培养基中的细胞群分泌。在另一个实施方案中,桥分子选自MFG-E8、Gas6、血小板反应蛋白(TSP)-1和TSP-2。在本发明的实施方案中,细胞是祖细胞。在本发明的特定实施方案中,细胞是产后衍生细胞。在本发明的实施方案中,产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织或胎盘组织中分离。
在一些实施方案中,祖细胞例如产后衍生细胞群分泌桥分子。在一个实施方案中,由祖细胞例如产后衍生细胞群制得的条件培养基包含细胞群所分泌的桥分子。细胞分泌的和条件培养基中分泌的此类桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。产后衍生细胞为脐带组织衍生的细胞(UTC)或胎盘组织衍生的细胞(PDC)。
在一个实施方案中,桥分子抑制感光细胞凋亡。在另一个实施方案中,祖细胞分泌的和在条件培养基中分泌的桥分子减少感光细胞的损失。在一个实施方案中,感光细胞的损失通过桥分子刺激感光细胞片段的吞噬来减少。
在另一个实施方案中,上述细胞群或由上述细胞群制得的条件培养基修饰视杆细胞外节膜盘(ROS)以促进吞噬。在另一个实施方案中,桥分子增强视网膜色素上皮(RPE)细胞对ROS的结合和内在化。
在另一个实施方案中,上述细胞群或由上述细胞群制得的条件培养基包含细胞群所分泌的受体酪氨酸激酶(RTK)营养因子。在一个具体的实施方案中,营养因子为BDNF、NT3、HGF、PDGF-CC、PDGF-DD和GDNF。在一些实施方案中,RTK营养因子介导视网膜色素上皮(RPE)细胞的吞噬作用。
在某些实施方案中,RTK营养因子介导RPE细胞的吞噬作用以吞噬脱落的感光细胞片段(细胞脱落的感光细胞片段)。在另一个实施方案中,RTK营养因子激活RCE细胞上的受体以刺激吞噬作用。
本发明的另一个方面的特征在于用于减少视网膜变性中的感光细胞的损失的方法,该方法包括将祖细胞群或由祖细胞群制得的条件培养基以有效减少感光细胞损失的量施用于眼。在本发明的一个实施方案中,祖细胞是产后衍生细胞。在一个具体实施方案中,产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织或胎盘组织中分离。如在其它在实施方案中,产后衍生细胞分泌桥分子。在一些实施方案中,条件培养基包含由细胞群如产后衍生细胞群分泌的桥分子。此类由产后衍生细胞分泌的桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。
在另一个实施方案中,条件培养基由来源于基本上不含血的人脐带组织或胎盘组织的经分离的产后衍生细胞或产后衍生细胞群产生。在一些实施方案中,产后衍生细胞能够在培养中扩增并且具有分化成神经表型的细胞的潜力;其中所述细胞需要L-缬氨酸用于生长并且能够在至少约5%的氧气中生长。该细胞还包括以下特征中的一种或多种:(a)在培养中至少约40次倍增的潜力;(b)在经包被或未经包被的组织培养容器上贴附和扩增,其中经包被的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的被覆物;(c)产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一种;(d)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C中的至少一种;(e)不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ中的至少一种,如由流式细胞术所检测;(f)相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码以下项的至少一种基因的基因表达是增加的:白介素8;浆膜蛋白1;趋化因子(C--X--C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性,α);趋化因子(C--X--C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2);趋化因子(C--X--C基序)配体3;肿瘤坏死因子,α-诱导蛋白3;C-型凝集素超家族成员2;肾母细胞瘤1;乙醛脱氢酶1家族成员A2;肾素;氧化低密度脂蛋白受体1;智人克隆IMAGE:4179671;蛋白激酶Cζ;假定蛋白DKFZp564F013;在卵巢癌中下调的1;来自克隆DKFZp547k1113的智人基因;(g)相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码以下项的至少一种基因的基因表达是减少的:矮小同源盒2;热休克27kDa蛋白2;趋化因子(C--X--C基序)配体12(基质细胞衍生因子1);弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄,威廉斯-博伊伦综合征);智人mRNA;cDNADKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022);间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒);sine oculis同源盒同源物2(果蝇属);晶状体蛋白,α B;形态发生紊乱关联激活因子2;DKFZP586B2420蛋白;类似于neuralin 1;四连接素(纤溶酶原结合蛋白);src同源三(SH3)和富含半胱氨酸的结构域;胆固醇25-羟化酶;runt相关转录因子3;白介素11受体,α;前胶原C-内肽酶增强子;卷曲同源物7(果蝇属);假定基因BC008967;胶原,VIII型,α1;腱生蛋白C(hexabrachion);易洛魁族同源盒蛋白5;膜铁转运辅助蛋白;整联蛋白,β8;突触小泡糖蛋白2;成神经细胞瘤,抑制瘤变蛋白1;***结合蛋白2,36kDa;智人cDNA FLJ12280 fis,克隆MAMMA1001744;细胞因子受体样因子1;钾中间体/小电导钙活化通道,亚家族N,成员4;整联蛋白,β7;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);sine oculis同源盒同源物2(果蝇属);KIAA1034蛋白;囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白);含EGF腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1;早期生长反应因子3;远端缺失同源盒5;假定蛋白FLJ20373;醛酮还原酶家族1,成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶,II型);双糖链蛋白聚糖;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);纤粘蛋白1;前脑啡肽;整联蛋白,β样1(具有EGF样重复结构域);智人mRNA全长***cDNA克隆EUROIMAGE 1968422;EphA3;KIAA0367蛋白;尿钠***肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠***肽受体C);假定蛋白FLJ14054;智人mRNA;cDNADKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3样;AE结合蛋白1;细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉);类似于neuralin 1;B细胞易位基因1;假定蛋白FLJ23191;和DKFZp586L151;以及(h)不表达hTERT或端粒酶。在一个实施方案中,脐带组织衍生的细胞还具有下列特征:(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1中的至少一种;(j)不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF中的至少一种,如由ELISA所检测。在另一个实施方案中,胎盘组织衍生的细胞还具有下列特征:(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中的至少一种;(j)不分泌TGF-β2、MIP1b、ANG2、PDGFbb、FGF和VEGF中的至少一种,如由ELISA所检测。
在具体的实施方案中,产后衍生细胞具有以下项的所有鉴别特征:细胞类型UMB022803(P7)(ATCCC登录号PTA-6067);细胞类型UMB 022803(P17)(ATCC登录号PTA-6068),细胞类型PLA 071003(P8)(ATCC登录号PTA-6074);细胞类型PLA 071003(P11)(ATCC登录号PTA-6075);或细胞类型PLA 071003(P16)(ATCC登录号PTA-6079)。在一个实施方案中,来源于脐组织的产后衍生细胞具有以下项的所有鉴别特征:细胞类型UMB 022803(P7)(ATCC登录号PTA-6067)或细胞类型UMB 022803(P17)(ATCC登录号PTA-6068)。在另一个实施方案中,来源于胎盘组织的产后衍生细胞具有以下项的所有鉴别特征:细胞类型PLA 071003(P8)(ATCC登录号PTA-6074);细胞类型PLA 071003(P11)(ATCC登录号PTA-6075);或细胞类型PLA 071003(P16)(ATCC登录号PTA-6079)。
在某些实施方案中,产后衍生细胞在包括金属蛋白酶活性、粘液溶解活性和中性蛋白酶活性的一种或多种酶活性存在下分离。优选地,产后衍生细胞具有在培养中细胞传代时保持的正常核型。在优选的实施方案中,产后衍生细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90中的每一种。在一些实施方案中,产后衍生细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、以及HLA-A、B、C中的每一种。在优选的实施方案中,产后衍生细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD117。在一些实施方案中,产后衍生细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、或HLA-DR、DP、DQ,如由流式细胞术所检测。在一些实施方案中,细胞不表达hTERT或端粒酶。
在如上的实施方案中,细胞群为基本上同质的产后衍生细胞群。在一个具体的实施方案,群体为同质的产后衍生细胞群。在本发明的实施方案中,产后衍生细胞来源于基本上不含血的人脐带组织或胎盘组织。
在某些实施方案中,将如上所述产后衍生细胞群或由细胞群制得的条件培养基与如下至少一种其它细胞类型一起施用:星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经细胞、神经祖细胞、神经干细胞、视网膜上皮干细胞、角膜上皮干细胞、或其它多能干细胞或多潜能干细胞。在这些实施方案中,可将其它细胞类型与产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群制得的条件培养基同时地、在其之前、或之后施用。
同样,在这些及其它实施方案中,将如上所述产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群制得的条件培养基与如下至少一种其它试剂一起施用:眼部治疗药物、或另一种有益辅助剂,诸如抗炎剂、抗凋亡剂、抗氧化剂或生长因子。在这些实施方案中,可将其它试剂与产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群制得的条件培养基同时地、在其之前、或之后施用。
在本文所述各种实施方案中,将产后衍生细胞群(脐或胎盘)或产后衍生细胞所产生的条件培养基施用于眼,例如眼表面,或施用于眼内部或施用于眼附近的位置,例如眼后面。产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群制得的条件培养基可通过插管或从植入患者体内的眼内或眼附近的装置施用,或者可通过植入具有细胞群或条件培养基的基质或支架施用。
本发明的另一个方面的特征在于用于减少视网膜变性病症中感光细胞损失的组合物,该组合物包含有效减少感光细胞损失的量的祖细胞群或由祖细胞群制得的条件培养基。优选地,祖细胞为如上所述产后衍生细胞。更优选地,产后衍生细胞从如上所述基本上不含血的产后脐带或胎盘中分离。变性病症可为急性、慢性或进行性病症。
在某些实施方案中,以上组合物包括至少一种其它细胞类型,诸如星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经细胞、神经祖细胞、神经干细胞、视网膜上皮干细胞、角膜上皮干细胞、或其它多能干细胞或多潜能干细胞。在这些及其它实施方案中,组合物包含至少一种其它试剂,诸如用于治疗眼变性性病变的药物或其它有益辅助剂,例如抗炎剂、抗凋亡剂、抗氧化剂或生长因子。
在如上所述的实施方案中,组合物为药物组合物,该药物组合物还包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中,药物组合物被配制用于施用给眼表面。另选地,其可被配制用于施用至眼内部或眼附近(例如眼后面)。药物组合物可被配制为包含如上所述祖细胞或由祖细胞制得的条件培养基的基质或支架。
根据本发明的另一个方面,提供试剂盒用于治疗患有眼变性性病症的患者。试剂盒包含药学上可接受的载体、祖细胞或由祖细胞(例如从产后组织中分离的细胞,优选上述产后衍生细胞)产生的条件培养基,以及在治疗患者的方法使用试剂盒的说明书。试剂盒还可包含一种或多种附加组分,例如用于产生条件培养基的试剂和说明书,或者至少一种其它细胞类型的群体、或一种或多种用于治疗眼变性性病症的试剂。
本发明的另一个方面包括用于减少视网膜变性中感光细胞损失的方法,该方法包括将包含祖细胞群或由祖细胞群制得的条件培养基的组合物以有效减少感光细胞损失的量施用。优选地,祖细胞为产后衍生细胞,或者条件培养基由如本文所述的产后衍生细胞群制备。在本发明的实施方案中,产后衍生细胞从基本上不含血的脐带组织或胎盘组织中分离。在一个具体的实施方案中,产后衍生细胞或由产后衍生细胞群制得的条件培养基包含细胞群分泌的桥分子。产后衍生细胞分泌的或条件培养基中分泌的此类桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。
在一些实施方案中,本发明提供用于减少视网膜变性中感光细胞损失的方法,该方法包括将产后衍生细胞或由产后衍生细胞群制得的条件培养基以有效减少或防止感光细胞损失的量施用于眼。产后衍生细胞来源于基本上不含血的脐带组织或胎盘组织。在一些实施方案中,产后衍生细胞群是基本上同质的群体。在特定实施方案中,细胞群是同质的。
在本文所述的另一些方面,产后衍生细胞群(脐或胎盘)或由产后衍生细胞产生的条件培养基保护视网膜细胞免受氧化应激或氧化性损伤或者改善来自于氧化应激或氧化性损伤的视网膜损伤。在一个实施方案中,本发明为减少视网膜变性的方法,该方法包括将产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群产生的条件培养基以有效降低或免于氧化应激或损伤的量施用于眼。在本发明的实施方案中,产后衍生细胞从基本上不含血的脐带组织或胎盘组织中分离。在一些实施方案中,视网膜细胞和组织暴露于氧化应激或氧化性损伤。在本文实施方案中,视网膜细胞和组织是感光细胞或视网膜上皮,包括视网膜色素上皮(RPE)细胞。在本文实施方案中,氧化应激或氧化性损伤是高氧压、日光接触,包括慢性日光接触。
一个实施方案是减少视网膜变性中感光细胞损失的方法,该方法包括将产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群产生的条件培养基以有效降低或免于氧化应激或损伤的量施用于眼。在一些实施方案中,产后衍生细胞从基本上不含血的脐带组织或胎盘组织中分离。在一些实施方案中,视网膜细胞和组织暴露于氧化应激或氧化性损伤。在本文实施方案中,视网膜细胞和组织是感光细胞或视网膜上皮,包括视网膜色素上皮(RPE)细胞。在本文实施方案中,氧化应激或氧化性损伤选自高氧压、日光接触(包括慢性日光接触)、自由基应激、光致氧化和光照诱导的损伤。
在一个实施方案中,本发明为用于减少视网膜变性中感光细胞损失的方法,该方法包括将产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群产生的条件培养基以有效减少或防止感光细胞损失的量施用,其中所述细胞群从基本上不含血的产后组织中分离,并且其中所述细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少一种神经表型的细胞的潜力,在传代时保持正常核型,并且具有以下特征:
a)在培养中40次群体倍增的潜力;
b)产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;以及
c)不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141;以及
其中产后衍生细胞群分泌桥分子,其中由产后衍生细胞群制得的条件培养基包含细胞群分泌的桥分子。在一些实施方案中,由产后衍生细胞分泌的桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。在一些实施方案中,细胞群是基本上同质的群体。在特定实施方案中,细胞群是同质的。产后衍生细胞为脐带组织衍生的细胞或胎盘组织衍生的细胞。在一个实施方案中,脐带组织衍生的细胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1。在一些实施方案中,脐带组织衍生的细胞群不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF,如由ELISA所检测。在另一个实施方案中,胎盘组织衍生的细胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1。在一些实施方案中,胎盘组织衍生的细胞群不分泌TGF-β2、MIPlb、ANG2、PDGFbb、FGF和VEGF,如由ELISA所检测。在一些实施方案中,脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞对HLA-A、B、C呈阳性,并且对HLA-DR、DP、DQ呈阴性。在另一个实施方案中,脐衍生的细胞不表达hTERT或端粒酶。
在一个实施方案中,本发明为用于减少视网膜变性中感光细胞损失的方法,该方法包括将产后衍生细胞群或由产后衍生细胞群制得的条件培养基以有效减少感光细胞损失的量施用,其中所述细胞群从基本上不含血的人脐带组织中分离,并且其中所述细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少一种神经表型的细胞的潜力,在传代时保持正常核型,并且具有以下特征:
a)在培养中40次群体倍增的潜力;
b)产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;
c)不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141;以及
d)相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码白介素8和浆膜蛋白1的基因表达增加,并且
其中产后衍生细胞群分泌桥分子,或者其中由产后衍生细胞群制得的条件培养基包含细胞群分泌的桥分子。在一些实施方案中,产后衍生细胞群分泌的桥分子,或者产后衍生细胞群在条件培养基中分泌的桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。在一些实施方案中,细胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1。在一些实施方案中,细胞群不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF,如由ELISA所检测。在一些实施方案中,细胞群对HLA-A、B、C呈阳性,并且对HLA-DR、DP、DQ呈阴性。在一些实施方案中,细胞群是基本上同质的群体。在特定实施方案中,细胞群是同质的。此外,细胞群不表达hTERT或端粒酶。
在某些实施方案中,本发明提供用于减少视网膜变性中感光细胞损失的方法,该方法包括将脐衍生细胞群或由脐衍生细胞群制得的条件培养基以有效减少或防止感光细胞损失的量施用,其中所述细胞群从基本上不含血的人脐带组织中分离,并且其中所述细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少一种神经表型的细胞的潜力,并且具有以下特征:
a.在培养中40次群体倍增的潜力;
b.产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;以及
c.相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码白介素8和浆膜蛋白1的基因表达增加,并且
产后衍生细胞群分泌桥分子,其中由产后衍生细胞群制得的条件培养基包含细胞群分泌的桥分子。在一些实施方案中,产后衍生细胞群分泌的桥分子,或者条件培养基中分泌的桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。在一些实施方案中,细胞不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141并对它们呈阴性。在一个实施方案中,脐带组织衍生的细胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1,并且不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF,如由ELISA所检测。在一些实施方案中,脐衍生细胞群对HLA-A、B、C呈阳性,并且对HLA-DR、DP、DQ呈阴性。此外,细胞群不表达hTERT或端粒酶。在一些实施方案中,细胞群是基本上同质的群体。在特定实施方案中,细胞群是同质的。
本发明的另一个方面是制备条件培养基的方法,所述方法包括培养细胞群,其中所述条件培养基包含细胞群分泌的桥分子。在本发明的一个实施方案中,桥分子由条件培养基中的细胞群分泌。在另一个实施方案中,桥分子选自MFG-E8、Gas6、血小板反应蛋白(TSP)-1和TSP-2。在本发明的实施方案中,细胞是祖细胞。在本发明的特定实施方案中,细胞是产后衍生细胞。在本发明的实施方案中,产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织或胎盘组织中分离。
在如上所述的本发明实施方案中,产后衍生细胞群具有如下特征:在经包被或未经包被的组织培养容器上贴附和扩增,其中经包被的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的被覆物;产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白;并且对HLA-A、B、C呈阳性且对HLA-DR、DP、DQ呈阴性。
在如上所述的本发明实施方案中,视网膜变性、视网膜病变或视网膜/黄斑病变为年龄相关性黄斑变性。在一个另选实施方案中,视网膜变性、视网膜病变或视网膜/黄斑病变为干性年龄相关性黄斑变性。
在如上所述的本发明实施方案中,感光细胞的损失通过抑制感光细胞的凋亡来减少或防止。在一些实施方案中,感光细胞的损失通过刺激脱落的感光细胞片段的吞噬来减少或防止。
附图说明
图1A-1B示出在含血清的hUTC CM1制剂中预孵育对营养不良RPE吞噬作用的影响。图1A.将着色的营养不良RPE用CM1制剂(含有血清)预孵育。就对照而言,将棕褐色盔状正常和着色的RPE用对照培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))预孵育。孵育时间为16小时。(tan N:棕褐色盔状正常RPE;pig D:着色的营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基;w:含有)。值为一个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=11或12;n:所计数的视野数);相对于pig D对照p<0.05。图1B.将营养不良RPE用CM1(含有血清)预孵育。就对照而言,将正常和营养不良RPE在含血清的对照培养基中预孵育。孵育时间为24小时。(N:正常RPE;D:营养不良RPE;D(1):一式三份的第1份;D(2):一式三份的第2份;D(3):一式三份的第3份;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基;w:含有)。值为一个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=11、12或13;n:所计数的视野数)。相对于D对照p<0.05。
图2示出在无血清的hUTC CM1制剂中预孵育对营养不良RPE吞噬作用的影响。将着色的营养不良RPE用CM1(无血清)预孵育。就对照而言,将棕褐色盔状正常和着色的营养不良RPE在无血清的对照培养基中预孵育。孵育时间为24小时。(tan N:棕褐色盔状正常RPE;pig D:着色的营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基;wo:无)。值为一个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=9、10、11或12;n:所计数的视野数);相对于pig D对照p<0.05。
图3A-3D示出在hUTC CM中预孵育对吞噬作用的影响。(图3A)在hUTC CM2中预孵育对吞噬作用的影响将着色的营养不良RPE用CM2预孵育。就对照而言,将棕褐色盔状正常和着色的营养不良RPE在对照培养基中预孵育。孵育时间为24小时。(tan N:棕褐色盔状正常RPE;pig D:着色的营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=8或10;n:所计数的视野数)。(图3B-3D)在hUTC CM3中预孵育对吞噬作用的影响将营养不良RPE用CM3预孵育。就对照而言,将正常和营养不良RPE在对照培养基中预孵育。孵育时间为24小时。图3B(N:正常RPE;D:营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一式三份样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=5-12;n:所计数的视野数);相对于D+con M对照p<0.05。图3C正常RPE对照来自于CM3测试1。(N:正常RPE;D:营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=11或14;n:所计数的视野数);相对于D+con M对照p<0.05。图3D(N:正常RPE;N1:得自培养物的正常RPE;N2:得自N2培养物的正常RPE;tan N:棕褐色盔状正常RPE;D:营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=12或13;n:所计数的视野数);相对于D+con M对照p<0.05。
图4A-4C示出hUTC对体外RCS RPE细胞中吞噬作用的影响。将RCS RPE细胞与跨孔中铺板的hUTC共培养(图13E)或用hUTC CM孵育(图13F)24小时并然后经受吞噬测定。N:正常RPE;D:营养不良RCS RPE;CM:条件培养基。在与hUTC共培养或用hUTC CM孵育的RCS RPE中,观察到吞噬增加。(图13G)将感光细胞OS用hUTC CM孵育24小时后喂饲给RCS RPE细胞以在不存在hUTC CM时进行吞噬测定。RCS RPE对经hUTC CM-处理的OS的吞噬得到恢复。数据表示平均值±SEM(n=3)。****p<0.0001。
图5A-5B示出对BDNF或HB-EGF而言RTK配体的测定结果。将营养不良RPE细胞用含BDNF(200ng/ml)(图5A)或HB-EGF(200ng/ml)(图5B)的MEM+5%FBS(MEM5)孵育24h。就阳性对照而言,将营养不良RPE细胞在CM3中孵育24h。就其它对照而言,将正常和营养不良RPE在MEM5中孵育24h并经受吞噬测定。(N:正常RPE;D:营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一式两份或一式三份样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=10、11或12;n:所计数的视野数);相对于D对照p<0.05。
图6A-6E示出对PDGF-DD、肝配蛋白A4和HGF而言RTK配体的测定结果。将营养不良RPE细胞用含PDGF-DD(图6A,6B)、肝配蛋白A4(图6C)或HGF(200ng/ml)(图6D,6E)的MEM5孵育24h,接着在将ROS添加至包含PDGF-DD、肝配蛋白A4或HGF的MEM5的情况下使其经受吞噬测定(在添加ROS时不更换培养基)。就阳性对照而言,将营养不良RPE细胞在CM3中孵育24h。就其它对照而言,将正常和营养不良RPE在MEM5中孵育24h并经受吞噬测定。(N:正常RPE;D:营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一式两份或一式三份样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=10、11或12;n:所计数的视野数);相对于D对照p<0.05。
图7A-7B示出对肝配蛋白B2而言RTK配体的测定结果。将营养不良RPE细胞用肝配蛋白B2(200ng/ml)孵育。就阳性对照而言,将营养不良RPE细胞在CM3中孵育。就其它对照而言,将正常和营养不良RPE在MEM5中孵育24h并经受吞噬测定。(N:正常RPE;D:营养不良RPE;con:对照;M:培养基;CM:条件培养基)。值为一式两份或一式三份样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=10、11或12;n:所计数的视野数);相对于D对照p<0.05。
图8A-8C示出用内皮素-1、TGF-β1或IL-6处理的营养不良RPE细胞。(图8A)相比于正常对照,针对吞噬作用测定内皮素-1或TGF-β1(200ng/mL)。(图8B,8C)将营养不良RPE细胞用200ng/mL的重组人内皮素-1、TGF-β1或IL-6孵育并测定吞噬作用。将hUTC CM3用作阳性对照。就其它对照而言,将正常和营养不良RPE在MEM5中孵育24h并经受吞噬测定。(N:正常RPE;D:营养不良RPE)。值为每个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=10;n:所计数的视野数)。
图9示出用经各种浓度的玻连蛋白预温育的ROS喂养营养不良RPE细胞连同正常对照并测定吞噬作用。将ROS用对照培养基(DMEM+10%FBS)或CM3预温育。平行地,将ROS在具有各种浓度的人重组玻连蛋白(4、2、1、0.5μg/ml)的MEM20中分别预温育。就对照而言,将单独的正常RPE或单独的营养不良RPE在MEM20中培养,然后在未经处理的ROS存在下(重悬于MEM20中并喂饲给RPE细胞)更换成MEM5以进行吞噬测定。(N:正常RPE;D:营养不良RPE;ConM:对照培养基;V:玻连蛋白)。值为每个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=10;n:所计数的视野数)。
图10示出hUTC中鉴定的RTK配体的基因表达水平。从hUTC中提取总mRNA并且进行RNA-Seq以鉴定和定量hUTC中的RTK配体基因表达。所鉴定的RTK配体基于对应的RTK亚族分类并根据其FPKM值分级。在hUTC中检测到15个RTK亚族的多个RTK配体的基因表达。
图11A-11G示出在hUTC CM中测量的所选RTK配体的水平。(图11A-11F)相比于得自NHDF和ARPE-19条件培养基的那些的RTK配体的水平。相比于NHDF和ARPE-19条件培养基,BDNF在hUTC条件培养基中以高水平分泌(图11A)。hUTC CM中NT3的水平相比于NHDF CM较高,而NT3的量在ARPE-19条件培养基和对照培养基中却检测不到(图11B)。相比于NHDF和ARPE-19条件培养基,HGF在hUTC CM中以高水平分泌(图11C)。相比于NHDF和ARPE-19条件培养基,PDGF-CC和PDGF-DD水平在hUTC条件培养基中较低(分别为图11D和图11E)。GDNF在hUTC和NHDF条件培养基中分泌,在ARPE-19条件培养基为痕量(图11F)。除NT3为一式两份样本的平均值±SD之外,所有值均为一式三份样本的平均值±SD。(图11G)由ELISA测量的RTK配体的水平。(所示数据为平均值±SEM;n=3)。
图12A-12E示出在hUTC CM中测量的桥分子的水平。(图12A-12E)相比于NHDF和ARPE-19条件培养基的桥分子水平。图12A示出hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基中的MFG-E8水平。值为一式两份或一式三份样本的平均值±SD。图12B示出hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基中的Gas6水平。值为一式两份样本的平均值±SD。图12C示出hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基中的TSP-1水平。值为一式两份样本的平均值±SD。图12D示出hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基中的TSP-2水平。值为一式两份样本的平均值±SD。(图12E)由ELISA测量的桥分子水平。所示数据为平均值±SEM(对于TSP-1和TSP-2,n=2;对于所有MFG-E8,n=3)。
图13A-13C展示用hUTC条件培养基(CM)预孵育营养不良RPE细胞对吞噬作用的影响。就对照而言,将单独的正常RPE或单独的营养不良RPE在其常规生长培养基MEM20(MEM+20%FBS)中预孵育。平行地,也将营养不良RPE用CM3预孵育。此外,测试用hUTC CM3预温育的ROS。值为每个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD。图13A,每个样本n=10-20;图13B为原始数据。图13C,每个样本n=12并且每种样本一式两份(n:所计数的视野数);图13D为原始数据。
图14A-14D示出桥分子和PTK配体对RCS RPE细胞吞噬视杆细胞外节盘膜(ROS)的影响。将ROS用对照培养基(DMEM+10%FBS)或hUTC条件培养基预温育。平行地,将ROS在具有各种浓度的人重组MFG-E8(图14A)、Gas6(图14B)、TSP-1(图14C)或TSP-2(图14D)的对照培养基中预温育。就对照而言,培养单独的正常RPE或单独的营养不良RPE以进行吞噬测定。(N:正常RPE;N+ROS:在吞噬测定期间用未经处理的ROS喂养的正常RPE细胞;D:营养不良RPE细胞;D+ROS:在吞噬测定期间用未经处理的ROS喂养的营养不良RPE细胞;Con M:对照培养基;D+ROS+Con:用经对照培养基预温育的ROS喂养的营养不良RPE细胞;CM4:第4批hUTC条件培养基)。D+ROS+CM4:用经CM4预温育的ROS喂养的营养不良RPE细胞;D+ROS+MFG-E8:用经MFG-E8预温育的ROS喂养的营养不良RPE细胞。值为每个样本的计数视野中被吞噬的ROS数的平均值±SD(每个样本n=10;n:所计数的视野数)。*P<0.001,经MFG-E8、Gas6、TSP-1或TSP-2预处理的D+ROS相对于D+ROS+ConM和D+ROS;**P<0.0001,D+ROS+CM4相对于D+ROS和D+ROS+ConM。(图14E-14H)将感光细胞OS用重组人MFG-E8(图14E)、Gas6(图14F)、TSP-1(图14G)或TSP-2(图14H)温育24小时并然后喂饲给RCS RPE细胞以在不存在CM时进行吞噬测定。将用hUTC CM预温育的OS用作测定的阳性对照。RCS RPE细胞对OS的吞噬以剂量依赖方式通过MFG-E8、Gas6、TSP-1或TSP-2拯救。(图14I-14K)将RCS RPE用重组人BDNF(图14I)、HGF(图14J)或GDNF(图14K)孵育24小时,然后经受吞噬测定。将用hUTC CM温育的RCS RPE用作测定的阳性对照。BDNF、HGF或GDNF剂量依赖性地增加RCS RPE细胞的吞噬。数据表示平均值±SEM(n=3)。****p<0.0001,***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05,n.s.不显著。
图15A-15C.RCS RPE中用于hUTC-介导的吞噬拯救的RTK配体和桥分子。(图15A)从未转染的hUTC和经siRNA转染的hUTC收集的细胞培养上层清液的ELISA。(图15B)RTK配体BDNF、HGF和GDNF的表达通过hUTC的siRNA转染而沉默。收获得到敲低(Knockdown,KD)的hUTC CM。将RCS RPE用KDhUTC CM孵育24小时并然后经受吞噬测定。hUTC对RCS RPE吞噬作用的影响在BDNF、HGF或GDNF敲低时消除。(图15C)桥分子MFG-E8、TSP-1和TSP-2的表达在hUTC中通过siRNA转染沉默。收获得到KDhUTC CM。将RCS RPE用经KDhUTC CM预温育24小时的OS喂养并经受吞噬测定。MFG-E8、TSP-1或TSP-2的敲低降低了RCS RPE中hUTC-介导的吞噬拯救。将由未转染的hUTC和混杂siRNA转染的hUTC制得的CM用作对照。数据表示平均值±SEM,对于(B)和(C),n=3,对于未转染的、模拟或混杂siRNA转染的hUTC CM ELISA(A),n=6。****p<0.0001,***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05,n.s.不显著。
图16A-16D.hUTC-分泌的桥分子与感光细胞OS结合。将免疫荧光(IF)染色的OS用个体重组人MFG-E8(124ng/mL)、Gas6(8.75ng/mL)、TSP-1(1.2[tg/mL)或TSP-2(238ng/mL)(图16A)、或hUTC CM(图16B)或对照培养基(图16C)温育24小时,随后用Alexa Fluor 568缀合的抗视紫红质抗体对视紫红质和用Alexa Fluor 488缀合的抗-MFG-E8、抗-Gas6、抗-TSP-1、抗-TSP-2、小鼠IgG2A或小鼠IgG2B同种型对照抗体对桥分子进行双重IF染色。经视紫红质染色的OS微粒对于重组桥分子蛋白或hUTC CM中所存在的分泌桥分子中的每者也呈现正染。(图16D)抗视紫红质抗体的特异性通过用Alexa Fluor 568缀合的抗视紫红质抗体和Alexa Fluor 488缀合的小鼠IgG2b、x同种型对照抗体对OS进行双重IF染色加以证实。上部图形(图16A-16D),桥分子和同种型抗体染色;下部图形(图16A-16D),视紫红质抗体染色。
图17A-17F示出hUTC和hUTC条件培养基免受氧化应激或损伤。图17A-17B示出hUTC条件培养基防止含A2E的RPE细胞在430nm辐射之后无生存力。(图17A)使用双色荧光测定来测定细胞死亡。将hUTC条件培养基和非条件对照培养基(250μL/孔)与载有A2E的ARPE-19细胞一起温育7天。非存活细胞的百分比通过双色荧光测定进行测定;平行测定5次。图17B示出得自5%和10%FBS处理的合并的数据。数值为平均值+/-SEMp<0.05;单因素方差分析和Newman Keuls多重比较测试。图17C-17D示出hUTC条件培养基保护ARPE-19细胞免于与A2E光致氧化相关的降低的细胞生存力。(图17C)通过MTT来分析细胞生存力。将hUTC条件培养基和非条件对照培养基(250μL/孔)与载有A2E的ARPE-19细胞一起温育(7天,37℃,5%CO2,5%FBS)。柱条高度表示MTT吸光度并反映细胞生存力。图17D示出得自5%和10%FBS处理的合并的数据。数值为平均值+/-SEM;4次平行测定/2个实验。*p>0.05;**p<0.05;单因素方差分析和Newman Keuls多重比较测试。图17E-17F示出hUTC条件培养基保护ARPE-19细胞免于与急性H2O2相关的降低的细胞生存力。通过MTT(图17E)和结晶紫(图17D)测定细胞生存力。y轴表示550nm处校正过的OD读数。数据表示为平均值±标准偏差。p<0.05(通过双因素方差分析)。
本发明的其它特征和优点由下述具体实施方式和实施例将是显而易见的。
具体实施方式
贯穿整个说明书参考了各种专利和其它出版物。这些出版物各自全文以引用方式并入本文。在例示性实施方案的下述详述中,参考构成其一部分的附图。这些实施方案充分详细地进行描述,以允许本领域技术人员实践本发明,并且应当理解可利用其它实施方案,并且可作出逻辑结构、机械、电和化学变化,而不背离本发明的实质或范围。为了避免对于允许本领域技术人员实践本文描述的实施方案不必要的细节,描述可省略本领域技术人员已知的某些信息。因此,接下来的详述不应被理解为限制性意义的,并且例示性实施方案的范围仅由所附的权利要求界定。
定义
贯穿整个说明书和权利要求所用的各种术语均按下文所述定义并且旨在阐明本发明。
干细胞是由单细胞自我更新和分化以产生后代细胞的能力定义的未分化细胞,包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征:从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力,以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
根据干细胞的发育潜力,将它们分类为:(1)全能;(2)多能;(3)多潜能;(4)寡能;和(5)单能。全能细胞能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够产生所有胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系的子类,但是均处于特定组织、器官或生理学***内(例如,造血干细胞(HSC)可以产生子代,所述子代包括HSC(自我更新)、血液细胞限制性寡能祖细胞和作为血液正常组分的全部细胞类型和要素(例如,血小板))的那些;寡能细胞能够产生比多潜能干细胞更加局限的细胞谱系子类;单能细胞能够产生单个细胞谱系(例如生精干细胞)。
也基于干细胞可获得的来源而将它们分类。成体干细胞一般为在包含多个分化细胞类型的组织中发现的多潜能未分化细胞。成体干细胞可自我更新。在正常情况下,它也可分化产生特化的组织细胞类型(其起源于该组织),并且可能产生其它组织类型。诱导多能干细胞(iPS细胞)是转化成多能干细胞的成体细胞(Takahashi等人,Cell,2006;126(4):663-676;Takahashi等人,Cell,2007;131:1-12)。胚胎干细胞是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多能细胞。胎儿干细胞是源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上起源于可在分娩后得到的胚胎外组织(亦即胎盘和脐带)的多潜能或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞的特征特性,包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜力。产后干细胞可为血液衍生的(如,从脐带血液获得的那些)或非血液衍生的(如,从脐带和胎盘的非血液组织获得的)。
胚胎组织通常定义为起源于胚胎的组织(在人中是指受精至发育约六周的时期)。胎儿组织是指起源于胎儿的组织(在人中是指发育约六周至分娩的时期)。胚胎外组织为与胚胎或胎儿相关但不起源于它们的组织。胚胎外组织包括胚外膜(绒毛膜、羊膜、卵黄囊和尿膜)、脐带和胎盘(其自身由绒毛膜和母体的底蜕膜形成)。
“分化”是非特化的(“未定向的”)或较少特化的细胞通过其获得特化的细胞(诸如神经细胞或肌肉细胞)特征的过程。分化的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”,当应用到分化的过程时,是指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞:在正常情况下,它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子类,并且在正常情况下不能分化成不同细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞谱系中特化(或定向)不足的位置的过程。如本文所用,细胞谱系定义细胞的遗传性,即源于何种细胞以及会产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。
在广义上,祖细胞是具有产生比其自身分化程度更高的后代的能力,然而保持补充祖细胞数目能力的细胞。根据此定义,因为干细胞是终末分化细胞的更直接前体,故其本身也是祖细胞。在提及本发明的细胞(如下文更详细地描述)时,可使用该祖细胞的广义定义。在狭义上,祖细胞通常定义为在分化途径中间(即,其起于干细胞)并且在成熟细胞类型或细胞类型子类生产中间的细胞。该祖细胞类型一般不能够自我更新。因此,如果本文涉及该细胞类型,其将被称为非更新的祖细胞或中间祖细胞或前体细胞。
如本文所用,短语“分化成眼部谱系或表型”是指变得部分或完全定向于特定眼部表型的细胞,无限制地包括视网膜和角膜干细胞、视网膜和虹膜的色素上皮细胞、感光细胞、视网膜神经节及其它视觉神经谱系(例如,视网膜神经胶质、小神经胶质细胞、星形胶质细胞、Mueller细胞)、形成晶状体的细胞、以及巩膜、角膜、角膜缘和结膜的上皮细胞。短语“分化成神经谱系或表型”是指变得部分或完全定向于CNS或PNS的特定神经表型的细胞,即神经细胞或神经胶质细胞,后一类无限制地包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经膜细胞和小神经胶质细胞。
本文例示和本发明优选使用的细胞通常被称为产后衍生细胞(或PPDC)。其有时也可被更具体地称为脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞(UDC或PDC)。此外,所述细胞可被描述为干细胞或祖细胞,后面的术语在广义中使用。术语“衍生的”用于指示细胞已从其生物来源获得并且在体外生长或以其它方式处理(例如,在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系)。脐干细胞和胎盘干细胞的体外操作和本发明的脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞的独特特征于下文详细地描述。也认为通过其它方式从产后胎盘和脐分离的细胞适用本发明。这些其它细胞在本文被称为产后细胞(而非产后衍生细胞)。
多个术语用于描述培养中的细胞。“细胞培养”一般指从活生物体取得并在受控条件下生长(“在培养中”或“培养的”)的细胞。原代细胞培养是在第一继代培养之前培养从生物体直接取得的细胞、组织或器官。当在有利于细胞生长和/或***的条件下将它们放置在生长培养液中时,细胞会在培养中扩增,从而产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时,有时通过细胞数目翻倍所需的时间量来测量细胞增殖率。这被称为倍增时间。
细胞系是由原代细胞培养物的一个或多个继代培养形成的细胞群。每一轮传代培养都被称为传代。当继代培养细胞时,它们被称为已传代的。细胞的特定群体或细胞系,有时由它已被传代的次数来指称或表征。例如,一个已传代了十次的培养细胞群可以指P10培养物。首次培养物(即,在将细胞从组织分离后的第一次培养物)被指定为P0。在第一次传代培养后,细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。第二次传代培养后,细胞成为第三培养物(P2或第2代),以此类推。本领域技术人员会理解,在传代期间可能有许多次群体倍增;因此培养物的群体倍增数目大于传代数目。细胞在各次传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数目)取决于许多因素,包括但不限于接种密度、基底、培养基、生长条件和各次传代之间的时间。
术语生长培养基一般指足以培养PPDC的培养基。具体地,用于培养本发明的细胞的一个目前优选的培养基包括Dulbecco改良的必需培养基(本文另缩写为DMEM)。特别优选的是DMEM-低葡萄糖(本文也为DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。DMEM-低葡萄糖优选地补充有15%(v/v)胎牛血清(例如,特级胎牛血清,Hyclone,Logan Utah)、抗生素/抗真菌剂((优选50-100单位/毫升青霉素,50-100微克/毫升链霉素和0-0.25微克/毫升两性霉素B;Invitrogen,Carlsbad,Calif.))和0.001%(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.LouisMo.)。如下文实施例中所用,生长培养基是指含有15%胎牛血清和抗生素/抗真菌剂(当包括青霉素/链霉素时,分别优选50U/ml和50微克/ml;当使用青霉素/链霉素/两性霉素时,分别优选100U/ml、100微克/ml和0.25微克/ml)的DMEM-低葡萄糖。在一些情况下,使用不同的生长培养液,或提供不同的补充物,并且这在文中通常表明向生长培养液添加补充物。
条件培养液是已在其中培养特定的细胞或细胞群,然后被去除的培养液。当在培养基中培养细胞时,它们可分泌细胞的因子,所述细胞的因子可向其它细胞提供营养支持。此类营养因子包括但不限于激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒。包含所述细胞的因子的培养基是条件培养基。
一般来讲,营养因子定义为促进细胞存活、生长、分化、增殖和/或成熟,或刺激细胞活性提高的物质。细胞间经由营养因子的相互作用可发生于不同类型的细胞之间。细胞经由营养因子的相互作用基本上存在于所有的细胞类型中,并且是神经细胞类型中尤为显著的通讯方式。营养因子还可以自分泌方式发挥作用,即,细胞可产生影响其自身存活、生长、分化、增殖和/或成熟的营养因子。
当提及培养的脊椎动物细胞时,术语衰老(也为复制性衰老或细胞衰老)是指可归于有限细胞培养物的性质;换言之,其不能生长超出有限的群体倍增数(有时也称为Hayflick极限)。尽管首先使用成纤维细胞样细胞来描述细胞衰老,可在培养中连续生长的大多数正常人细胞类型经历细胞衰老。不同细胞类型在体外的生命周期不同,但最大生命周期通常少于100次群体倍增(这是针对培养物中所有细胞变衰老且因此不能分离培养物的倍增数)。衰老不取决于时序时间,而是由培养物已经历的细胞***、或群体倍增数来衡量。
术语眼部、眼科和视觉在本文互换使用以定义“眼的、或关于眼、或与眼有关”。术语眼变性性病症(或病变)是包含性术语,涵盖眼部急性和慢性病症、疾病或病变,包括眼部和脑部之间的神经连接,涉及细胞损伤、变性或损失。眼变性性病症可为年龄相关的,或者其可由损伤或创伤引起,或者其可与特定疾病或病变有关。急性眼变性性病症包括但不限于影响眼的与细胞死亡或损害相关的病症,包括由脑血管机能不全、局灶性或弥漫性脑创伤、弥漫性脑损伤、眼部感染或炎性病症、视网膜撕裂或脱离、眼内病变(挫伤穿入、压迫、裂伤)或其它身体损伤(例如,物理或化学灼伤)引起的病症。慢性眼变性性病症(包括进行性病症)包括但不限于视网膜病及其它视网膜/黄斑病变,诸如色素性视网膜炎(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管膜(CNVM);视网膜病,诸如糖尿病性视网膜病变、阻塞性视网膜病、镰状红细胞性视网膜病变和高血压性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、颈动脉狭窄、视神经病变诸如青光眼和相关综合征;晶状体和外眼病变,例如角膜缘干细胞缺损(LSCD),也称为缘上皮细胞缺陷(LECD),诸如发生于化学或热损伤,Steven-Johnson综合症、接触镜片诱导的角膜病、眼部瘢痕性类天庖疮、无虹膜或外胚层发育不良先天性疾病、以及多发性内分泌缺乏相关的角膜炎。
术语治疗(或治疗的)眼变性性病症是指改善如本文所定义的眼变性性病症的影响,或延迟、停止或逆转眼变性性病症的进展、或延迟或预防眼变性性病症的发作。
术语有效量是指对产生预期结果有效的试剂或药物组合物诸如生长因子、分化剂、营养因子、细胞群或其它试剂的浓度或量,所述预期结果包括细胞在体外或体内的生长和/或分化,或治疗如本文所述的眼变性性病症。就生长因子而言,有效量可在约1纳克/毫升至约1微克/毫升的范围内。就如施用于患者体内的PPDC而言,有效量可在少至几百或更少至多达几百万或更多的范围内。在特定的实施方案中,有效量可在103至1111的范围内,更具体地,至少约104个细胞。应当理解,施用的细胞数量将根椐将要治疗的失调的特性改变,在医学生物学家熟悉的其它因素中,所述特性包括但不限于将要治疗的范围或总体积/表面积、以及施用至将要治疗的区域的位置部位近侧。
术语有效期(或时间)和有效条件是指为实现预期效果的一段时间或其它可控条件(如针对体外方法的温度、湿度)、必要的或优选的药剂或药物组合物。
术语患者或受治疗者是指用药物组合物或根据本文所述方法治疗的动物,包括哺乳动物,优选人。
术语药学上可接受的载体(或介质)可与术语生物相容性载体或介质互换使用,是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型,它们不仅与将要治疗施用的细胞和其它药剂相容,而且适于在合理医学判断范围内以与合理效/险比相当量与人和动物的组织接触使用时无过度毒性、刺激、过敏反应或其它并发症。
关于细胞替代疗法,本文使用了几个术语。术语自体转移、自体移植、自体移接等等指其中细胞供体也是细胞替代疗法的受体的治疗。术语异体转移、异体移植、异体移接等是指其中细胞供体与细胞替代疗法受体的物种相同,但并非同一个体的治疗。在其中供体的细胞和已与受体组织相容性匹配的细胞移植有时被称为同基因转移。术语异种转移、异种移植、异种移接等等指其中细胞供体与细胞替代疗法受体的物种不同的治疗。如本文所用,移植是指将自体、或异体供体细胞替代疗法引入受体中。
如本文所用,术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等等时,意指涵盖与指定值±20%和±0.1%,优选±20%或±10%,更优选地±5%,甚至更优选地±1%,还更优选地±0.1%的变化,因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。
描述
眼变性性病症涵盖具有不同病因的急性、慢性和进行性病变和疾病,作为共同特征具有眼部细胞的特定或易损群体的功能障碍或损失。该共性允许开发出用于修复或再生易损、受损或损失眼部组织的类似治疗方法,其中之一为基于细胞的治疗。所开发的用于眼变性性病症的细胞治疗受限于相对较少类型的干细胞或祖细胞,包括眼自身衍生的干细胞(例如,视网膜和角膜干细胞)、胚胎干细胞和少数类型的成体干细胞或祖细胞(例如,神经、粘膜上皮和骨髓干细胞)。出于该目的,从产后脐带和胎盘中分离的细胞已被鉴定为祖细胞的重要新来源(US 2005-0037491和US 2010-0272803)。此外,由产后胎盘和脐带组织中分离的细胞产生的条件培养基为治疗眼变性性病症提供另一种新来源。因此,在本文所述的各种实施方案中,本发明的特征在于用于修复和再生眼部组织的方法和组合物(包括药物组合物),其使用得自产后组织中所分离的祖细胞和细胞群的条件培养基。本发明适用于眼变性性病症,但预期特别适用于难以或无法实现治疗或治愈的多种眼部病变。这些无限制地包括年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、糖尿病及其它视网膜病。
预期根据在本领域中已知的任何方法的来源于祖细胞(例如从产后脐带或胎盘中分离的细胞)的条件培养基适用于本发明。然而,在一个实施方案中,本发明优选地根据以下所列方法使用来源于如上定义的脐带组织衍生的细胞(hUTC)或胎盘组织衍生的细胞(PDC)的条件培养基,所述细胞来源于显示基本上不含血的脐带组织或胎盘。hUTC或PDC能够在培养中扩增并具有分化成其它表型的细胞的潜力。某些实施方案的特征在于由此类祖细胞制得的条件培养基,包含条件培养基的组合物,以及使用诸如药物组合物的组合物治疗患有急性或慢性眼变性性病症的患者的方法。本发明的产后衍生细胞特征在于:其在培养中的生长特性,其细胞表面标志物,其基因表达,其产生某些生化营养因子的能力,以及其免疫学特性。来源于产后衍生细胞的条件培养基的特征在于细胞分泌的营养因子和桥分子。
祖细胞的制备
本文描述了在本发明的组合物和方法中使用的细胞、细胞群和制剂(包含细胞裂解液、条件培养基等等),并且详见于美国专利7,524,489和7,510,873以及美国公布申请2005/0058634,二者均以引用方式并入本文。根据方法,哺乳动物脐带和胎盘是在足月或者早产妊娠时或不久之后(例如,分娩后排出之后)回收的。产后组织可在无菌容器(诸如烧瓶、烧杯、培养皿或袋)中从分娩地点运输到实验室。该容器可具有溶液或培养基,包括但不限于例如盐溶液,诸如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或磷酸盐缓冲盐水(PBS),或用于运输用于移植的器官的任何溶液,诸如威斯康星大学溶液(University of Wisconsinsolution)或全氟化合物溶液。可将一种或多种抗生素和/或抗真菌剂(诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素)添加到培养基或缓冲液中。可用抗凝剂溶液诸如含肝素溶液冲洗产后组织。优选在提取PPDC之前将组织保持在约4-10℃下。甚至更优选在提取PPDC之前,组织不进行冷冻。
PPDC的分离优选在无菌环境中发生。脐带可通过本领域已知的方法从胎盘分离。另选地,脐带和胎盘无需分离即可使用。血液和碎片优选在PPDC分离前从产后组织中去除。例如,可用缓冲液溶液(例如但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤产后组织。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌剂和/或抗生素,例如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
产后组织包括通过机械力分解的整个胎盘或脐带或其片段或部分(切断力或剪切力)。在目前优选的实施方案中,分离工序也利用酶消化过程。许多酶是本领域已知的用于从复合组织基质分离个体细胞以有利于在培养物中生长。涵盖弱消化的(例如脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)至强消化的(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)范围的此类酶可商购获得。与本文相容的酶的不详尽列表包括溶解粘液的酶活性材料、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和溶解粘液的活性材料的酶活性材料。例如,已知胶原酶用于从组织分离多种细胞。脱氧核糖核酸酶可消化单链DNA并且可在分离期间使细胞凝聚降到最低。优选的方法包括采用例如胶原酶和分散酶、或胶原酶、分散酶和透明质酸酶进行酶处理,并且提供在某些优选的实施方案中在分离步骤中使用胶原酶和中性蛋白酶分散酶的混合物的此类方法。更优选的是采用在来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)的至少一种胶原酶,和蛋白酶活性、分散酶和嗜热菌蛋白酶中的任一种的存在下的消化的那些方法。还更优选的方法是采用胶原酶和分散酶的酶活性两者进行消化。也优选包括利用除了胶原酶和分散酶活性之外的透明质酸酶活性消化的方法。技术人员将认识到,本领域已知用于从多种组织来源中分离细胞的多种此类酶处理。例如,LIBERASETM Blendzyme 3(Roche)系列酶组合适用于本发明方法。酶的其它来源是已知的,并且技术人员还可从它们天然来源直接获得此类酶。技术人员也拥有齐全的设备,可评价新的或附加的酶或酶组合在分离本发明细胞方面的用途。优选的酶处理为0.5、1、1.5或2小时长或更长。在其它优选的实施方案中,解离步骤的酶处理期间在37℃下温育组织。
在本发明的一些实施方案中,将产后组织分成包含组织的多个部分(例如诸如新生儿、新生儿/母体、以及胎盘的母体部分)的区段。然后,根据本文所述的方法通过机械和/或酶离解来离解分离的部分。新生儿或母体谱系细胞可通过本领域已知的任何方法(例如,通过针对Y染色体的核型分析或原位杂交)来鉴定。
分离的细胞或PPDC从其中长出的产后组织可用于引发、或接种细胞培养物。将分离的细胞转移到无菌组织培养容器中,所述无菌组织培养容器未包被或包被有细胞外基质或配体,诸如层粘连蛋白、胶原(天然、变性或交联)、明胶、纤粘蛋白和其它细胞外基质蛋白。将PPDC培养于能够维持细胞生长的任何培养基中,所述培养基例如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle基本培养基、Ham的F10培养基(F10)、Ham的F-12培养基(F12)、Iscove改良的Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和cellgro FREETM。培养基可补充有一种或多种单独或组合使用的组分,包括例如胎牛血清(FBS),优选约2-15%(v/v);马血清(ES);人血清(HS);β-巯基乙醇(BME或2-ME),优选约0.001%(v/v);一种或多种生长因子,例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、***-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和红细胞生成素;氨基酸,包括L-缬氨酸;以及一种或多种例如控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌剂,诸如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。培养基优选包含生长培养基(DMEM-低葡萄糖、血清、BME和抗生素)。
将细胞以允许细胞生长的密度接种在培养容器中。在一个优选的实施方案中,细胞在占空气约0至约5体积%的CO2下培养。在一些优选的实施方案中,细胞在占空气约2至约25%的O2下,优选占空气约5至约20%的O2下培养。细胞优选在约25至约40℃下培养,还更优选在37℃下培养。细胞优选在培养箱中培养。培养容器中的培养基可以是静止的,也可以例如用生物反应器搅动。PPDC优选在低氧化应激下生长(例如,伴随谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸的添加)。如本文所用,“低氧化应激”指对培养的细胞没有或有较小自由基损伤的条件。
用于选择最适当的培养基、培养基制剂和细胞培养技术的方法是本领域为人们所熟知的,并且在多种来源中描述,包括Doyle等人(编辑),1995,CELL&TISSUE CULTURE:LABORATORY PROCEDURES,John Wiley&Sons,Chichester;以及Ho和Wang(编辑),1991,ANIMAL CELL BIOREACTORS,Butterworth-Heinemann,Boston,所述参考文献以引用的方式并入本文。
在将分离的细胞或组织片段培养足够时间段后,PPDC将由于来自产后组织的迁移或细胞***或两者而长出。在本发明的一些实施方案中,将PPDC传代或取出至分开的培养容器中,所述培养容器含有与初始使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基,细胞群可在所述培养容器中以有丝***方式扩增。本发明的细胞可在0代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次,更优选传代约4至约12次,并且优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以确认已分离出无性细胞群。
在本发明的一些方面,将存在于产后组织中的不同细胞类型分级成可从其中分离PPDC的亚群。这可使用用于细胞分离的标准技术完成,包括但不限于使用酶处理将产后组织分解为其组分细胞然后克隆和选择特定细胞类型,例如但不限于基于形态标记和/或生化标记选择;选择生长的期望细胞(正选择),选择性破坏不需要的细胞(负选择);用例如大豆凝集素根据混合群中不同的细胞凝集性进行分离;冻融方法;利用混合群中的不同的细胞粘附性;过滤;常规离心和区带离心;离心淘析(逆流离心淘析);单位重力分离;逆流分布;电泳;以及荧光激活细胞分选(FACS)。关于克隆选择和细胞分离技术的综述,参见Freshney,1994,CULTURE OF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,第3版,Wiley-Liss,Inc.,New York,所述参考文献以引用方式并入本文。
更换培养液是必要的,例如,通过小心地从培养皿中抽出培养液(例如用移液器)并且补充新鲜培养液。继续温育直至培养皿中积聚足够数量或密度的细胞。可去除原始外植入组织部分,并且剩余细胞使用标准技术或使用细胞刮刀进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶化之后,收集细胞,移至新鲜培养基中并如上温育。在一些实施方案中,胰蛋白酶化后约24小时将培养基更换至少一次以去除任何漂浮的细胞。培养物中剩余的细胞视为PPDC。
可将PPDC冷冻保存。因此,在下文更详细地描述的优选实施方案中,用于自体转移(用于母亲或孩子)的PPDC可源于孩子出生后的适当产后组织,然后冷冻保存以便可在它们以后需要移植的情况下可用。
祖细胞的特征
本发明的祖细胞如PPDC的特征可在于例如生长特性(例如,群体倍增能力、倍增时间、传代至衰老)、染色体核型分析(例如,正常核型;母本或新生谱系)、流式细胞术(例如,FACS分析)、免疫组织化学法和/或免疫细胞化学法(例如,用于检测表位)、基因表达谱(例如,基因芯片阵列;聚合酶链反应(例如,逆转录PCR、实时PCR和常规PCR)、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如,通过血浆凝血测定或分析PDC-条件培养基,如通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如,作为刺激的PBMC的量度)和/或现有技术已知的其它方法。
来源于脐组织的PPDC的示例于2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC,10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110)并且被指定为如下ATCC登录号:(1)菌株名UMB 022803(P7)指定登录号PTA-6067;并且(2)菌株名UMB 022803(P17)指定登录号PTA-6068。来源于胎盘组织的PPDC的示例保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.)并且被指定为如下ATCC登录号:(1)菌株名PLA 071003(P8)保藏于2004年6月15日并指定登录号PTA-6074;(2)菌株名PLA 071003(P11)保藏于2004年6月15日并且指定登录号PTA-6075;并且(3)菌株名PLA 071003(P16)保藏于2004年6月16日并指定登录号PTA-6079。
在各种实施方案中,PPDC具有下列一个或多个生长特征:(1)其在培养中需要L-缬氨酸用于生长;(2)其能够在包含约5%至至少约20%氧气的气氛中生长;(3)在达到衰老之前,其在培养中具有至少约40次倍增的潜力;以及(4)其在经包被或未经包被的组织培养容器上贴附和扩增,其中经包被的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的被覆物。
在某些实施方案中,PPDC具有在细胞传代时保持的正常核型。染色体核型分析特别可用于从来源于胎盘的母本细胞鉴定和区分新生儿细胞。染色体核型分析的方法是本领域技术人员可利用且已知的。
在其它实施方案中,PPDC的特征可在于产生某些蛋白质,包括:(1)产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一种;以及(2)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-a、PD-L2和HLA-A、B、C细胞表面标志物中的至少一种,如由流式细胞术所检测。在其它实施方案中,PPDC的特征可在于不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ细胞表面标志物中的至少一种,如由流式细胞术所检测。特别优选的是产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的细胞。
在其它实施方案中,PPDC的特征可在于相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码以下项中至少一种的基因的基因表达是增加的:白介素8;浆膜蛋白1;或趋化因子(C--X--C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性,α);趋化因子(C--X--C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2);趋化因子(C--X--C基序)配体3;肿瘤坏死因子,α-诱导蛋白3;C-型凝集素超家族成员2;肾母细胞瘤1;乙醛脱氢酶1家族成员A2;肾素;氧化低密度脂蛋白受体1;智人克隆IMAGE:4179671;蛋白激酶Cζ;假定蛋白DKFZp564F013;在卵巢癌中下调的1;以及来自克隆DKFZp547k1113的智人基因。在一个实施方案中,来源于脐带组织的PPDC的特征可在于相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码以下项中至少一种的基因的基因表达是增加的:白介素8;浆膜蛋白1;或趋化因子(C--X--C基序)配体3。在另一个实施方案中,来源于胎盘组织的PPDC的特征可在于相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码肾素或氧化低密度脂蛋白受体1中至少一种的基因的基因表达是增加的。
在其它实施方案中,PPDC的特征可在于相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码以下项中至少一种的基因的基因表达是减少的:矮小同源盒2;热休克27kDa蛋白2;趋化因子(C--X--C基序)配体12(基质细胞衍生因子1);弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄,威廉斯-博伊伦综合征);智人mRNA;cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022);间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒);sine oculis 同源盒同源物1(果蝇属);晶状体蛋白,αB;形态发生紊乱关联激活因子2;DKFZP586B2420蛋白;类似于neuralin 1;四连接素(纤溶酶原结合蛋白);src同源三(SH3)和富含半胱氨酸的结构域;胆固醇25-羟化酶;runt相关转录因子3;白介素11受体,α;前胶原C-内肽酶增强子;卷曲同源物7(果蝇属);假定基因BC008967;胶原,VIII型,α1;腱生蛋白C(hexabrachion);易洛魁族同源盒蛋白5;膜铁转运辅助蛋白;整联蛋白,β8;突触小泡糖蛋白2;成神经细胞瘤,抑制瘤变蛋白1;***结合蛋白2,36kDa;智人cDNA FLJ12280fis,克隆MAMMA1001744;细胞因子受体样因子1;钾中间体/小电导钙活化通道,亚家族N,成员4;整联蛋白,β7;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);sine oculis同源盒同源物2(果蝇属);KIAAI034蛋白;囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白);含EGF腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1;早期生长反应因子3;远端缺失同源盒5;假定蛋白FLJ20373;醛酮还原酶家族1,成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶,II型);双糖链蛋白聚糖;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);纤粘蛋白1;前脑啡肽;整联蛋白,β样1(具有EGF样重复结构域);智人mRNA全长***cDNA克隆EUROIMAGE 1968422;EphA3;KIAA0367蛋白;尿钠***肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠***肽受体C);假定蛋白FLJ14054;智人mRNA;cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3样;AE结合蛋白1;以及细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉)。
在其它实施方案中,PPDC的特征可在于分泌选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2的桥分子。此外,来源于脐带组织的PPDC的特征可在于分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、RANTES、MDC和TIMP1中的至少一种。在一些实施方案中,来源于脐带组织的PPDC的特征可在于不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1a和VEGF中的至少一种,如由ELISA所检测。在另选的实施方案中,来源于脐带组织的PPDC的特征可在于:分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中的至少一种,以及不分泌TGF-β2、MIP1b、ANG2、PDGFbb、FGF和VEGF中的至少一种,如由ELISA所检测。在另一个实施方案中,PPDC不表达hTERT或端粒酶。
在优选的实施方案中,细胞具有上文列出的生长、蛋白质/表面标志物产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多种。更优选的是包含特征中的三种、四种、或五种或更多种的那些细胞。还更优选的是包含特征中的六种、七种、或八种或更多种的PPDC。目前还更优选的是包含上述特征中的所有的那些细胞。
在特别优选的实施方案中,细胞从基本上不含血的人脐带组织中分离,所述细胞能够在培养中扩增,不产生CD117或CD45,并且不表达hTERT或端粒酶。在一个实施方案中,该细胞不表达CD117和CD45,并且任选地也不表达hTERT和端粒酶。在另一个实施方案中,该细胞不表达hTERT和端粒酶。在另一个实施方案中,细胞从基本上不含血的人脐带组织中分离,能够在培养中扩增,不产生CD117或CD45,并且不表达hTERT或端粒酶,并且下列一种或多种特征:表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;不表达CD31或CD34;相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞,表达白介素8或浆膜蛋白1的水平提高;并且具有分化的潜力。
在目前优选与本发明多个方面一起使用的细胞中有具有上述特征的产后细胞,并且更具体地是这样的细胞:其中细胞具有正常核型并随传代进行,保持正常核型,并且进一步地,其中细胞表达标志物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种,其中细胞产生免疫学可检测的对应于所列标志物的蛋白质。还更优选的是这样的细胞:其除了前述之外,不产生对应于标志物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR、DP、DQ中的任何一种的蛋白,如由流式细胞术所检测。在另一个优选的实施方案中,细胞不表达hTERT或端粒酶。
某些具有沿产生各种表型的细胞谱系方向分化的潜力的细胞是不稳定的,并且因此可自发分化。目前本发明优选使用例如不沿神经谱系方向自发分化的细胞。当优选的细胞在生长培养基中生长时,对于它们表面上产生的细胞标志物而言,并且对于多种基因的表达模式而言,是基本上稳定的,例如,如使用Affymetrix GENECHIP测定。细胞在传代时,经历多次群体倍增后,例如在它们表面标志物特性方面仍然保持基本恒定。
然而,PPDC的一个特征在于可通过使其经受诱导分化的细胞培养条件而将其有意诱导分化成各种谱系表型。在用于治疗某些眼变性性病症中,可使用在本领域中已知的一种或多种方法将PPDC诱导分化成神经表型。例如,如本文举例说明,可将PPDC铺到经层粘连蛋白包被的***Neurobasal-A培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中,所述Neurobasal-A培养基包含B27(B27补充剂,Invitrogen)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素,该种组合在本文称为神经祖细胞扩增(NPE)培养基。NPE培养基可进一步补充有bFGF和/或EGF。另选地,可通过如下方式在体外诱导分化PPDC:(1)将PPDC与神经祖细胞共培养;或者(2)使PPDC在神经祖细胞条件培养基中生长。
PPDC分化成神经表型可由具有延伸突起的两极细胞形态示出。诱导的细胞群可对巢蛋白的存在呈染色阳性。分化的PPDC可通过检测巢蛋白、TuJ1(BIII微管蛋白)、GFAP、酪氨酸羟化酶、GABA,04和/或MBP进行评估。在一些实施方案中,PPDC表现出能够形成三维体特征的神经元干细胞形成神经球。
细胞群
本发明另一个方面的特征为祖细胞例如产后衍生细胞群。产后衍生细胞可从胎盘或脐组织中分离。在一个优选的实施方案中,细胞群包含上述PPDC,并且这些细胞群在下面部分有所描述。
在一些实施方案中,细胞群是异质的。本发明的异质细胞群可包含至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的细胞。本发明的异质细胞群还可包含祖细胞(产后衍生细胞)或其它祖细胞,诸如上皮或神经祖细胞,或者其还可包含完全分化的细胞。
在一些实施方案中,所述群体是基本上同质的,即基本上仅包含PPDC(优选至少约96%、97%、98%、99%或更多细胞)。在一些实施方案中,细胞群是同质的。在一个实施方案中,本发明的同质细胞群可包含脐或胎盘衍生的细胞。脐衍生的细胞的同质群体优选地不含母体谱系的细胞。胎盘衍生的细胞的同质群体可为新生儿或母体谱系。同质细胞群可通过本领域已知的任何方法实现,例如通过细胞分选(例如流式细胞术)或通过根据已知的方法的无性扩增。因此,优选的同质PPDC群体可包含产后衍生细胞的克隆细胞系。当分离具有高度期望功能的细胞克隆时,此类群体是特别有用的。
本文还提供了在一种或多种因子的存在下,或在刺激干细胞沿期望途径(例如神经、上皮)分化的条件下孵育的细胞群。此类因子是本领域已知的,并且技术人员将认识到合适的分化条件的确定可用常规实验实现。此类条件优化可通过统计实验设计和分析来实现,例如响应面分析法允许同时优化例如在生物培养中的多个变量。目前优选的因子包括但不限于因子诸如生长因子或营养因子、脱甲基化剂、与神经或上皮谱系细胞的共培养物或在神经或上皮谱系细胞条件培养基中的培养物、以及现有技术已知刺激干细胞沿这些途径分化的其它条件(用于神经分化的因子,参见例如Lang,K.J.D.等人,2004,J.Neurosci.Res.76:184-192;Johe,K.K.等人,1996,Genes Devel.10:3129-3140;Gottleib,D.,2002,Ann.Rev.Neurosci.25:381-407)。
条件培养基
在一个方面,本发明提供得自培养的祖细胞,诸如产后衍生细胞,或如下所述在体外或体内使用的其它祖细胞的条件培养基。使用此类条件培养基使得能在患者内异体地使用细胞分泌的有利营养因子而无需引入可能引起排斥反应或其它不良免疫学应答的完整细胞。可通过在培养基中培养细胞(例如细胞群),然后从培养基中移除细胞来制备条件培养基。在某些实施方案中,产后细胞为UTC或PDC,更优选hUTC。
由如上所述细胞群制备的条件培养基可按原样、进一步浓缩(例如通过超滤或冻干、或甚至干燥)、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其它化合物(诸如生物制品,例如药学上有用的蛋白组合物)组合来使用。条件培养液可单独在体外或体内或例如与自体或同种活细胞一起使用。如果在体内引入,可将条件培养液局部地引入到治疗部位处,或引入到治疗部位远侧以向患者提供例如所需的细胞生长或营养因子。
先前已展示人脐带组织衍生的细胞提高视觉功能并改善视网膜变性(参见US2010/0272803)。也已证明产后衍生细胞可用于促进感光细胞挽救并因而保留RCS模型中的感光细胞(参见US 2010/0272803)。hUTC经视网膜下注入RCS大鼠眼中提高视敏度并改善视网膜变性。
如本文所提供,制备hUTC条件培养基的各种制剂并评估吞噬拯救行为。已发现接种密度和培养条件影响条件培养基的活性水平。对于含血清hUTC(CM1),将hUTC以5,000个活细胞/cm2接种于T75细胞培养***hUTC生长培养基(DMEM低葡萄糖+15%FBS+4mM L-谷氨酰胺)中并培养24小时。将培养基替换为21mL的DMEM/F12完全培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml)),将细胞再培养54小时,收集培养上层清液并在-70℃下冷冻(冷冻保存)。
对于无血清培养基(无血清CM1),在第2天为培养基补充21mL的DMEM/F12无血清培养基(DMEM:F12培养基+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))。含有或不含血清的CM1恢复吞噬活性(图1A-1B和2)。另一种条件培养基(CM2)按与含血清CM1相同的过程制备,不同的是细胞在T225烧瓶中培养,每个***培养基为63mL,并且培养基更换之后的孵育时间为48小时。然而,该培养基不具有活性(图3A)。CM3采用与CM2相同的条件制备,但具有10,000个活细胞/cm2,并且刺激营养不良RPE的吞噬作用(图3B-3D)。
在测试的条件中,发现CM2没有活性(图3A)。相比于CM1的54小时孵育时间,CM2具有缩短的48h孵育时间。CM3通过将细胞接种密度加倍来制备,其具有相比于CM2相同的培养基更换后的孵育时间,并且发现呈活性。因此,为获得活性CM,初始细胞接种密度和培养基更换后的孵育时间是两个重要条件。
得自皇家外科医学院(RCS)大鼠的视网膜色素上皮细胞(RPE)因Mertk基因突变而使视杆细胞外节盘膜(ROS)的吞噬有缺陷。Mertk是受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员并且认为其在RPE吞噬中起作用。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(FGF RTK的配体)示出诱导得自RCS大鼠的培养RPE细胞的吞噬能力(McLaren等人,FEBS Letters,1997;412:21-29)。在本发明的一个实施方案中,hUTC通过分泌激活RTK信号转导并增强其它吞噬相关受体的信号转导的RTK配体来拯救营养不良RPE的吞噬作用。
在本发明的一个实施方案中,RTK配体BDNF、HB-EGF、PDGF-DD、肝配蛋白A4、HGF和肝配蛋白B2对RCS营养不良RPE细胞的吞噬具有拯救作用。在一个具体实施方案中,BDNF、PDGF-DD和肝配蛋白B2具有积极拯救作用(参见图5A,6A-6B和7A-7B)。
非-RTK配体激活RTK的不同受体,并且不具有与RTK配体类似的对吞噬作用的影响(图8A-8C和图9)。已示出hUTC分泌玻连蛋白、内皮素-1、TGF-β1和IL-6。玻连蛋白的受体包括αvβ3和αvβ5整联蛋白。Finnemann等人报道RPE细胞对ROS的吞噬需要αvβ5整联蛋白(Finnemann等人1997,同上)。虽然hUTC CM增加了营养不良RPE细胞的吞噬,但是内皮素-1、TGF-β1或IL-6(浓度200ng/mL)和玻连蛋白(各种浓度)却对RCS RPE吞噬作用没有影响(图8A-8C,图9)。
经条件培养基处理和未处理的营养不良RPE的基因表达谱RNA分析示出,hUTC表达15个RTK亚族之内RTK配体的多个基因(图10和表1-1)。hUTC也表达包括MFG-E8、Gas6、蛋白质S、TSP-1和TSP-2的桥分子的基因(表1-3)。RCS RPE表达18个RTK亚族的基因(表1-2)。在18个中有15个RTK亚族对应于hUTC中表达的RTK配体基因。RCS RPE还表达用于桥分子结合的受体基因,包括整联蛋白αvβ3、αvβ5、Ax1、Tyro3、MerTK和CD36(表1-4)。
利用RNA-Seq后进行信息数据分析,RCS RPE细胞和hUTC两者的转录组表达谱示出RCS RPE细胞表达多个RTK基因,而hUTC表达多个RTK配体的基因(表1-1至1-4和表2-1)。具体地,七个RTK亚族的RTK配体具有相对高的基因表达水平。这些配体包括BDNF(脑衍生神经营养因子)和NT3(神经营养蛋白3)-Trk家族的配体,HGF(肝细胞生长因子)-Met家族的配体,PDGF-DD(血小板衍生生长因子D型)和PDGF-CC(血小板衍生生长因子C型)-PDGF家族的配体,肝配蛋白-B2-Eph家族的配体,HB-EGF(肝素结合表皮生长因子)-ErbB家族的配体,GDNF(神经胶质细胞衍生的神经营养因子)-Ret家族的配体,以及集聚蛋白-Musk家族的配体。
在本发明的一个实施方案中,BDNF、NT3、HGF和GDNF在hUTC条件培养基中分泌,并且水平相比于得自正常人真皮成纤维细胞(NHDF)和ARPE-19细胞的那些更高,如在ELISA测定中所测定的那样(图11A-11C和11F)。在另一个实施方案中,相比于NHDF或ARPE-19,hUTC分泌较低水平的PDGF-CC和PDGF-DD(图11D,11E)。在另一个实施方案中,如在ELISA测定中所测,肝配蛋白-B2和HB-EGF并未在hUTC、NHDF和ARPE-19的条件培养基中检测到。这些细胞不分泌这两种蛋白质,或者该水平低于ELISA测定的检出限。hUTC、NHDF和ARPE-19条件培养基中的集聚蛋白水平类似于对照培养基;在所有条件培养基样本中检出的集聚蛋白均可能来自于培养基。
基于RCS RPE细胞的以RNA-Seq为基础的转录组表达谱分析,在hUTC条件培养基中分泌的桥分子和其它因子的水平进一步展示出对吞噬作用并因而对细胞凋亡的影响。如所显示,RCS RPE细胞表达目前被鉴定识别凋亡细胞上“吞噬我”信号的许多受体的基因。这些受体包括清道夫受体(SR-A、LOX-1、CD68、CD36、CD14)、整联蛋白(αvβ3和αvβ5)、Ax1和Tyro3的受体酪氨酸激酶、LRP-1/CD91、以及PS受体Stabilin 1(表3-1;摘自Erwig L-P和HensonPM,Cell Death and Differentiation 2008;15:243-250)。此外,hUTC表达多个桥分子基因,包括TSP-1、TSP-2、表面活性剂蛋白D(SP-D)、MFG-E8、Gas6、载脂蛋白H和膜联蛋白1。在本发明的一个实施方案中,hUTC在条件培养基中分泌MFG-E8、Gas6、TSP-1、TSP-2(图12A-12E和表3-2)。在另一个实施方案中,hUTC不分泌载脂蛋白H、SP-D或膜联蛋白I(表3-2)。在某些实施方案中,hUTC以比NHDF和ARPE-19显著更高的水平分泌MFG-E8和TSP-2(图12A和12D)。
在本发明的一个方面,当用经hUTC CM预温育的ROS饲喂RCS RPE细胞时,hUTC条件培养基刺激ROS的吞噬作用。营养不良RPE细胞的吞噬作用被完全拯救。如图13A-13D所示,未经处理的营养不良RPE细胞的吞噬相比于正常RPE细胞减少。在本发明的一个实施方案中,用hUTC CM预孵育营养不良RPE细胞拯救吞噬。这即使在测定期间不存在hUTC CM时也发生。在本发明的一个实施方案中,吞噬相关的受体及其信号转导途径在预孵育期间上调。无论营养不良RPE细胞是否用hUTC CM预处理,在整个吞噬测定中存在hUTC CM时均观察到吞噬强劲增强。在一个实施方案中,用经hUTC CM预处理的ROS喂养的营养不良RPE细胞恢复或拯救吞噬。这即使在吞噬测定期间不存在hUTC CM时也发生。在本发明的特定实施方案中,hUTC CM可修剪或修饰ROS,例如通过有利促进吞噬的桥分子/调理素增强ROS结合和内化。
在本发明的实施方案中,桥分子MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2通过RCS RPE细胞介导ROS吞噬。用经各种浓度MFG-E8、Gas6、TSP-1或TSP-2预温育的ROS喂养并分析吞噬作用的营养不良RPE细胞显示出ROS吞噬作用的拯救(图14A-14H)。在一个具体实施方案中,hUTC条件培养基通过分泌桥分子例如MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2来介导RCS RPE吞噬拯救。
在一个实施方案中,RTK配体诸如BDNF、HGF和GDNF刺激RCS RPE中的hUTC-介导的吞噬拯救。RTK配体BDNF、HGF和GDNF拯救RCS RPE的吞噬(图14I-J)。重组的RTK配体和桥分子蛋白可模拟hUTC CM的作用并恢复RCS RPE的吞噬作用,并且参与RCS RPE中的hUTC-介导的吞噬拯救。
siRNA介导的基因沉默展示hUTC中BDNF、HGF、GDNF、MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2敲低(沉默)。模拟或混杂siRNA转染对hUTC分泌这些因子没有影响。定向MFG-E8、TSP-1、TSP-2和HGF的siRNA得到几乎100%的敲低效率;BDNF和GDNF分别观察到80%和65%的敲低(图15A-15B)。敲低各个桥分子MFG-E8、TSP-1、TSP-2减少了RCS RPE对OS的吞噬(图15C)。在一个具体实施方案中,RTK配体BDNF、HGF和GDNF为RCS RPE中hUTC-介导的吞噬拯救所需。在另一个实施方案中,桥分子诸如MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2为RCS RPE中hUTC-介导的吞噬拯救所需。
细胞修饰、组分和产品
祖细胞如产后细胞还可经基因修饰成产生治疗学上可用的基因产品,或者产生用于***的抗肿瘤药。基因修饰可使用多种载体中的任一种实现,包括但不限于整合病毒载体,例如逆转录病毒载体或腺相关病毒载体;非整合型复制载体,例如***状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体;或复制缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞中的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、粒子枪或通过直接DNA注射。
优选地使用由一种或多种适当表达控制元件和选择性标记物控制的或与其有效连接的DNA转化或转染宿主细胞,所述一种或多种适当表达控制元件例如启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等。可使用任何启动子驱动***基因的表达。例如,病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、***状瘤病毒、EB病毒或弹性蛋白基因启动子。在一些实施方案中,用于控制感兴趣的基因的表达的控制元件能够允许基因的调控表达,使得仅在体内需要时才合成产物。如果瞬时表达是所需的,则优选地在非整合型和/或复制缺陷型载体中使用组成型启动子。另选地,在必要时可使用诱导型启动子来驱动***基因的表达。诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的启动子。
外来DNA引入之后,可允许工程化的细胞在富集培养基中生长,然后转换到选择培养基。外来DNA中选择性标记物赋予选择抗性,并且允许细胞将例如质粒上的外来DNA稳定整合到其染色体中并长成集落,继而可克隆和扩增成细胞系。该方法可有利地用于使表达基因产物的细胞系工程化。
细胞可经基因工程化而“敲除”或“敲低”促使植入位点发炎或排斥的因子的表达。下文将讨论用于降低靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术。如本文所用,“负调节”指相对于不进行调节处理时的靶基因产物的水平和/或活性,靶基因产物的水平和/或靶基因产物的活性降低。来自神经元或神经胶质细胞的基因的表达可使用多种技术(包括例如通过使用同源重组技术使基因失活的表达抑制)来降低或敲除。通常,在编码蛋白质重要区域的外显子(或该区域5’的外显子)中***阳性选择性标记物(例如neo),从而防止由靶基因产生正常mRNA并导致基因失活。还可通过在基因的一部分引入缺失,或通过删除整个基因,而使基因失活。通过使用具有在基因组中相距很远的与靶基因同源的两个区域的构建体,可将介于两个区域之间的序列删除(Mombaerts等人,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084-3087)。反义DNA酶、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、以及抑制靶基因表达的其它此类分子也可用于降低靶基因活性水平。例如,已证实抑制主要组织相容性基因复合物(HLA)的表达的反义RNA分子对于免疫应答而言是最通用的。另外,可使用三螺旋分子降低靶基因活性水平。这些技术详述于L.G.Davis等人(编辑),1994,BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第2版,Appleton&Lange,Norwalk,CT。
在其它方面,本发明提供由下述制备的细胞裂解液和细胞可溶性级分:产后细胞(优选PPDC),或者包含PPDC细胞的异质或同质细胞群,以及已经基因修饰或已被刺激沿神经元途径分化的PPDC或其群体。此类细胞裂解液及其级分具有许多效用。例如,在体内使用细胞裂解液可溶性级分(即,基本上不含膜)有益于在患者内异体地使用胞内环境而不引入大量最易引发排斥或其它不良免疫学应答的细胞表面蛋白。裂解细胞的方法是本领域熟知的,包括机械破碎、酶分解或化学分解或它们的组合等多种手段。此类细胞裂解液可由细胞直接在它们的生长介质中制备,因而含有分泌的生长因子等,或可在(例如)PBS或其它溶液中由不含介质的洗涤过的细胞制备。如果优选的,可将洗涤的细胞以大于初始群体密度的浓度重悬。
在一个实施方案中,如通过破碎细胞而不进行随后的细胞级分的分离来制备全细胞裂解液。在另一个实施方案中,细胞膜级分通过本领域已知的常规方法(例如离心、过滤或类似方法)分离自细胞的可溶性级分。
由祖细胞例如产后衍生细胞群制备的细胞裂解液或细胞可溶性级分可按原样、进一步浓缩(通过例如超滤或冻干、或甚至干燥)、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其它化合物(诸如生物制品,例如药学上有用的蛋白组合物)组合来使用。细胞裂解液或其级分可单独在体外或体内,或例如与自体或同种活细胞一起使用。如果在体内引入,可将裂解液局部地引入到治疗部位处,或引入到治疗部位远侧以向患者提供例如需要的细胞生长因子。
在另一个实施方案中,可在体外培养产后细胞(优选PPDC)以产生高收率的生物产物。例如,所关注的天然产生特定生物产物(如营养因子),或者已经基因工程化以产生生物产物的此类细胞可使用本文所述的培养技术来无性扩增。另选地,细胞可在诱导分化为期望谱系的培养基中扩增。在每种情况下,通过细胞产生并分泌到培养液中的生物产物可使用标准分离技术(如诸如举例来说差异蛋白沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、电泳和HPLC)容易地从条件培养液中分离。为了利用流动进料方法(例如,体外三维培养),可使用“生物反应器”。实质上,使新鲜培养液通过三维培养,从培养物中洗出且然后可如上所述从流出物中分离生物产物。
另选地,所关注的生物产物可保持在细胞内,因此,其收集可能需要如上所述的裂解细胞。然后可使用上文所列技术中的任何一种或多种来纯化生物产物。
在另一个实施方案中,作为替代形式制备、收集和利用胞外基质(ECM)来将活细胞植入到需要组织修复或替换的受治疗者中,ECM通过在液体、固体或半固体基材上培养产后细胞(优选PPDC)产生。在使得期望量的ECM分泌到框架上的条件下,将细胞在如本文其它地方描述的三维框架上体外培养。去除细胞和框架,并且处理ECM以用于进一步使用,例如作为可注射的制剂。为了实现这个目的,要将框架上细胞杀死并且从框架上去除所有细胞碎片。这个过程可以许多不同方式进行。例如,可将活组织在液氮中快速冷冻而不低温保存,或可将组织浸入无菌蒸馏水中,使得细胞由于渗透压而破裂。
一旦杀死细胞,细胞膜可能破碎,并且通过用温和去垢剂(诸如EDTA、CHAPS或两性离子去垢剂)冲洗的处理来去除细胞碎片。另选地,组织可经酶消化和/或用分解细胞膜的试剂提取并移除细胞内容物。此类酶的示例包括但不限于透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去垢剂的示例例如包括非离子去垢剂,诸如烷芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Rohm and Haas Philadelphia,Pa.)、BRIJ-35即聚乙氧基乙醇月桂基醚(Atlas Chemical Co.,San Diego,Calif.)、聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚乙氧乙醇失水山梨醇单月桂酸酯(Rohm and Haas)、聚乙烯月桂基醚(Rohm and Haas);以及例如离子去污剂,诸如十二烷基硫酸钠、硫酸化高级脂肪醇、支链或非支链中含有7至22个碳原子的磺化烷烃和磺化烷基芳烃。
可以例如取决于是否已经在三维框架上形成新组织的多种方式实现ECM的收集,所述三维框架是可生物降解的或不可生物降解的。例如,如果框架是不可生物降解的,ECM可通过使框架经受超声、高压水射、机械刮擦或用去垢剂或酶温和处理、或上述方法的任何组合去除。
如果框架是可生物降解的,ECM可例如通过使框架降解或溶解在溶液中收集。另选地,如果可生物降解的框架由其自身可与ECM一起注射的材料构成,则框架和ECM可针对随后的注射一起处理。另选地,针对从不可生物降解的框架收集ECM,可通过上文所述的任何方法将ECM从可生物降解的框架去除。优选地设计所有收集过程以免使ECM变性。
在收集ECM之后,可将它进一步处理。例如,可使用本领域熟知的技术(诸如通过超声)将ECM匀化成细粒,使得其可通过外科针。如果需要,可通过γ照射交联ECM的组分。优选地,可在0.25至2兆拉德之间照射ECM以灭菌和交联ECM。使用试剂(其是有毒的,诸如戊二醛)的化学交联是可以的,但一般不是优选的。
可通过将由本发明细胞产生的ECM与一种或多种其它细胞类型的ECM混合来调节蛋白质(诸如存在于ECM的多种胶原类型)的量和/或比率。此外,生物活性物质诸如蛋白质、生长因子和/或药品可结合到ECM。示例性生物活性物质包括组织生长因子诸如TGF-β等,其促进注射部位处的治愈和组织修复。此类添加剂可用于上文所述的任何实施方案中,如由细胞产生的全细胞裂解液、可溶性细胞级分、或进一步地,纯化的组分和产物。
药物组合物
在另一方面,本发明提供药物组合物,该药物组合物使用祖细胞如产后细胞(优选PPDC)、其细胞群、由此类细胞产生的条件培养基,以及由此类细胞以各种方法产生的细胞组分和产物来治疗眼变性性病症。某些实施方案涵盖包含活细胞(例如,单独或与其它细胞类型混合的PPDC)的药物组合物。其它实施方案涵盖包含PPDC条件培养基的药物组合物。另外的实施方案可使用PPDC的细胞组分(例如细胞裂解液、可溶性细胞级分、ECM或任何前述组分)或产物(例如由细胞天然产生或通过基因修饰产生的营养因子和其它生物因子、来自培养细胞的条件培养基)。在任一种情况下,药物组合物还可包含其它活性剂,诸如本领域已知的抗炎剂、抗凋亡的药剂、抗氧化剂、生长因子、神经营养因子或神经再生、神经保护或眼用药物。
可被添加到药物组合物中的其它组分的示例包括但不限于:(1)其它神经保护或神经有益药物;(2)所选择的细胞外基质组分,诸如一类或多类本领域已知的胶原,和/或生长因子、富血小板血浆、以及药物(另选地,PPDC可经基因工程化而表达和产生生长因子);(3)抗凋亡剂(例如,红细胞生成素(EPO)、EPO模拟体、促血小板生成素、***(IGF)-I、IGF-II、肝细胞生长因子、半胱天冬酶抑制剂);(4)抗炎化合物(例如,p38MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、类克、雷帕霉素和非甾类抗炎药(NSAIDS)(诸如替泊沙林、痛灭定和舒洛芬);(5)免疫抑制或免疫调节剂,诸如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体;(6)抗氧化剂,诸如普罗布考、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸;以及(6)局麻药,这里仅列出一些。
本发明的药物组合物包含用药学上可接受的载体或培养基配制的祖细胞如产后细胞(优选PPDC)、那些细胞所产生的条件培养基、或其组分或产物。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(诸如林格氏溶液(Ringer’s solution))、醇、油、明胶、和碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉、或淀粉、脂肪酸酯)、羟甲基纤维素、以及聚乙烯基吡咯烷。可将此类制剂灭菌,并且如果需要,将其与辅助剂(诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液和着色剂)混合。典型但非排他性地,将包含细胞组分或产物(但非活细胞)的药物组合物配制为液体。通常将包含PPDC活细胞的药物组合物配制为液体、半固体(例如凝胶)或固体(例如,如对于眼部组织工程化适当的基质、支架等等)。
药物组合物可包含如药物化学家或生物学家所熟悉的辅助组分。例如,其可包含抗氧化剂,其范围根椐所用抗氧化剂的种类而改变。常用抗氧化剂的适当范围为约0.01%至约0.15%容重的EDTA、约0.01%至约2.0%容重的亚硫酸钠、以及约0.01%至约2.0%容重的焦亚硫酸钠。对于以上每者,本领域的技术人员可使用约0.1%容重的浓度。其它代表性的化合物包括巯基丙酰基甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽和类似的物类,但是也可采用适于眼部施用的其它抗氧化剂,例如抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或焦亚硫酸钠。
缓冲剂可用于将滴眼制剂的pH维持在约4.0至约8.0的范围内;从而使眼部刺激最小化。对于直接玻璃体内或眼内的注射,制剂应当为pH 7.2至7.5,优选pH 7.3-7.4。眼科用组合物也可包括适于眼施用的张力剂。其中合适的是使制剂与0.9%的盐水溶液近似等渗的氯化钠。
在某些实施方案中,采用增粘剂配制药物组合物。示例性试剂为羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。药物组合物可具有根据需要添加的助溶剂。合适的助溶剂可包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨酸酯、丙二醇和聚乙烯醇。防腐剂也可包括在内,例如苯扎氯铵、异辛基苯氧基乙氧基乙基苄基二甲基氯化铵、氯代丁醇、乙酸苯汞或硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠、或对羟基苯甲酸甲酯或丙酯。
注射用制剂优选地被设计成单次使用给药并且不包含防腐剂。注射溶液应当具有相当于0.9%氯化钠溶液(重量克分子渗透浓度为290-300渗透压毫克分子)的等渗度。这可以通过添加氯化钠或如上所列的其它共溶剂、或如上所列的赋形剂(例如缓冲剂)和抗氧化剂来实现。
眼前房组织被房水浸泡,而视网膜持续暴露于玻璃体。这些液体/凝胶因包含抗氧化剂化合物和酶而以高度还原的氧化还原态存在。因此,可能有利的是在眼科用组合物中包括还原剂。合适的还原剂包括N-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸或盐形式,以及亚硫酸盐钠或偏亚硫酸氢钠,其中抗坏血酸和/或N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽尤其适用于注射溶液。
可将包含细胞或条件培养基、或细胞组分或细胞产物的药物组合物以本领域已知的几种递送模式中的一种或多种递送至患者的眼。在一个可能适用于一些情况的实施方案中,将组合物以滴眼剂或洗眼剂局部递送至眼。在另一个实施方案中,可经由定期眼内注射或通过以诸如BSS或BSS PLUS(Alcon USA,Fort Worth,Tex.)的冲洗液灌注将组合物递送至眼内部的各个位置。另选地,可将组合物以本领域技术人员已知的其它眼科剂型施用,如预形成或原位形成的凝胶剂或脂质体,例如授予Herrero-Vanrell的美国专利5,718,922中所公开的那样。在另一个实施方案中,组合物可经由接触镜片(例如Lidofilcon B,Bausch&Lomb CW79 or DELTACON(Deltafilcon A))或临时滞留在眼表面上的其它物体递送至或透过需要治疗的眼的晶状体。在其它实施方案中,可采用诸如胶原角膜屏蔽体(例如,BIO-COR可溶解的角膜屏蔽体,Summit Technology,Watertown,Mass.)的支持物。还可通过来自渗透泵(ALZET,Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)的插管或者通过定时释放的胶囊(OCCUSENT)或可生物降解片(OCULEX,OCUSERT)的植入,将组合物通过灌注施用到眼球中。这些施用途径的优点在于为眼提供连续供应的药物组合物。这可有利于局部递送至角膜。
在半固体或固体载体中的包含活细胞的药物组合物通常配制用于在眼部损伤或损坏的部位处的外科植入。应当理解,液体组合物(例如条件培养基)也可通过外科规程施用。在特定的实施方案中,半固体或固体药物组合物可包含半渗透性凝胶、晶格、细胞支架等,它们可以是不可生物降解的或可生物降解的。例如,在某些实施方案中,可能期望或合适的是将外源细胞与它们的周围环境隔离,仍允许细胞将生物分子分泌和递送到周围细胞。在这些实施方案中,可将细胞配制为自主植入物,所述自主植入物包含由不可降解的、可选择性渗透的阻隔包围的活PPDC或含有PPDC的细胞群,所述阻隔可使移植细胞与宿主组织物理分离。有时将此类植入物称为“免疫保护的”,因为在不存在药物导致的免疫抑制下,它们具有防止免疫细胞和大分子受到移植细胞杀伤的能力(关于此类装置和方法的综述参见如P.A.Tresco等人,2000,Adv.Drug Delivery Rev.42:3-27)。
在其它实施方案中,本发明的药物组合物利用了不同种类可降解的凝胶和网状物。例如,特别适合于持续释放制剂的可降解的材料包括生物相容性聚合物,诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等等。可降解的聚合物的结构、选择和在药品递送媒介物中的用途已在多个公布中综述,包括A.Domb等人,1992,Polymers forAdvanced Technologies 3:279-291。授予Wong等人的美国专利5,869,079公开了可生物降解缓释眼部植入物中亲水性和疏水性实体的组合。此外,授予Guo等人的美国专利6,375,972,授予Chen等人的美国专利5,902,598,授予Wong等人的美国专利6,331,313,授予Ogura等人的美国专利5,707,643,授予Weiner等人的美国专利5,466,233,以及授予Avery等人的美国专利6,251,090各自描述了可用于递送药物组合物的眼内的植入装置和***。
在其它实施方案中,例如,为修复神经病变,例如损伤或切断的眼神经,可能期望或合适的是将细胞递送在可生物降解的,优选地生物吸收性或可生物吸收的支架或基质上或其中。通常,这些三维生物材料包含附着到支架上、分散于支架内、或结合在细胞外基质中的活细胞,所述细胞外基质夹带在支架中。一旦植入到身体的靶区域,这些植入物开始与宿主组织整合,其中移植细胞开始逐渐形成(参见如,P.A.Tresco等人,2000,同上;另参见D.W.Hutmacher,2001,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.12:107-174)。
可用于本发明的支架或基质(有时共同称为“框架”)材料的示例包括非织造垫、多孔泡沫、或自组装肽。例如,使用由以商品名VICRYL(Ethicon,Inc.,Somerville,N.J)销售的合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物PGA/PLA)构成的纤维形成非织造垫。还可利用由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫,其通过诸如冷冻干燥或冻干的方法形成,如美国专利6,355,699中讨论的。也可使用水凝胶诸如自组装肽(例如RAD16)。原位形成的可降解网络也适用于本发明(参见例如,Anseth,K.S.等人,2002,J.ControlledRelease 78:199-209;Wang,D.等人,2003,Biomaterials 24:3969-3980;授予He等人的美国专利公布2002/0022676)。这些材料可配制成适合注射的流体,然后可通过多种方式(如,改变温度、pH、暴露于光)诱导其形成原位或体内形成可降解的水凝胶网络。
在另一个实施方案中,所述框架是毡,其可由可生物吸收的材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物、或透明质酸)制成的复丝纱线构成。使用包括卷曲、切割、梳理和针刺的标准纺织加工技术,将所述纱线制成毡。在另一个实施方案中,将细胞接种到泡沫支架,所述泡沫支架可以是复合结构。
在多个上述实施方案中,可将框架模制成有用的形状。此外,应当理解,例如以对应于用于制备含成纤维细胞的GDC血管内线圈的方式,可在预成形的、不可降解的外科的或植入式的装置上培养PPDC,例如(Marx,W.F.等人,2001,Am.J.Neuroradiol.22:323-333)。
为了加强细胞附着,可在接种细胞之前处理基质、支架或装置。例如,在接种之前,可用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质,并且在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中温育以涂覆尼龙。可类似地使用硫酸处理聚苯乙烯。还可对框架的外表面进行改性以改善细胞的附着性或生长和组织分化,例如通过等离子涂布框架或添加一种或多种蛋白质(如,胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(如,硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其它材料,例如但不限于明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等等。
根据本领域已知的方法制备包含活细胞的框架。例如,可使细胞在培养容器中自由生长至亚汇合或汇合状态,然后将其与培养物分离并接种到框架上。如果需要,可在接种细胞之前、期间或之后向培养基添加生长因子以触发分化和组织形成。另选地,可修饰框架本身,使得增强在其上的细胞生长,或使得降低植入物的排斥风险。因此,一种或多种生物学活性化合物(包括但不限于抗炎剂、免疫抑制剂或生长因子)可加入框架中用于局部释放。
使用方法
可以各种方式使用祖细胞,诸如产后细胞(优选hUTC或PDC)、或其细胞群、或由此类细胞产生的条件培养基或其它组分或产物,以支持和有利于眼部细胞和组织的修复和再生。此类用途包括体外、离体和体内方法。以下列出的方法针对PPDC,但其它产后细胞也可适用于那些方法。
体外和体内方法
在一个实施方案中,可在体外使用祖细胞诸如产后细胞(优选hUTC或PDC),以及由其产生的条件培养基,以针对药剂、生长因子、调节因子等的有效性和细胞毒性筛选各种各样的化合物。例如,此类筛选可在基本上同质的PPDC群体上进行,以评估与PPDC一起配制或共同配制的候选复合物治疗眼部病症的功效或毒性。另选地,出于评估新药物候选物的功效的目的,此类筛选可在已被刺激分化成眼中存在的细胞类型或其祖细胞的PPDC上进行。在该实施方案中,PPDC可在体外维持并暴露于待测试的化合物。潜在胞毒化合物的活性可通过其在培养中损害或杀死细胞的能力来测量。这可容易的通过活体染色技术来评估。
如上所述,可在体外培养PPDC来产生生物产物,所述生物产物由细胞天然产生、或由细胞在被诱导分化成其它谱系时产生,或者由细胞经由基因修饰产生。例如,已发现在生长培养液中生长的脐衍生的细胞分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8。已发现TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子和IL-8由生长培养基中培养的胎盘衍生的PPDC分泌(参见实施例)。
就这一点而言,本发明的实施方案的特征为使用PPDC产生条件培养基。由PPDC产生的条件培养基可得自未分化的PPDC或得自在刺激分化的条件下孵育的PPDC。此类条件培养基被设想用于例如体外或离体或者体内培养上皮或神经前体细胞,以支持包含PPDC同质群体或含有PPDC及其它祖细胞的异质群体的移植细胞。
得自PPDC或ECM或其组分的细胞裂解液、可溶性细胞级分或组分可用于多种目的。如上所述,这些组分中的一些可在药物组合物中使用。在其它实施方案中,细胞裂解液或ECM在进行此类治疗过程中用于涂覆(或换句话讲处理)将要用于外科、或用于植入、或用于离体目的的物质或装置,或用于促进细胞或组织的治愈或存活。
如实施例14和16所述的那样,PPDC在与那些细胞的共培养中生长时展示出支持成体神经祖细胞存活、生长和分化的能力。同样,先前的研究指示PPDC可经由营养机制支持视网膜细胞起作用(US 2010-0272803)。因此,PPDC有利地用于体外共培养,以对其它细胞特别是神经细胞以及神经和眼部祖细胞(例如,神经干细胞和视网膜或角膜上皮干细胞)提供营养支持。对于共培养,可能期望的是PPDC和期望的其它细胞,所述其它细胞将要在此两种细胞类型接触的条件下共培养。这可例如通过将细胞以异质细胞群接种到培养基中或接种到合适培养基底上来实现。另选地,首先可使PPDC生长至汇合状态,然后其在培养中将对第二期望的细胞类型起到基材作用。在这后一实施方案中,细胞还可如通过膜或类似装置经物理分离,使得其它细胞类型可被去除和独立使用,然后是共培养时期。在共培养中用于促进神经或眼部细胞类型的扩增和分化的PPDC可用于科研和临床/治疗领域。例如,PPDC共培养可用于在培养中有利于此类细胞的生长和分化,例如用于基础科研目的或用于药物筛选试验。出于治疗性目的,PPDC共培养还可用于神经或眼部祖细胞的离体扩增以供稍后施用。例如,可从个体收获神经或眼部祖细胞,将它们与PPDC在共培养中离体扩增,然后转到该个体(自体转移)或另一个个体(同种或异体转移)。在这些实施方案中,应当理解,离体扩增之后,可将混合的细胞群施用于有治疗需要的患者,所述混合的细胞群包含PPDC和祖细胞。另选地,在自体转移合适或期望的情况下,针对向患者施用,可在培养中物理地分离共培养的细胞群,使自体祖细胞能够移除。
体内方法
如实施例中所列出的那样,条件培养基可有效地用于治疗眼变性性病症。一旦移植到眼中目标位置,得自祖细胞如PPDC的条件培养基就为眼部细胞原位提供营养支持。
可将得自祖细胞如PPDC的条件培养基与如下物质一起施用:其它有益药物,生物分子诸如生长因子、营养因子,条件培养基(得自祖细胞或分化的细胞培养物),或其它活性剂,诸如本领域已知的抗炎剂、抗凋亡的药剂、抗氧化剂、生长因子、神经营养因子或神经再生、神经保护药物。当将条件培养基与其它试剂一起施用时,它们可与其它试剂在单个药物组合物中一起,或在分离的药物组合物中,同时或顺序(在其它试剂施用之前或之后)施用。
可与祖细胞如PPDC以及条件培养基产物一起施用的其它组分的示例包括但不限于:(1)其它神经保护或神经有益药物;(2)所选择的细胞外基质组分,诸如一类或多类本领域已知的胶原,和/或生长因子、富血小板血浆、以及药物(另选地,细胞可经基因工程化而表达和产生生长因子);(3)抗凋亡剂(例如,红细胞生成素(EPO)、EPO模拟体、促血小板生成素、***(IGF)-I、IGF-II、肝细胞生长因子、半胱天冬酶抑制剂);(4)抗炎化合物(例如,p38MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-I抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、类克、雷帕霉素和非甾类抗炎药(NSAIDS)(诸如替泊沙林、痛灭定和舒洛芬);(5)免疫抑制或免疫调节剂,诸如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体;(6)抗氧化剂,诸如普罗布考、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸;以及(6)局麻药,这里仅列出一些。
可将液体或流体药物组合物施用于眼中更普遍的位置(例如,局部地或眼内地)。
其它实施方案涵盖通过施用包含得自祖细胞如PPDC的条件培养基、或那些细胞天然产生或通过细胞基因修饰产生的营养因子和其它生物因子的药物组合物来治疗眼变性性病症的方法。同样,这些方法还可包括施用其它活性剂,诸如本领域已知的生长因子、神经营养因子或神经再生或神经保护药品。
根据良好的医疗实践,考虑到各个患者的条件(例如体质和眼变性性病症的程度、年龄、性别、体重和一般医疗条件、以及执业医生已知的其它因素),开发了施用得自产后细胞如PPDC的条件培养基或本文所述的任何其它药物组合物的剂型和剂量方案。因此,通过这些本领域已知的考虑因素确定向患者施用的药物组合物的有效量。
可能期望或合适的是开始细胞疗法之前药理上抑制患者的免疫反应。如上所述,这可通过使用全身或局部免疫抑制剂实现,或其可通过在胶囊包封装置中递送细胞实现。用于降低或消除对移植的细胞的免疫应答的这些和其它方法是本领域已知的。如上所述,作为替代形式,条件培养基可由经基因修饰以降低其免疫原性的PPDC制得。
可通过使用多种扫描技术(例如计算机轴向断层摄影术(CAT或CT)扫描、磁性共振成像(MRI)或正电子发射断层摄影术(PET)扫描),来测定移植的细胞在活患者内的存活。移植物存活的测定也可在死后通过取出肺组织且在视觉上或通过显微镜检查来完成。另选地,可用对神经或眼部细胞或其产物(例如神经递质)特异的染色剂处理细胞。也可通过先前的示踪染料(诸如若丹明或荧光素标记的微粒、固蓝、铁微粒、双苯甲酰胺或基因引入报道基因产物,诸如β-半乳糖苷酶或β-葡糖苷酸酶)的结合来鉴定移植的细胞。
移植细胞或条件培养基在受治疗者眼部组织中的功能性整合可通过检查受损或病态的眼部功能的修复来评估。例如,黄斑变性或其它视网膜病的治疗效果可通过视敏度的提高、异常的评估和立体彩色眼底照片的分级来确定(Age-Related Eye Disease StudyResearch Group,NEI,NIH,AREDS Report No.8,2001,Arch.Ophthalmol.119:1417-1436)。
试剂盒和库
在另一方面,本发明提供试剂盒,该试剂盒以如上所述用于眼部再生和修复的各种方法利用祖细胞如PPDC、以及细胞群、由细胞(优选PPDC)制得的条件培养基,以及其组分和产品。在用于眼变性性病症的治疗或其它计划的治疗的情况下,试剂盒可包含一种或多种细胞群或条件培养基,包含至少产后细胞或来源于产后细胞的条件培养基和药学上可接受的载体(液体、半固体或固体)。试剂盒也可任选地包括施用细胞和条件培养基的方式,例如通过注射。试剂盒还可包括细胞和条件培养基的使用说明。针对野战医院用途(诸如军事用途)制备的试剂盒可包括整个手术的供应(包括组织支架、外科缝合线等),其中可使用细胞或条件培养基辅助修复急性损伤。如本文描述的用于测定和体外方法的试剂盒可含有例如以下项中的一种或多种:(1)PPDC或其组分、或PPDC的条件培养基或其它产物;(2)用于实施体外方法的试剂;(3)其它细胞或细胞群(视情况而定);以及(4)用于实施体外方法的说明书。
在另一方面,本发明还提供本发明的组织、细胞、细胞群、条件培养基和细胞组分的存库。如上所讨论,细胞和条件培养基易于冷冻保存。本发明因此提供在库中冷冻保存细胞的方法,其中细胞被冻存并与基于细胞免疫学、生物化学和遗传特性的细胞完整特征相关联。可根据规程的需要和患者的需要,将冷冻细胞解冻并扩增或直接用于自体、同源或异源治疗。优选地,将各个冷冻保存样本的信息保存于计算机中,其可基于外科医生、规程和患者的需要搜索,并且基于细胞或群体的特征作出合适的匹配。优选地,使本发明的细胞生长并扩增至期望的细胞数量,并且在存在或不存在基质或支持物情况下,单独地或作为共培养物制备治疗性细胞组合物。虽然在一些应用中可优选使用新鲜制备的细胞,但是可通过冷冻细胞并在计算机中输入信息以使计算机登记与样本相关联来将剩余物冷冻保存和存库。即使在无需匹配来源或此类细胞受体的供体情况下,出于免疫学目的,库***也使得易于将例如库存细胞期望的生物化学或遗传特性与治疗要求相匹配。在将期望的特性与库存样本匹配时,检索并准备样本以供治疗使用。还可根据本发明将如本文所述制备的细胞裂解液、ECM或细胞组分冷冻保存或以其它方式保存(例如通过冻干)并存库。
提供以下实施例来更详细描述本发明。这些实施例旨在说明而非限制本发明。
下列缩写可出现于实施例以及说明书和权利要求的其它地方。促血管生成素2——ANG2(或Ang2);抗原递呈细胞——APC;脑衍生神经营养因子——BDNF;碱性成纤维细胞生长因子——bFGF;“每天两次”(每日两次)——bid(BID);细胞角蛋白18——CK18;中枢神经***——CNS;趋化因子受体配体3——CXC配体3;Dulbecco极限必需培养基——DMEM;含低葡萄糖的DMEM——DMEM:lg(或DMEM:Lg,DMEM:LG);乙二胺四乙酸——EDTA;表皮生长因子——EGF(或E);荧光激活细胞分选——FACS;胎牛血清——FBS;成纤维细胞生长因子——FGF(或F);粒细胞趋化蛋白-2——GCP-2;神经胶质细胞衍生的神经营养因子——GDNF;胶质原纤维酸性蛋白——GF AP;肝素结合表皮生长因子——HB-EGF;人冠状动脉内皮细胞——HCAEC;肝细胞生长因子——HGF;人间充质干细胞——hMSC;肝细胞特异性转录因子——HNF-1α;人脐静脉内皮细胞——HVVEC;趋化因子——I309,以及配体——CCR8受体;***1——IGF-1;白介素-6——IL-6;白介素8——IL-8;角蛋白19——K19;角蛋白8——K8;角质细胞生长因子——KGF;白血病抑制因子——LIF:髓鞘碱性蛋白——MBP;单核细胞趋化蛋白1——MCP-1;巨噬细胞衍生趋化因子——MDC;巨噬细胞炎性蛋白1α——MIPlα;巨噬细胞炎性蛋白1β——MIP1β;基质金属蛋白酶(MMP)——MMP;间充质干细胞——MSC;正常人真皮成纤维细胞——NHDF;神经祖细胞扩增培养基——NPE;神经营养蛋白3——NT3;少突胶质细胞或神经胶质分化标记04——04;外周血单核细胞——PBMC;磷酸盐缓冲盐水——PBS;血小板衍生生长因子C——PDGF-CC;血小板衍生生长因子D——PDGF-DD;血小板衍生生长因子bb——PDGFbb;“口服”(经口)——PO;外周神经***——PNS;调节激活正常T细胞表达和分泌——Rantes(或RANTES);重组人生长和分化因子5——rhGDF-5;皮下——SC;基质细胞衍生因子1α——SDF-1α;音猬因子——SHH;标准操作规程——SOP;胸腺活化调节趋化因子——TARC;组织培养塑料——TCP;组织培养聚苯乙烯——TCPS;转化生长因子β2——TGFβ2;转化生长因子β-3——TGF β-3;基质金属蛋白酶抑制剂1——TIMP1;促血小板生成素——TPO;BIII微管蛋白——TUJ1;血管内皮生长因子——VEGF;血管性血友病因子——vWF;以及甲胎蛋白——αFP。
本发明通过但不限于以下实施例进一步进行说明。
实施例1
脐衍生的细胞条件培养基对拯救的效应营养不良RPE细胞在体外的吞噬活性
已完全确认得自皇家外科医学院(RCS)大鼠的视网膜色素上皮(RPE)细胞因Mertk基因的无效突变而表现出受损坏的视杆细胞外节盘膜(ROS)吞噬。(Feng W.等人,J BiolChem.2002,10:277(19):17016-17022)。已示出人脐组织衍生的细胞(hUTC)经视网膜下注入RCS大鼠眼中提高视敏度并似乎改善视网膜变性(US 2010/0272803)。在该实施例中,采用源于hUTC的条件培养基(CM)处理恢复了体外营养不良RPE细胞中的ROS吞噬。
检测hUTC条件培养基:1)以评估使用新的hUTC CM制剂对营养不良RPE吞噬作用的影响;2)以从经CM-处理和未经处理的营养不良RPE中分离可接受质量的RNA以用于由RNA-Seq实现的基因表达谱分析;3)以检测所选定RTK配体是否可提高不可使用Mertk信号转导途径的RCS大鼠的RPE中的吞噬水平;并且4)以测试激活RTK的不同受体的其它非-RTK配体是否可表现出类似的功能。
材料和方法
人脐组织衍生的细胞(hUTC)由下文实施例6-18所述的方法获得,并且在美国专利7,524,489和7,510,873,以及美国公开申请2005/0058634中详细描述,所述申请各自以引用方式并入本文。简而言之,人脐带经活产后供体同意得自Disease ResearchInterchange(Philadelphia,PA)。将组织切碎并经酶促方法消化。在采用包含50U/mL胶原酶(Sigma,St.Louis)的混合物的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-低葡萄糖(Lg)(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养基几乎完全消化之后,使细胞悬浮液过滤通过70[tm过滤器,并将上清液以350g离心。将分离的细胞在DMEM-Lg中洗涤数次并以5,000个细胞/cm2接种于包含15%(v/v)FBS(Hyclone,Logan,Utah)和4mM L-谷氨酰胺(Gibco,Grand Island,NY)的DMEM-Lg培养基中。当细胞达到约70%汇合时,使用TrypLE(Gibco,Grand Island,NY)传代细胞。在几次传代之后收获得到细胞并存库。
RPE细胞的初级培养物:RPE细胞获自6-11天龄的着色的正常(RCS rdy+/p+)(同类系对照)或营养不良(RCS rdy-/p+)大鼠。移除角膜缘之前的眼前部。轻轻地移除视网膜并将眼杯在4%(w/v)分散酶(≥0.8U/mg,Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)中温育20-30分钟。移除RPE片层,使其悬浮于生长培养基(DMEM+10%FBS[新纸材20%]+青霉素(200U/ml)/链霉素(200μg/ml))中,利用胰蛋白酶处理进行研制,并铺到8-孔室载玻片孔中或置于24-孔皿的孔中的圆形玻璃盖片上。将细胞在37℃和5%v/vCO2下孵育。
RPE细胞的磺酰罗丹明染色:使RPE培养物在包含磺酰罗丹明(40μg/ml最终浓度)的生长培养基中维持24h至72h。在添加ROS前36h至48h将细胞染色。在添加ROS前6h至18h移除含有磺酰罗丹明的培养基,使培养物维持于更换数次的新鲜生长培养基中。
大鼠感光细胞OS的分离:在光照启动后数小时,从2-4或6-8周龄的Long Evans大鼠获得眼。分离视网膜,用Polytron(8mm发生器)或Dounce玻璃匀化器匀化,在27%-50%线性蔗糖梯度顶部分层,并在4℃下以38,000rpm在SW41转子(240,000xg)中离心1小时。收集顶部的两个ROS带,用HBSS稀释,并以7000在HB-4转子(8000xg)中离心10分钟以沉淀ROS。
ROS的FITC染色:将ROS沉淀物以约1ml/沉淀物重悬于无血清的培养基(仅MEM基础培养基)中。添加FITC原液(2mg/ml,0.1M碳酸氢钠中,pH 9.0-9.5)至10μg/ml的最终浓度并在室温下温育1h。使经FITC-染色的ROS通过在微型离心机中以8000rpm离心沉淀10分钟,重悬于生长培养基(MEM20)中,计数并稀释至107/ml的最终浓度。
hUTC条件培养基(CM):制备三组hUTC条件培养基(CM)和对照培养基并用于在吞噬作用测定中测试。
1.含血清CM1制剂
在第1天,将hUTC以5,000个活细胞/cm2接种于T75细胞培养烧瓶中的hUTC生长培养基(DMEM低葡萄糖+15%FBS+4mM L-谷氨酰胺)中。将细胞在37℃和5%CO2培养箱中培养24小时。在第2天,吸出培养基,用DPBS洗涤两次,并且补充21mL的DMEM/F12完全培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))。将细胞再培养54小时。另外单独将对照培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))温育54h。在第4天,收集细胞培养上层清液和对照培养基并以250g在室温下离心5min,以3mL/管等分至冷冻管中,并且立即冷冻于-70℃冷冻机中。
2.无血清CM1制剂
在第1天,将hUTC以5,000个活细胞/em2接种于T75细胞培养烧瓶中的hUTC生长培养基(DMEM低葡萄糖+15%FBS+4mM L-谷氨酰胺)中。将细胞在37℃和5%CO2培养箱中培养24小时。在第2天,吸出培养基,用DPBS洗涤两次,并且补充21mL的DMEM/F12无血清培养基培养基(DMEM:F12培养基+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))。将细胞再培养54小时。另外单独将无血清对照培养基(DMEM:F12培养基+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))培养54h。在第4天,收集细胞培养上层清液和对照培养基并以250g在室温下离心5min,以3mL/管等分至冷冻管中,并且立即冷冻于-70℃冷冻机中。
3.CM2制剂
制备如同含血清CM1制剂并以5,000个活细胞/cm2接种hUTC,不同的是细胞培养烧瓶为T225烧瓶,每个烧瓶具有63mL的培养基,并且培养基更换后的孵育时间为48小时。
4.CM3制备
制备如同CM2,不同的是hUTC接种密度增大至10,000个活细胞/cm2,并且培养基更换后的孵育时间为48小时。
吞噬测定:将5×104个经磺酰罗丹明-染色的RPE细胞铺到多孔板中,在MEM+20%(v/v)FBS中维持6天,然后在测定前24h维持于MEM+5%(v/v)FBS中(每个样本2次或更多次平行测定)。在添加ROS前3h添加新鲜培养基,并且测定通过用FITC-ROS(107/ml,在MEM+20%(v/v)FBS中)覆盖培养物而开始并在37℃下孵育3至19h(通常8h)。在孵育结束时,剧烈洗涤细胞以移除未结合的ROS并用2%(w/v)多聚甲醛(Sigma,St.Louis,MO)固定。
在初级RPE的制备和培养方案、ROS的制备、以及吞噬测定自身方面,最优化RPE对ROS的吞噬。
RTK配体:使用的RTK配体为:重组人肝配蛋白-B2(目录号pro-937,批号1112PEFNB2,ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,Israel)、重组人BDNF(目录号248-BD-025/CF,批号NG4012051,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)、重组人HB-EGF(目录号259-HE-050/CF,批号JI3012021,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)、重组人HGF(目录号PHG0254,批号73197181A,Life Technologies,Carlsbad,CA)、重组人肝配蛋白A4(目录号E199,批号1112R245,Leinco Technologies,Inc.,St.Louis,MO)、以及重组人PDGF-DD(目录号1159-SB-025/CF,批号OTH0412071,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)。单个RTK配体原液的重构遵循供应商的数据表:重组人BDNF和HB-EGF分别以100μg/mL和250μg/mL重构于无菌PBS中。重组人HGF以500μg/mL重构于无菌蒸馏水中。重组人肝配蛋白A4以100μg/mL重构于无菌PBS中。重组人PDGF-DD以100μg/mL重构于无菌4mM HCl中。将重构原液等分并冷冻于-70℃的冷冻机中。
将培养基更换成MEM+5%(v/v)FBS(MEM5),并将配体以200ng/ml添加至营养不良细胞中,孵育24h,然后在配体存在下添加ROS,并且使细胞经受吞噬测定。作为对照,将正常RPE的平行测定预孵育于MEM5中并测定吞噬作用。
非RTK配体:使用的非RTK配体为:重组人玻连蛋白(目录号2308-VN-050,批号NBH0713021,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)、重组人TGF-β1(目录号240-B-010/CF,批号AV5412113,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)、重组人IL-6(目录号206-IL-010/CF,批号OJZ0712041,R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)、以及人内皮素-1(目录号hor-307,批号1211PEDN112,ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,Israel)。单个非RTK配体原液的重构遵循供应商的数据表:重组人玻连蛋白和IL-6分别以100μg/mL重构于无菌PBS中。重组人TGF-β1以100μg/mL重构于无菌4mM HCl中。重组人内皮素-1以100μg/mL重构于无菌18MΩ-cm H2O中。将重构原液等分并冷冻于-70℃的冷冻机中。
条件培养基的吞噬拯救活性的测定:将平行测定的营养不良(D)RPE用1ml的各个条件培养基孵育约24h。对于对照,将平行测定的同类系对照(N)RPE的在对照培养基(DMEM:F12培养基+10% FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))中孵育相同的时间。在孵育之后,移除条件培养基和对照培养基,用新鲜MEM5替代,并且使RPE经受吞噬测定。
检查非-RTK配体对RCS RPE细胞吞噬影响的测定:将hUTC CM3用作测定的阳性对照。为测试内皮素-1、TGF-β1和IL-6,将营养不良(D)RPE用1ml的各个条件培养基孵育24h。然后移除条件培养基,用新鲜的MEM+5%(v/v)FBS(MEM5)替代并经受吞噬测定(在MEM5中喂养ROS共8h)。就其它对照而言,将正常和营养不良RPE在MEM5中孵育24h并经受吞噬测定。将营养不良RPE细胞在MEM5中用200ng/mL的重组人内皮素-1、TGF-β1或IL-6孵育24h,然后在将ROS添加到包含重组人内皮素n-1、TGF-β1或IL-6的MEM5中时使其经受吞噬测定(在添加ROS时不更换培养基)。
为测试玻连蛋白,将ROS用对照培养基(DMEM+10%FBS)或条件培养基在37℃的CO2细胞培养培养箱中预温育24h。平行地,在37℃的CO2细胞培养培养箱中,将ROS在具有各种浓度的人重组玻连蛋白(4、2、1、0.5μg/ml)的MEM+20%(v/v)FBS(MEM20)中分别预温育24h。在温育之后,将ROS离心而无需洗涤,重悬于MEM20中并在MEM5存在下喂饲给营养不良RPE细胞以进行吞噬测定。就对照而言,将单独的正常RPE或单独的营养不良RPE在MEM20中培养,然后在未经处理的ROS存在下(重悬于MEM20中并喂饲给RPE细胞)更换成MEM5以进行吞噬测定。
成像和定量:通过相差显微镜和荧光显微镜使用配备有落射荧光光学、荧光显微镜和数码相机的倒置显微镜检查活RPE细胞。与细胞表面结合的FITC-ROS,摄取的FITC-ROS,以及异噬溶酶体如在McLaren等人(Invest Ophthalmol Vis Sci.,1993;34(2):317-326.)中所定义的那样鉴定。结合和摄取的ROS的定量在盖玻片上固定的细胞上进行。计数采用适当的过滤器和网格(视野尺寸,40×40μm)以250×放大倍数进行。计数各种类型细胞的代表性视野(每种培养物10至15个),并且将数据表示为得自2-3个单独实验的每个时间点的合并值的平均值。统计显著性由Student的t检验评估,并且认为是p<0.05。
测定接受判据:实验中的绝对吞噬水平根据多个因素而变化,包括分离RPE的质量和制备的ROS。已尽力使用相同谱系的RPE(即收获和制备的时间),用于比较不同处理对细胞的影响。如果正常RPE的吞噬水平相比于营养不良RPE的关系为约1∶0.3,则判定测定合法。
相对吞噬:相对吞噬是营养不良RPE相比于作为基准点的同类系对照(正常)示出的吞噬水平。吞噬水平可表示为ROS的平均数/视野,或表示为ROS的平均数/细胞。
RNA的分离.将hUTC以5,000个细胞/cm2接种并使其生长于包含15%(v/v)FBS(Hyclone,Logan,Utah)和4mM L-谷氨酰胺(Gibco,Grand Island,NY)的DMEM-Lg培养基中24小时,接着将培养基更换为包含10%(v/v)FBS的DMEM:F12培养基并再生长48小时。然后收集细胞,以使用Qiagen RNAeasy提取和柱上DNAse试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进行总RNA提取和DNA移除。使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,′Waltham,MA)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)测定样本中RNA的完整性和量。文库制备和测序通过Expression Analysis Inc.,Durham,NC进行。RNA文库使用Illumina′s TruSeq RNA-Seq Sample Prep试剂盒根据制造商的说明书制备,并且利用Illumina′s HiSeq 2000测序。用第6.1版ArrayStudio软件将测序读取作图到参考人类基因组(GRCh37patch8)上。使用每千个碱基的转录每百万映射读取的片段(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads,FPKM)计算基因表达。
在分离之后,将首先RCS RPE细胞一式三份接种到96-孔板中约一周,将培养基更换成hUTC条件培养基或对照培养基时的时间点视为0h。使用Trizol(Life Technologies,Carlsbad,CA)根据制造商的方案分别在2、4、8和24h提取RNA。将每个时间点一式三份提取的RNA合并为一个样本。采用分光光度法连同260/280吸光度比测定样本的浓度。
平行测定的营养不良RPE(各约2.4×104个)用或不用条件培养基处理,如以下方案所示:
结果
条件培养基测试
采用营养不良RPE测试三种条件培养基制剂(CM1、CM2、CM3)的吞噬拯救活性并与正常RPE相比较,如方法中所描述的那样。
CM1:将CM1测试两次(图1A和1B),一次使用棕褐色正常RPE,并且再一次使用着色的RPE。观察吞噬拯救活性。应当指出,在图1A中,着色的营养不良RPE中的基础吞噬水平几乎为棕褐色盔状正常RPE的水平的50%,其落在了可接受的范围(<30%正常吞噬水平)之外。还测试了无血清CM1培养基的效应(图2)。具有和不具有无血清CM1的营养不良细胞之间的差异有统计意义上的显著性。
CM2:测试CM2并且发现没有活性(图3)。
CM3:在第1天更换培养基之后,CM2(无活性)的孵育时间为48h,而CM1(活性)的孵育时间为54h。为获得活性条件培养基,初始细胞接种密度和培养基更换后的细胞孵育时间是要考虑的两个方面。CM3通过将细胞接种密度加倍来制备,其具有相比于CM2相同的培养基更换后的孵育时间。将CM3测定多次以确认活性的存在(图4A、4B、4C),并且其示出达至100%的吞噬拯救活性。
RCS RPE中的吞噬作用
在体外培养从RCS大鼠眼分离的RPE细胞以进行吞噬测定。将得自正常同类系对照大鼠眼的未经处理的RPE细胞用作对照以示出正常的吞噬水平。当将RCS RPE与hUTC共培养(图4A)或用hUTC条件培养基(CM)处理(图4B)时,RCS RPE中有缺陷的吞噬恢复至正常RPE的水平。当细胞用经hUTC CM预温育的OS喂养并在不存在hUTC CM时经受吞噬作用时,RCS RPE对OS的吞噬得到恢复(图4C)。如所示的hUTC分泌特定因子以促进RPE吞噬。
RTK配体测定
BDNF和HB-EGF测定:将一式两份的营养不良RPE连同正常对照用BDNF和HB-EGF处理并如方法中所述的那样测定吞噬(图5A,5B)。对每个样本进行十至十二次观察。相比于正常细胞,营养不良细胞趋于示出比平常更高的吞噬速率,但这并不妨碍对结果的解释。BDNF示出比CM3更高的吞噬救援活性。
PDGF-DD、肝配蛋白A4和HGF测定:每次取样计数的细胞数以每个视野(图6A,6C,6D)和每个细胞两者(图6B,6E)两者表示。结果不受影响,因为对每个框架计数的细胞数是恒定的。PDGF-DD(图6A)、肝配蛋A4(图6C)和HGF(图6D)相比于未经处理的对照均使营养不良RPE细胞的吞噬上调。PDGF-DD示出最大救援效应,比CM3更大。
肝配蛋白B2测定:肝配蛋白B2示出比CM3更高的极高吞噬救援活性。对每个视野(图7A)和每个细胞(图7B)的结果均进行测定。
非RTK配体测定
内皮素-1、TGF-β1或IL-6对RCS RPE吞噬作用的影响:将营养不良RPE细胞连同正常对照用内皮素-1、TGF-β1或IL-6处理并如材料和方法中所述的那样测定吞噬作用(图8A-8C)。对每个样本进行十次观察。图8A和8B示出两个单独测定。图8B中正常和营养不良RPE细胞的基础吞噬水平低于图8A,原因是从大鼠分离的细胞变异并且ROS的制备不同;测定被视为有效,因为正常细胞相比于营养不良细胞的吞噬水平的关系为1∶0.3。为与图8A的结果比较,将图8C中的数据归一化成使得正常和营养不良RPE细胞的吞噬水平与图8A的那些相同。hUTC CM3增大营养不良RPE细胞的吞噬作用,而测定中测试浓度(200ng/mL)的内皮素-1、TGF-β1或IL-6不对RCS RPE吞噬作用有影响。
玻连蛋白对RCS RPE吞噬作用的影响:将营养不良RPE细胞连同正常对照用经各种浓度玻连蛋白预温育的ROS喂养并如材料和方法中所述的那样测定吞噬作用(图9)。对每个样本进行十次观察。
就用于研究的对照培养基和hUTC条件培养基而言,对照培养基包含10%FBS,对照培养基中玻连蛋白的量为约500ng/ml。hUTC条件培养基可包含相比于对照培养基更多的玻连蛋白,原因是hUTC组成性分泌玻连蛋白。相比于用hUTC CM3预处理的ROS,用对照培养基预处理的ROS似乎对营养不良RPE的吞噬作用没有影响。所有测试浓度下的玻连蛋白具有与对照培养基类似的效应。这些结果符合先前出版物(Edwards等人,J Cell Physiol.1986,127:293-296;Miceli等人,Invest Ophthalmol Vis Sci.,1997;38(8):1588-1597)中报道的结果。玻连蛋白是血清的活性组分并且负责人供体眼中分离的培养RPE细胞经血清刺激而摄入ROS(Miceli等人,1997)。然而,对于大鼠RPE细胞,血清对正常RPE的吞噬作用的影响相比于营养不良RCS RPE是不同的。Edwards等人示出培养的RCS大鼠RPE细胞和正常同类系对照RPE细胞在无血清培养基中吞噬得比相当的较低量ROS。培养基中20%血清的存在显著增大了(6倍)正常RPE细胞的吞噬作用,但并未增大RCS RPE细胞的吞噬作用(Edwards等人,J Cell Physiol.1986,127:293-296)。
现有结果指示玻连蛋白不参与RCS RPE细胞中的hUTC CM介导的吞噬增强。
从经条件培养基处理的营养不良RPE中分离RNA
如方法中所述的那样进行几轮该实验以获得需要的RNA样本。使用RNA样本以通过Expression Analysis,Inc进行RNA测序。对于实验1,样本8和9的RIN得分并不满足RNA测序判据。从序列表中除去这两种样本。对于实验2,样本1的RIN得分并不满足RNA测序判据并将其从序列表中除去(测序结果见下)。
实验1
实验2
管 | 260/280 | 浓度 | 体积 | 量 | RIN |
未经处理的对照 | 2.11 | 145ng/μl | 19μl | 2.8μg | 1.0 |
2h对照 | 2.00 | 153ng/μl | 19μl | 2.9μg | 9.1 |
2h CM3 | 2.04 | 237ng/μl | 19μl | 4.5μg | 8.7 |
4h对照 | 2.00 | 120ng/μl | 19μl | 2.3μg | 8.8 |
4h CM3 | 2.05 | 179ng/μl | 19μl | 3.4μg | 9.1 |
8h对照 | 2.13 | 158ng/μl | 19μl | 3.0μg | 9.0 |
8h CM3 | 2.20 | 181ng/μl | 19μl | 3.4μg | 9.4 |
24h对照 | 2.07 | 124ng/μl | 19μl | 2.4μg | 8.8 |
24h CM3 | 2.20 | 154ng/μl | 19μl | 2.9μg | 8.1 |
通过以RNA-Seq为基础的转录组表达谱分析hUTC,显示出hUTC表达RTK配体和桥分子的基因。检测15个RTK亚族的多个RTK配体的基因表达(表1-1)。基于每千个碱基的转录每百万映射读取的片段(FPKM)值,对各个RTK亚族的RTK配体基因的表达水平进行分类并作图(图10;表1-1)。也检测了包括MFG-E8、Gas6、蛋白质S、TSP-1和TSP-2的桥分子的基因表达(表1-3)。
RCS RPE中对应RTK亚族和桥分子受体的基因表达示出RTK超级族可基于激酶结构域序列分为20个亚族(Robinson DR等人,Oncogene.2000;19(49):5548-5557)。在RCS RPE中检测20个RTK亚族中的18个的基因表达(表1-2)。在18个中有15个RTK亚族对应于hUTC中表达的RTK配体基因。也在RCS RPE中检测所报道的桥分子结合的受体的基因表达(KevanyBM等人,Physiology,2010;25(1):8-15)(表1-4),包括整联蛋白avP3、avP5、Ax1、Tyro3、MerTK和CD36。
表1-1:通过RNA-Seq鉴定hUTC中RTK配体的基因表达
表1-2通过RNA-Seq鉴定RCS RPE细胞中RTK配体基因表达
表1-3:通过RNA-Seq鉴定hUTC中桥分子基因表达
表1-4:通过RNA-Seq鉴定RCS RPE中桥分子受体基因表达
实施例2
hUTC条件培养基中的受体酪氨酸激酶(RTK)配体测量
利用RNA-Seq和信息数据分析,RCS RPE细胞和hUTC两者的转录组表达谱示出RCSRPE细胞表达多个RTK基因,而hUTC表达多个RTK配体的基因(表2-1)。与得自正常人真皮成纤维细胞(NHDF)和ARPE-19细胞的那些相比,在hUTC条件培养基中测量在hUTC中的基因表达水平相对较高的七个RTK亚族的RTK配体。这些配体包括BDNF和NT3-Trk家族的配体,HGF-Met家族的配体,PDGF-DD和PDGF-CC-PDGF家族的配体,肝配蛋白-B2-Eph家族的配体,HB-EGF-ErbB家族的配体,GDNF-Ret家族的配体,以及集聚蛋白-Musk家族的配体。
表2-1:得自转录组表达谱分析的RCS RPE细胞中的RTK基因表达分类和hUTC中的
RTK配体基因表达分类的汇总
材料和方法
hUTC(Lot NB12898P7,由PDL20Research Bank制得,第7页)、ARPE-19细胞(第3代)和NHDF(第10代)用于研究。
人BDNF ELISA试剂盒(目录号DBD00,批号311655,标准检测范围:62.5-4000pg/mL;灵敏度:20pg/mL)、人HGF ELISA试剂盒(目录号DHG00,批号307319,标准检测范围:125-8000pg/mL;灵敏度:<40pg/mL)、人PDGF-CC ELISA试剂盒(目录号DCC00,批号309376,标准检测范围:62.5-4000pg/mL;灵敏度:4.08pg/mL)、人PDGF-DD ELISA试剂盒(目录号DDD00,批号310518,标准检测范围:31.3-2000pg/mL;灵敏度:1.67pg/mL)得自R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN。HB-EGF ELISA试剂盒(目录号ab100531,批号GR135979-1,标准检测范围:16.4-4000pg/mL;灵敏度:20pg/mL)和NT3 ELISA试剂盒(目录号ab100615,批号GR141281-1,标准检测范围:4.12-3000pg/mL;灵敏度:<4pg/mL)得自abcam,Cambridge,MA。人GDNFELISA试剂盒(目录号RAB0205,批号0919130270,标准检测范围:2.74-2000pg/mL;灵敏度:2.74pg/mL)得自Sigma,St.Louis,MI。人肝配蛋白-B2ELISA试剂盒(目录号MBS916324,批号R21199424,标准检测范围:15.6-1000pg/mL;灵敏度:15.6pg/mL)和集聚蛋白ELISA试剂盒(目录号MBS454684,批号EDL201310110,标准检测范围:31.2-2000pg/mL;灵敏度:<13.6pg/mL)得自MyBioSource,Inc.,San Diego,CA。
hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基的制备:在第1天,将hUTC、ARPE-19和NHDF分别以10,000个活细胞/cm2接种于T75细胞培养***15mLhUTC生长培养基(DMEM低葡萄糖+15%v/v FBS+4mM L-谷氨酰胺)中。将细胞在37℃5% CO2培养箱中培养24h。在第2天,吸出培养基并补充21mL的DMEM/F12完全培养基(DMEM/F12培养基+10%v/v FBS+50U/ml青霉素/50μg/ml链霉素)。将细胞再培养48小时。另外单独将对照培养基(DMEM/F12完全培养基)培养48h。在第4天,收集细胞培养上层清液和对照培养基并以250g在4℃下离心5min,以0.5mL/管等分至冷冻管中,并且立即冷冻于-70℃冷冻机中。将冷冻样本解冻并用于ELISA。
结果
hUTC条件培养基中测量的所选RTK配体的水平汇总于表2-2中。
表2-2:hUTC条件培养基中BDNF、NT3、HGF、PDGF-CC、PDGF-DD、GDNF、肝配蛋白-B2、
HB-EGF和集聚蛋白的浓度
也将hUTC条件培养基中测量的所选RTK配体的水平与得自NHDF和ARPE-19条件培养基的那些比较(如归一化为pg/mL/1×106个细胞)。相比于NHDF和ARPE-19每48h每百万个细胞分别分泌20.4pg/mL和16.2pg/mL的BDNF,hUTC每48h每百万个细胞分泌72.7pg/mL的BDNF(图11A)。对照培养基中BDNF的量不可检测(图11G)。
hUTC和NHDF分泌较低量的NT3(图11B)。ARPE-19条件培养基和对照培养基中NT3的量不可检测。
相比于分别得自NHDF和ARPE-19的3.9pg/mL和0.4pg/mL,hUTC每48h每百万个细胞分泌23.7pg/mL的HGF(图11C)。对照培养基中HGF的量不可检测(图11G)。
hUTC CM中PDGF-CC和PDGF-DD的量相比于NHDF和ARPE-19CM中的那些示于图11D和图11E中。分别在对照培养基中检测到0.3pg/mL的PDGF-CC和3.1pg/mL的PDGF-DD。
相比于得自NHDF的8.5pg/mL的GDNF,hUTC每48h每百万个细胞分泌9.5pg/mL的GDNF。ARPE-19每48h每百万个细胞仅释放1.3pg/mL的痕量GDNF(图11F)。对照培养基中GDNF的量不可检测(图11G)。
hUTC、NHDF和ARPE-19条件培养基中肝配蛋白-B2和HB-EGF的水平低于ELISA的检测限(分别为15.6pg/mL和20pg/mL)。hUTC、NHDF和ARPE-19条件培养基中集聚蛋白的水平类似于对照培养基。
使用200ng/mL的剂量在RCS RPE吞噬测定中所测试的BDNF、HGF、PDGF-DD、肝配蛋白-B2和HB-EGF的效应均示出对拯救RCS RPE细胞的吞噬有积极效果(实施例1)。然而,条件培养基中hUTC分泌的这些配体的实际浓度似乎低于测试水平。
实施例3
hUTC条件培养基中的桥分子
RCS RPE细胞和hUTC两者的转录组表达谱均示出RCS RPE细胞表达在凋亡细胞上识别“吞噬我”信号的受体的基因(Erwig L-P,Cell Death and Differentiation 2008;15:243-250)。这些受体包括清道夫受体(SR-A、LOX-1、CD68、CD36、CD14)、整联蛋白(αvβ3和αvβ5)、Ax1和Tyro3的受体酪氨酸激酶、LRP-1/CD91、以及PS受体Stabilin 1。此外,hUTC表达多个桥分子基因,包括TSP-1、TSP-2、表面活性剂蛋白D(SP-D)、MFG-E8、Gas6、载脂蛋白H和膜联蛋白1。检测hUTC条件培养基中桥分子的分泌并将水平与得自ARPE-19和正常人真皮成纤维细胞(NHDF)的那些比较。
材料和方法
将hUTC(PDL20,母本细胞文库号25126057)、ARPE-19细胞(第3代)(ATCC,Manassas,VA)和NHDF(第11代)(Lonza,South Plainfield,NJ)用于研究。
人Gas6 ELISA试剂盒(目录号SK00098-01,批号20111218)和人SP-D ELISA试剂盒(目录号SK00457-01,批号20111135)得自Aviscera Bioscience,Santa Clara,CA。人Gas6ELISA试剂盒的标准检测范围为62.5-8000pg/mL,灵敏度为31pg/ml。人SP-D ELISA试剂盒的标准检测范围为78-5000pg/mL,灵敏度为30pg/ml。人MFG-E8 ELISA试剂盒(目录号DFGE80,批号307254,标准检测范围:62.5-4000pg/mL;灵敏度:4.04pg/mL)、人TSP-1 ELISA试剂盒(目录号DTSP10,批号307182,标准检测范围:7.81-500ng/mL;灵敏度:0.355ng/mL)、以及人TSP-2ELISA试剂盒(目录号DTSP10,批号307266,标准检测范围:0.31-20ng/mL;灵敏度:0.025ng/mL)得自R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN。载脂蛋白H ELISA试剂盒(目录号ab108814,批号GR126938,标准检测范围:0.625-40ng/mL,灵敏度:0.6ng/mL)得自Abcam,Cambridge,MA。人膜联蛋白I(ANX-I)ELISA试剂盒(目录号MBS704042,批号N10140947,标准检测范围:0.312-20ng/mL;灵敏度:0.078ng/mL)得自MyBioSource,Inc.,San Diego,CA。
表3-1吞噬细胞受体、桥分子和凋亡细胞上吞噬细胞结合位点的汇总
需注意酪氨酸激酶Tyro3和Ax1也为PS-桥分子受体并与Gas6结合。
hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基的制备:在第1天,将hUTC、ARPE-19和NHDF分别以10,000个活细胞/cm2接种于T75细胞培养***15mLhUTC生长培养基(DMEM低葡萄糖+15%FBS+4mM L-谷氨酰胺)中。在37℃5%CO2培养箱中培养24h。在第2天,吸出培养基并补充18mL的DMEM/F12完全培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))。将细胞再培养48小时。另外单独将对照培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))培养48h。在第4天,收集细胞培养上层清液和对照培养基并以250g在4℃下离心5min,以0.5mL/管等分至冷冻管中,并立即冷冻于-70℃冷冻机中。将冷冻样本解冻并用于ELISA。
结果
相比于分别得自ARPE-19和NHDF的每48h每百万个细胞的7.6ng和17.5ng的MFG-E8,hUTC每48h每百万个细胞分泌77.2ng的MFG-E8(图12A)。hUTC条件培养基中MFG-E8的浓度为15.5ng/mL。对照培养基中MFG-E8的量不可检测(图12E)。
相比于得自ARPE-19的183.9pg和得自NHDF的1101pg,hUTC每48h每百万个细胞分泌352.8pg的Gas6(图12B)。hUTC条件培养基中Gas6的浓度为70.6pg/mL。对照培养基中Gas6的量不可检测(图11G)
相比于得自ARPE-19的每48h每百万个细胞的4744.68ng的TSP-1和得自NHDF的2487.55ng,hUTC每48h每百万个细胞分泌759.2ng的TSP-1(图12C)。hUTC条件培养基中TSP-1的浓度为151.8ng/mL。在对照培养基中检测到4.0ng/mL的TSP-1(图12E)。
相比于得自NHDF的30ng的TSP-2,hUTC每48h每百万个细胞分泌44.2ng的TSP-2。ARPE-19每48h每百万个细胞释放0.08ng的可忽略量的TSP-2(图12D)。hUTC条件培养基中TSP-2的浓度为8.8ng/mL。在对照培养基中检测到痕量的TSP-2(0.02ng/mL)(图12E)。
hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基中载脂蛋白H的水平类似于对照培养基(6.8ng/mL)。hUTC、ARPE-19和NHDF条件培养基以及对照培养基中SP-D和膜联蛋白I的水平低于ELISA的检测限(分别<30pg/mL和<78pg/mL)。细胞不分泌这两种蛋白质,或者该水平低于检测限。
hUTC条件培养基中检测的桥分子及其浓度的汇总列于表3-2中。
表3-2:hUTC条件培养基中检测的桥分子的汇总
在所测量的桥分子中,MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2为参与RCS RPE细胞中hUTC-介导的吞噬拯救的桥分子候选。
桥分子调理的ROS的结合将激活整联蛋白和RTK信号转导途径,这将补偿Mertk转导途径的缺乏,并且导致吞噬拯救。
实施例4
hUTC条件培养基和桥分子对RCS RPE细胞吞噬视杆细胞外节盘膜(ROS)的影响
通过将RCS RPE细胞用经hUTC条件培养基预温育的ROS饲喂来检测hUTC条件培养基对ROS吞噬的直接影响(US 2010/0272803)。营养不良RPE细胞的吞噬作用被完全拯救。此处,研究hUTC条件培养基中存在或分泌的桥分子的效应。目前,ROS上鉴定的唯一“吞噬我”信号为磷脂酰丝氨酸(PS)(Finnemann等人,PNAS,2012;109(21):8145-8148)。
材料和方法
在实施例1中描述了RPE分离、RPE细胞的初级培养、RPE细胞的磺酰罗丹明染色、大鼠ROS的分离、ROS的FITC染色、吞噬测定、成像和定量、测定接受判据以及相对吞噬水平的方法。
hUTC条件培养基(CM):hUTC CM3用于研究。在第1天,将hUTC以10,000个活细胞/em2接种于T75细胞培养烧瓶中的hUTC生长培养基(DMEM低葡萄糖+15%FBS+4mM L-谷氨酰胺)中。在37℃5%CO2培养箱中培养24小时。在第2天,吸出培养基并补充21mL的DMEM/F12完全培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))。将细胞再培养48小时。另外单独将对照培养基(DMEM:F12培养基+10%FBS+青霉素(50U/ml)/链霉素(50μg/ml))温育48h。在第4天,收集细胞培养上层清液和对照培养基并以250g在室温下离心5min,以3mL/管等分至冷冻管中,并且立即冷冻于-70℃冷冻机中。
重组人桥分子:重组人MFG-E8(目录号2767-MF-050,批号MPP2012061)、重组人Gas6(目录号885-GS-050,批号GNT5013011)、重组人TSP-1(目录号3074-TH-050,批号MVF3613041)、重组人TSP-2(目录号1635-T2-050,批号HUZ1713021)均获自于R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN。单个蛋白质原液的重构遵循供应商的数据表:重组人MFG-E8、TSP-1和TSP-2分别以100μg/mL重构于无菌PBS中。重组人Gas6以100μg/mL重构于无菌水中。将重构原液等分并冷冻于-70℃的冷冻机中。
桥分子对RCS RPE细胞吞噬作用的影响:将ROS用对照培养基(DMEM+10%FBS)或CM3在37℃的CO2细胞培养培养箱中预温育24h。平行地,在37℃的CO2细胞培养培养箱中,将ROS在具有各种浓度的人重组MFG-E8、Gas6、TSP-1或TSP-2的对照培养基中预温育24h。在温育之后,将ROS离心而无需洗涤,重悬于MEM5中并在MEM5存在下喂饲给营养不良RPE细胞以进行吞噬测定。就对照而言,将单独的正常RPE或单独的营养不良RPE在MEM20中培养,然后在未经处理的ROS存在下(重悬于MEM20中并喂饲给RPE细胞)更换成MEM5以进行吞噬测定。
RTK配体对RCS PRE细胞吞噬作用的影响:将RCS RPE用重组人BDNF、HGF和GDNF各自温育24小时,然后添加OS进行吞噬测定。将用hUTC CM孵育的RCS RPE用作阳性对照。
siRNA敲低:On-TARGETplus人siRNA-SMARTpools(针对BDNF、HGF、GDNF、MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2)以及ON-TARGETplus Non-targeting pool(混杂siRNA库)购自GEDharmacon(Lafayette,CO)。使用DharmaFECT转染试剂(GE Dharmacon)分别将25nM的各个siRNA库引入hUTC中。
用于免疫荧光染色的抗体:桥分子(人MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2)的未缀合的单克隆抗体以及小鼠IgG2A和IgG2B同种型对照抗体获自于R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN。通过Life Technologies将这些抗体与TAlexa Fluor 488荧光团(Eugene,OR)缀合。通过Life Technologies(Eugene,OR)将未缀合的单克隆抗视紫红质抗体(EMD MilliporeCorp.,Temecula CA)与Alexa Fluor 568缀合。未缀合的小鼠IgG2b、x同种型对照抗体单克隆获自于Biolegend Inc.(San Diego,CA)并通过LifTechnologies(Eugene,OR)与AlexaFluor 488荧光团缀合。将其用作Alexa Fluor 568缀合的抗视紫红质抗体的同种型对照抗体。将Alexa Fluor 488缀合的小鼠IgG2A用作Alexa Fluor 488缀合的抗人MFG-E8、Gas6或TSP-2抗体的同种型对照抗体。将Alexa Fluor 488缀合的小鼠IgG2B用作Alexa Fluor 488缀合的人TSP-1抗体的同种型对照抗体。
免疫荧光:使10×106个OS在37℃下于1mL的hUTC CM、1mL的对照培养基、或1mL的包含124ng/mL MFG-E8、8.75ng/mL Gas6、1.2μg/mL TSP-1或238ng/mL TSP-2的对照培养基中温育24个小时。使OS沉淀,洗涤并包埋在于Tissue-Tek O.C.T化合物(Sakura FinetekUSA,Inc.,Torrance,CA)中。使用冰冻切片机(Leica CM1950,Leica Microsystems,Inc.,Buffalo Grove,Illinois)获得10iAm系列切片。将切片转移到载玻片上以用于免疫荧光染色。将具有OS切片的环状点样用封闭液(10%(v/v)山羊血清、1%(v/v)BSA和0.1%(v/v)Triton×100,在PBS中)在室温下处理1小时,然后用Alexa Fluor 568缀合的抗视紫红质抗体和Alexa Fluor 488缀合的抗-MFG-E8、抗-Gas6、抗-TSP-1、抗-TSP-2、或小鼠IgG2A或IgG2B同种型对照抗体在4℃下双重染色2小时。在用PBS洗涤三次之后,将切片封固于Vectashield封固剂(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)中并用配备有荧光显微镜的Zeiss Photomicroscope III(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)进行评估。图像用Kodak 290数字相机捕集并用Kodak Microscopy Documentation System 290Photoshop图像分析软件(Eastman Kodak,Rochester,NY)分析。图像以250×放大倍数利用适当的过滤器得到。
结果
如图13A和13B(实验1)以及图13C和13D(实验2)所示,未经处理的营养不良RPE细胞相比于正常RPE细胞吞噬减少。在测定期间不存在hUTC条件培养基的情况下,用hUTC条件培养基预孵育的营养不良RPE细胞完全拯救了吞噬。无论营养不良RPE细胞是否用hUTC条件培养基预处理,在整个吞噬测定中存在hUTC条件培养基时均观察到吞噬更为强劲的增强。用经hUTC条件培养基预处理的ROS喂养的营养不良RPE细胞在测定期间不存在hUTC条件培养基时显示出吞噬的恢复。
营养不良RPE细胞用经各种浓度的MFG-E8(15.5ng/mL;31ng/mL;62ng/mL;124ng/mL)、Gas6(70pg/mL;350pg/mL;1750pg/mL;8750pg/mL)、TSP-1(152ng/mL;304ng/mL;608ng/mL;1216ng/mL)或TSP-28.8ng/mL;26.4ng/mL;79.2ng/mL;237.6ng/mL)预温育的ROS喂养并测定吞噬作用(图14A-14D)。对每个样本进行十次观察。ROS的吞噬作用通过用经MFG-E8、Gas6、TSP-1或TSP-2预温育的ROS喂养RCS RPE细胞得到拯救。
MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2中的每者剂量依赖性地增大RCS RPE细胞中的吞噬水平(图14E-14H)。相似地,BDNF、HGF和GDNF以剂量依赖性增大RCS RPE细胞中的吞噬水平,HGF的效应即使在剂量最低时也是最强的。当以较高浓度施用时,RBDNF、HGF和GDNF能够拯救RCS RPE中的吞噬作用(图14I-J)。这些结果示出,重组的RTK配体和桥分子蛋白可模拟hUTC CM的作用并恢复RCS RPE的吞噬作用,并且参与RCS RPE中的hUTC-介导的吞噬拯救。
BDNF、HGF、GDNF、MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2通过siRNA介导的基因沉默而在hUTC中敲低。将不靶向任何基因的混杂siRNA库用作敲低对照。通过测量从经siRNA转染的hUTC中收集的细胞培养上层清液中各个因子的水平,检测各个因子的敲低效率(图15A)。模拟或混杂siRNA转染对hUTC分泌这些因子没有影响。定向MFG-E8、TSP-1、TSP-2和HGF的siRNA得到几乎100%的敲低效率;BDNF和GDNF分别观察到80%和65%的敲低(图15A)。hUTC中定向Gas6的siRNA不发挥作用(数据未示出)。CM由siRNA-转染的hUTC产生并将其施用于RCS RPE以鉴定RTK配体和桥分子敲低的效应。RCS RPE用经定向BDNF、HGF或GDNF的siRNA转染的hUTC所产生的CM培养(图15B),或者用经定向MFG-E8、TSP-1或TSP-2的siRNA转染的hUTC所产生的CM预处理的OS喂养(图15C)。将由未转染的hUTC和混杂siRNA转染的hUTC制得的CM用作敲低对照CM。与敲低对照CM相比,各个RTK配体的单独敲低消除了hUTC CM对吞噬拯救的影响(图15B)。各个桥分子的敲低减少了RCS RPE对OS的吞噬(图15C)。这些RTK配体和桥分子为RCS RPE中hUTC-介导的吞噬拯救所需。
每种单独桥分子和视紫红质的双重染色确保了对OS评估。视紫红质是定位于感光细胞OS中的视色素并且是OS染色的标志(Szabo K等人Cell Tissue Res.2014;356(1):49-63)。与单独重组人桥分子一起预温育的视紫红质染色的(Alexa Fluor 568缀合的,红色)微粒对四种桥分子抗体(Alexa Fluor 488缀合的,绿色)中的每者均呈正染,但不对AlexaFluor 488缀合的小鼠IgG2A或IgG2B同种型对照抗体染色呈正染(图16A)。类似的结果获自用hUTC CM温育的OS(图16B),而就对照培养基温育的OS而言并未观察到任何桥分子的染色(图16C)。抗视紫红质抗体的特异性通过用Alexa Fluor 568缀合的抗视紫红质抗体和Alexa Fluor 488缀合的小鼠IgG2b、x同种型对照抗体对OS微粒双重染色加以证实。OS仅对抗视紫红质抗体呈正染(图16D)。hUTC CM中桥分子MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2与OS上的视紫红质共同定位展示出桥分子结合于OS。
实施例5
hUTC保护RPE免受氧化性损伤
氧化应激反应可损害视网膜色素上皮的健康。研究hUTC和hUTC条件培养基改善暴露于氧化性损伤的RPE细胞的健康的效应。
材料和方法
过氧化氢(H2O2)、结晶紫和噻唑蓝溴化四唑(MTT)获自于Sigma-Aldrich(StLouis,MO)。
Ham的F10培养基、青霉素-链霉素溶液(5000单位/mL青霉素/5000μg/mL链霉素)、胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05%)、低葡萄糖DMEM、L-谷氨酰胺200mM获自于LifeTechnologies。
Hyclone FBS和甲醛购自Thermo Scientific。异丙醇、冰醋酸和盐酸购自FisherScientific(Pittsburgh,PA)。乙醇获得于Decon Labs Inc.(King of Prussia,PA)。PBS获自于Lonza(South Plainfield,NJ)。
ARPE生长培养基:使含有4.5g/L葡萄糖和丙酮酸钠而无L-谷氨酰胺和酚红的DMEM(Mediatech,Inc.A Corning Subsidiary,Manassas,VA)补充5%或10%加热灭活的胎牛血清(FBS,Life Technologies,Grand Island,NY)、1X极限必需培养基-非必需氨基酸(MEM-NEAA,Life Technologies)和0.01mg/mL庆大霉素试剂溶液(Life Technologies)。
包含10μM A2E的5% ARPE生长培养基:使DMEM(Mediatech,Inc.)补充5%加热灭活的FBS(Life Technologies)、1X MEM-NEAA(Life Technologies)、0.01mg/mL庆大霉素试剂溶液(Life Technologies)和10μM A2E(由Dr.Janet Sparrow的实验室制备)。
hUTC完全培养基:使DMEM低葡萄糖(Life Technologies)补充15%FBS(Thermo Scientific,Logan,Utah)和4mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)。
hUTC FBS培养基:使DMEM(Mediatech,Inc.)补充5%或10%加热灭活的FBS(LifeTechnologies)、1X MEM-NEAA(Life Technologies)、0.01mg/mL庆大霉素试剂溶液(LifeTechnologies)和4mM L-谷氨酰胺(Mediatech,Inc.)。
hUTC条件培养基:在37℃和5%CO2下,将hUTC(Research Bank NB12898P6,PDL20)以5000个细胞/cm2接种于2个T75培养***hUTC完全培养基(15mL)中。在接种后24小时,从各个烧瓶中移除培养基并用15mL 1X Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤3次。在第三次洗涤之后,将15mL的5%或10%FBS hUTC培养基添加到各个烧瓶中。也将15mL的5%或10%FBS hUTC培养基添加到2个空的T75烧瓶中并充当对照。使所有烧瓶返到37℃和5%CO2条件共48小时。在48小时之后,从各个烧瓶移除培养基并以250xg在4℃下离心5分钟。将培养基置于冰上并然后等分试样并在-80℃下保存。
用于A2E研究的ARPE-19细胞培养物:在第1天,将ARPE-19细胞以40,000个细胞/孔的密度接种于8-孔NuncTM Lab-TekTMII室玻片(Nalge Nunc International Corporation,Rochester,NY)中的最终体积为300μL的10%ARPE生长培养基中。在接种后第24小时(第2天),移除细胞上的培养基并用300μL 5%ARPE生长培养基替代。在一周后(第9天),再次移除培养基并用新鲜的5%ARPE生长培养基替代。在第14天,移除培养基并用包含10μM A2E的新鲜的5%ARPE生长培养基替代。在第17和21天,再次移除培养基并用新鲜的包含A2E的培养基替代。在第24天,移除包含A2E的培养基并用新鲜的5%ARPE生长培养基替代,并且使细胞静置五天。
在第29天,从各个孔移除培养基并用250μL的5或10%hUTC条件或对照培养基(5%和10%FBShUTC培养基未暴露于细胞)替代。在第32和35天,从细胞中移除条件和对照培养基并用新鲜的条件或对照培养基替代。
在第36天,从各个孔移除所有的培养基并将细胞用1X DPBS洗涤1次。随后将200μL新鲜DPBS添加到各个孔中,并且使细胞暴露于钨卤源传送的430nm光照中20分钟。在光暴露之后,移除DPBS并进行细胞生存力测定。
用于A2E研究的MTT测定:细胞毒性通过代谢性(MTT,(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)比色微量滴定测定(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)来测量。为进行MTT测定,将20μL的MTT标记试剂(Roche DiagnosticsCorporation)加入各个孔的0.2mL的5%培养基中。在温育4小时之后,再将200μL的增溶溶液添加到各个孔中温育过夜。在以13,000rpm离心2分钟之后,通过分光光度法在570nm处测量上清液(SpectaMax MJ,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。减少的MTT在570nm处吸光度的减小表示细胞生存力减弱。数据用Prism软件分析。
用于A2E研究的死亡红(Dead Red Assay)测定:在通过荧光排斥法测定(fluorescence exclusion assay)标记之后定量未存活的细胞,该荧光排斥法测定因在细胞死亡后期阶段期间质膜的完整性丧失而允许标记凋亡的核。在光照暴露之后,使细胞返回到5%ARPE生长培养基中。在蓝光暴露后八小时,将死亡细胞的核用不可渗透膜的染料死亡红(Dead Red,Life Technologies;1/500稀释,15min温育)染色并将所有核用4′,6′-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(Life Technologies)染色。简而言之,将细胞用预温热的(37℃)Hank平衡盐溶液(1X)HBSS(Life Technologies)洗涤两次。在室温下将250μL的死亡红工作液(8μL死亡红原液+4mL HBSS)添加到各个孔中15分钟。在15分钟之后,将细胞用HBSS洗涤两次。在室温下,将制备的300μL的4%甲醛(1X DPBS)添加到各个孔中30分钟。将细胞用1XDPBS洗涤3次并在室温下用DAPI(1X DPBS中制备的1∶300)工作液孵育5分钟。将细胞用1XDPBS洗涤3次。将玻片固定并盖上载玻片,并且通过计数各个孔中照明区域内至少5个显微镜视野中的DAPI-染色的和死亡红染色的核进行重复分析。值表示为死亡红染色的核/DAPI染色的核×100。
用于H2O2研究的细胞培养物:在37℃和5%CO2下,使ARPE-19细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection);Manassas,VA)在T75***包含10%FBS和50单位/mL青霉素/50μg/mL链霉素的Ham的F10培养基中作为单层生长。对于与hUTC的共培养实验,使ARPE19细胞在T-75烧瓶中生长至80-90%汇合度并随后接种于24-孔细胞培养板中。当将培养基更换为基础培养基(Ham的F10培养基,补充有2%FBS和50单位/mL青霉素/50μg/mL链霉素)时,使ARPE-19细胞在10%FBS生长培养基中生长直至接种后第3天。
在hUTC完全生长(低葡萄糖DMEM,补充有15%FBS和4mM L-谷氨酰胺)中,将hUTC以5000个细胞/em2接种到细胞培养***物(孔径1μm)上24小时。将***物转移至在细胞培养板上生长的ARPE-19细胞72小时并在hUTC完全培养基中生长。移除***物并用在无血清Ham的F10培养基中制备的H2O2(0-1500μM)处理ARPE-19细胞9小时。
用于H2O2研究的结晶紫细胞生存力测定:通过结晶紫摄取测定相对细胞生存力。在处理之后,将细胞固定于含4%低聚甲醛的PBS中并在0.1%结晶紫、10%乙醇的溶液中染色。在用水洗涤之后,将剩余的染色剂溶解于10%乙酸中并用微板读数器测量550nm处的吸光度。
用于H2O2型究的MTT测定:将细胞在37℃下用含0.25mg/mL MTT的无血清培养基孵育3小时。然后移除培养基并添加酸性异丙醇(1μL浓HCL/1mL异丙醇)以增溶产生的蓝甲(MTT代谢产物)。使用微板读数器,利用630nm处的背景波长测量550nm处的蓝甲密度。
结果
hUTC条件培养基使载有A2E的RPE细胞免受蓝光诱导的损伤。通过用膜不透性染料死亡红标记细胞并用DAPI标记所有核来评估照射后ARPE-19的生存力。数字图像中计数的核提供活细胞和非活细胞的百分比(图17A-17B)。在不存在430nm光照时,10μM A2E对ARPE-19生存力没有影响。用对照培养基孵育且经受430nm光照的细胞显示出高水平的非活细胞(约50%)。相比之下,用hUTC条件培养基处理导致非活细胞的数目降低(约20%)。
细胞生存力也通过MTT测定进行测量,所述MTT测定基于健康细胞将黄色四唑嗡盐MTT裂解成紫色甲晶体的能力(图17C-17D)。甲产物与培养中的活细胞数目成比例。用对照培养基处理且暴露于光照的ARPE-19细胞显示出相比于载有10μM A2E且未暴露于光照的ARPE-19细胞生存力降低。用5或10%hUTC条件培养基处理的细胞显示出比暴露于对照培养基的那些更高的生存力。
在全部H2O2处理之后,通过结晶紫和MTT测定来测定ARPE19细胞生存力(图17E-17F)。与hUTC共培养的ARPE-19细胞相比于未经处理的对照细胞示出在用1500μM H2O2处理之后生存力提高。
实施例6
从产后组织中衍生细胞
该实施例描述由胎盘和脐带组织制备的产后衍生细胞。产后脐带和胎盘在足月或者早产妊娠出生时获得。从五个独立的脐和胎盘组织的供体收获得到细胞。测试不同的细胞分离方法得到如下细胞的能力:1)分化成具有不同表型的细胞的潜力(干细胞的共同特征);或者2)提供可用于其它细胞和组织的营养因子的潜力。
方法及材料
脐细胞分离:脐带得自National Disease Research Interchange(NDR1,Philadelphia,Pa.)。在正常分娩后获得所述组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为移除血液和碎片,将脐带在抗真菌剂和抗生素(100单位/毫升青霉素,100微克/毫升链霉素,0.25微克/毫升两性霉素B)存在下于磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中洗涤。然后将组织在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖;Invitrogen)存在下于150cm2组织培养板中进行机械离解,直至组织切碎成细浆。将切碎的组织转移到50毫升锥形管(约每管5克组织)。
然后在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基(每种均含有如上所述的抗真菌剂和抗生素)中消化组织。在一些实验中,使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”,胶原酶(Sigma,St Louis,Mo.),500单位/毫升;和分散酶(Invitrogen),50单位/毫升,DMEM-低葡萄糖培养基中)。在其它实验中,使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶(“C:D:H”)的混合物(胶原酶,500单位/毫升;分散酶,50单位/毫升;和透明质酸酶(Sigma),5单位/毫升,DMEM-低葡萄糖中)。将包含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃下于225rpm的轨道式震荡器(Environ,Brooklyn,N.Y.)中温育2小时。
消化后,将组织在150xg下离心5分钟,并吸出上清液。将沉淀物重悬于20毫升的生长培养基(DMEM-低葡萄糖(Invitrogen)、15%(v/v)胎牛血清(FBS;特级牛血清;目录号AND18475;Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)2-巯基乙醇(Sigma)、1毫升/100毫升抗生素和/或抗真菌剂,如上所述)。使细胞悬液通过70微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences)过滤。使另外5毫升包含生长培养基的漂洗液通过滤网。然后使细胞悬液通过40微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences),随后使另外5毫升生长培养基的漂洗液通过。
将滤液重悬于生长培养基(总体积为50毫升)中,并在150xg下离心5分钟。吸出上清液,并将细胞重悬于50毫升新鲜生长培养基中。该过程再重复两次。
在最后一次离心后,吸出上清液,并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色确定活细胞数量。然后在标准条件下培养细胞。
将从脐带分离的细胞以5,000个细胞/cm2接种到明胶包被的T-75cm2烧瓶(CorningInc.,Coming,N.Y.)的含如上所述抗生素/抗真菌剂的生长培养基中。2天后(在各实验中,细胞孵育2-4天),从烧瓶中吸出消耗培养基。用PBS洗涤细胞三次,以去除碎片和血源性细胞。然后为细胞补充生长培养基,使细胞生长至汇合(从0代至1代需约10天)。在后续的传代中(从1代至2代,以此类推),细胞在4-5天内达到近汇合(75-85%汇合)。对于这些后续的传代,细胞以5000个细胞/cm2接种。将细胞在5%二氧化碳和大气氧、37℃下培养于湿化培养箱中。
胎盘细胞分离:胎盘组织获自于NDRI(Philadelphia,Pa.)。组织来自于孕妇并在正常手术分娩时获得。胎盘细胞如脐细胞分离所述的那样分离。
以下实施例应用从胎盘组织分离的母体衍生的细胞和新生儿衍生的细胞的独立群体。
在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。将胎盘组织在抗真菌剂和抗生素(如上所述)存在下于磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中洗涤以移除血液和碎片。然后将胎盘组织解剖成三个部分:顶部系(新生儿侧或区段);中间系(新生儿和母体的混合细胞分离物)和底部系(母体侧或区段)。
将分离的部分各自用含抗生素/抗真菌剂的PBS洗涤数次,以进一步移除血液和碎片。然后将各部分在50毫升的DMEM-低葡萄糖存在下于150cm2组织培养板中进行机械离解至细浆。将整个浆转移到50毫升锥形管。各个管包含约5克的组织。将组织在DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖培养基中消化,所述培养基包含抗真菌剂和抗生素(100U/毫升的青霉素、100微克/毫升的链霉素、0.25微克/毫升的两性霉素B)和消化酶。在一些实验中,使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”),该混合物包含DMEM-低葡萄糖培养基中的500单位/毫升的胶原酶(Sigma,St Louis,Mo.)和50单位/毫升的分散酶(Invitrogen)。在其它实验中,使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶(C:D:H)的混合物(胶原酶,500单位/毫升;分散酶,50单位/毫升;和透明质酸酶(Sigma),5单位/毫升,DMEM-低葡萄糖中)。将包含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃下于225rpm的轨道式震荡器(Environ,Brooklyn,N.Y.)中温育2h。
消化后,将组织在150xg下离心5分钟,抽走所得的上清液。使沉淀物重悬于20毫升的具有青霉素/链霉素/两性霉素B的生长培养基中。使细胞悬液通过70微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences),随后使具有另外5毫升生长培养基的漂洗液通过。使全部细胞悬液通过40微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences),随后使另外5毫升生长培养基作为漂洗液通过。
将滤液重悬于生长培养基(总体积为50毫升)中,并在150xg下离心5分钟。吸出上清液,并将细胞沉淀物重悬于50毫升新鲜培养基中。该过程再重复两次。在最后一次离心后,吸出上清液,并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色排除测试来测定细胞计数。然后在标准条件下培养细胞。
释放酶细胞分离:将细胞从具有释放酶(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)(2.5毫克/毫升,Blendzyme 3;Roche Applied Sciences,Indianapolis,Ind.)和透明质酸酶(5单位/毫升,Sigma)的DMEM-低葡萄糖培养基中的脐组织分离。组织消化和细胞分离如上文对于其它蛋白酶消化描述的,使用释放酶/透明质酸酶混合物代替C:D或C:D:H酶混合物。用LIBERASE的组织消化导致从产后组织中分离容易扩增的细胞群。
使用其它酶组合进行细胞分离:比较使用不同酶组合从脐带中分离细胞的操作。用于消化比较的酶包括:i)胶原酶;ii)分散酶;iii)透明质酸酶;iv)胶原酶:分散酶混合物(C:D);v)胶原酶:透明质酸酶混合物(C:H);vi)分散酶:透明质酸酶混合物(D:H);以及vii)胶原酶:分散酶:透明质酸酶混合物(C:D:H)。观察到利用这些不同的酶消化条件在细胞分离中的差异(表6-1)。
细胞从脐带中的残留血液中分离:作出通过不同方法从脐带中分离细胞库的其它尝试。在一个例子中,将脐带切片并用生长培养基洗涤,以去除血块和凝胶状材料。收集血液、凝胶状材料和生长培养基的混合物,并且以150xg离心。将沉淀物重悬并接种到明胶包被的烧瓶上的生长培养基中。根据这些实验,分离容易扩增的细胞群。
细胞从脐带血中分离:细胞还已从得自NDR1的脐带血液样本中分离。此处使用的分离方案为Ho等人的国际专利申请WO 2003/025149的方案(Ho,T.W.等人,“CellPopulations Which Co-Express CD49C and CD90,”申请PCT/US02/29971)。将脐带血液样本(分别为50毫升和10.5毫升)(NDR1,Philadelphia Pa.)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155mM氯化铵、10毫摩尔每升碳酸氢钾、0.1毫摩尔每升EDTA缓冲至pH 7.2(所有组分均来自Sigma,St.Louis,Mo.))混合。细胞以1∶20脐带血与裂解缓冲液的比率进行裂解。将所得的细胞悬浮液涡旋5秒,并且在环境温度下温育2分钟。将裂解产物离心(以200xg 10分钟)。将细胞沉淀物重悬于完全极限必需培养基(Gibco,Carlsbad,Calif.),所述培养基含有10%胎牛血清(Hyclone,Logan Utah)、4毫摩尔每升谷氨酰胺(Mediatech,Herndon,Va.)、每100毫升100单位的青霉素和每100毫升100微克的链霉素(Gibco,Carlsbad,Calif.)。将重悬的细胞离心(以200xg 10分钟),抽吸上清液,并且在完全培养基中洗涤细胞沉淀物。将细胞直接接种到T75烧瓶(Corning,N.Y.)、T75层粘连蛋白包被的烧瓶、或T175纤粘蛋白包被的烧瓶(两者均来自Becton Dickinson,Bedford,Mass.)内。
使用不同酶组合和生长条件分离细胞:为了测定细胞群是否可在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增,根据上文提供的操作,使用C:D:H的酶组合,将细胞在含有或不含0.001%(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)的生长培养基中消化。在各种条件下接种如此分离的胎盘衍生的细胞。使所有细胞均在青霉素/链霉素的存在下生长(表6-2)。
使用不同酶组合和生长条件分离细胞:在所有条件下,细胞在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表6-2)。在条件5-8和13-16中的细胞证实在接种后良好增殖最多至4次传代,在这时它们进行冷冻保存并存库。
结果
使用不同酶组合进行细胞分离:C:D:H的组合提供在分离后的最佳细胞收率,并且生成在培养中比其它条件扩增更多代的细胞(表6-1)。可扩增的细胞群无法使用单独的胶原酶或透明质酸酶获得。不作出测定该结果是否特定于测试的胶原的尝试。
表6-1:使用多种酶组合从脐带组织中分离细胞
关键:+=良好;++=非常良好,+++=优异,X=未成功
使用不同酶组合和生长条件分离细胞:细胞在对于酶消化和生长的测试的所有条件下在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表6-2)。在实验条件5-8和13-16中的细胞在接种后良好增殖最多至4次传代,在这时它们进行冷冻保存。所有细胞均冷冻保存用于进一步探索。
表6-2:多种条件下的产后细胞的分离和培养扩增
从脐带的残留血液中分离细胞:有核细胞快速贴壁并生长。这些细胞通过流式细胞术进行分析,并且类似于通过酶消化获得的细胞。
从脐带血中分离细胞:所述制剂含有红血细胞和血小板。在前3周过程中有核细胞未贴壁并***。在接种后3周更换培养基,并且未观察到细胞贴壁并生长。
总结:细胞群可使用酶组合胶原酶(基质金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(分解透明质酸的粘液溶解酶)有效地来源于脐带和胎盘组织。也可使用释放酶(Blendzyme)。具体地,Blendzyme 3为胶原酶(4Wunsch单位/g)和嗜热菌蛋白酶(1714酪蛋白单位/g),也连同透明质酸酶一起用于分离细胞。当在经明胶包被的塑料上的生长培养基中培养时,这些细胞容易地经过多次传代扩增。
细胞还从脐带中的残留血液而不是脐带血中分离。从组织中洗涤的血块中的细胞的存在可能是由于在解剖过程期间释放的细胞,所述血块中的细胞在使用的条件下贴壁并生长。
实施例7
产后衍生细胞的染色体核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选是同质的并且不含任何污染细胞类型。在细胞疗法中使用的细胞应具有正常的染色体数目(46)和结构。为了鉴定胎盘和脐衍生的细胞系是同质的并且不含非产后组织起源的细胞,分析细胞样本的核型。
方法及材料
将来自男性新生儿的产后组织的PPDC在包含青霉素/链霉素的生长培养基中进行培养。选择来自男性新生儿(X,Y)的产后组织,以允许区别新生儿衍生的细胞和母体衍生的细胞(X,X)。细胞以5,000个细胞/平方厘米接种到T25烧瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的生长培养基中,并且扩增至80%汇合。含有细胞的T25烧瓶用生长培养基填充至颈部。通过快递将样本递送至临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室运输时间为一小时)。细胞在中期过程中进行分析,在所述中期时染色体是最佳显现的。在计数的处于中期的二十个细胞中,五个就正常同质核型数目(二)进行分析。如果观察到两个核型,则细胞样本表征为同质的。如果观察到超过两个核型,则细胞样本表征为异质的。当鉴定异质核型数目(四)时,计数并分析另外的中期细胞。
结果
送往染色体分析的所有细胞样本均被解释为显示出正常外观。分析的16种细胞系中的三种显示出异质表型(XX和XY),指示来源于新生儿和母体起源的细胞的存在(表7-1)。组织胎盘-N衍生的细胞从胎盘的新生儿区段分离。在第零代,该细胞系似乎为同质XY。然而,在第九代,细胞系为异质(XX/XY),指示先前未检测到母体起源的细胞的存在。
表7-1:PPDC的核型结果
关键:N-新生儿侧;V-绒状区域;M-母体侧;C-克隆
总结:染色体分析鉴定胎盘和脐衍生的细胞,如由临床细胞遗传学实验室解释的,所述细胞的核型看起来是正常的。核型分析还鉴定不含母体细胞的细胞系,如由同质核型测定的。
实施例8
通过流式细胞术评估人产后衍生细胞表面标志物
通过流式细胞术的细胞表面蛋白或“标志物”的表征可用于测定细胞系的身份。表达的一致性可由多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞中进行测定。从胎盘和脐中分离的产后衍生细胞(PPDC)系(通过流式细胞术)进行表征,提供用于鉴定这些细胞系的谱。
方法及材料
培养基和培养容器:将细胞培养于含青霉素/链霉素的生长培养基(GibcoCarlsbad,Calif.)中。将细胞培养于等离子处理的T75、T150和T225组织培养烧瓶(CorningInc.,Corning,N.Y.)直至汇合。通过在室温下温育2%(w/v)明胶(Sigma,St.Louis,Mo.)20分钟,使***生长表面包被有明胶。
抗体染色和流式细胞术分析:在PBS中洗涤烧瓶中的贴壁细胞,并用胰蛋白酶/EDTA分离。将细胞收获、离心并以每毫升1×107个的细胞浓度重悬于PBS中的3%(v/v)FBS中。根据制造商说明书,将所关注的细胞表面标志物的抗体(见下)添加到一百微升细胞悬液中,并将混合物在4℃下于黑暗中孵育30分钟。在孵育之后,将细胞用PBS洗涤并离心以移除未结合的抗体。将细胞重悬于500微升PBS中,并通过流式细胞术进行分析。用FACScaliburTM仪器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)进行流式细胞术分析。表8-1列出所用细胞表面标志物的抗体。
表8-1:用于表征细胞表面标志物的抗体。
胎盘和脐比较:将胎盘衍生的细胞与脐衍生的细胞在第8代时进行比较。
代与代的比较:胎盘和脐衍生的细胞在第8、15和20代时进行分析。
供体与供体的比较:为比较供体间的差异,将得自不同供体的胎盘衍生的细胞进行互相比较,并且将得自不同供体的脐衍生的细胞进行互相比较。
表面被覆物比较:将在明胶包被的烧瓶上培养的胎盘衍生的细胞与在未经包被的烧瓶上培养的胎盘衍生的细胞进行比较。将在明胶包被的烧瓶上培养的脐衍生的细胞与在未经包被的烧瓶上培养的脐衍生的细胞进行比较。
消化酶比较:比较了用于细胞分离和制备的四种处理。比较通过用以下项处理从胎盘中分离的细胞:1)胶原酶;2)胶原酶/分散酶;3)胶原酶/透明质酸酶;以及4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶。
胎盘层比较:将胎盘组织的母体区段衍生的细胞与胎盘组织的绒状区域衍生的细胞和胎盘的新生胎儿侧衍生的细胞进行比较。
结果
胎盘和脐的比较:通过流式细胞术分析的胎盘和脐衍生的细胞显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达,如由相对于IgG对照增加的荧光值所指示的那样。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的可检测表达是阴性的,如与IgG对照相当的荧光值所指示。考虑了阳性曲线的荧光值的变化。阳性曲线的平均值(即CD13)和范围(即CD90)显示一些变化,但该曲线呈正态,证明是同质群体。两种曲线各自显示大于IgG对照的值。
代与代的比较-胎盘衍生的细胞:通过流式细胞术分析的第8、15和20代的胎盘衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达均呈阳性,如相对于IgG对照增加的荧光值所反映的那样。细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达呈阴性,具有与IgG对照一致的荧光值。
代与代间的比较-脐衍生的细胞:通过流式细胞术分析的在第8、15和20代时的脐衍生的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C(由相对于IgG对照增加的荧光指示)。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示。
供体与供体间的比较-胎盘衍生的细胞:通过流式细胞术分析的从独立供体分离的胎盘衍生的细胞各自表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C,荧光值相对于IgG对照增加。细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示的那样。
供体与供体间的比较-脐衍生的细胞:通过流式细胞术分析的从独立供体分离的脐衍生的细胞各自显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达(在相对于IgG对照增加的荧光值中反映)。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,其中荧光值与IgG对照一致。
具有明胶的表面被覆物对胎盘衍生的细胞的影响:通过流式细胞术分析的在经明胶包被或未经包被的烧瓶上扩增的胎盘衍生的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C(在相对于IgG对照增加的荧光值中反映)。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示。
具有明胶的表面被覆物对脐衍生的细胞的影响:通过流式细胞术分析的在经明胶包被的烧瓶和未经包被的烧瓶上扩增的脐衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达均呈阳性,具有相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,其中荧光值与IgG对照一致。
用于制备细胞的酶消化法对细胞表面标志物分布的影响:通过流式细胞术分析的用各种消化酶分离的胎盘衍生的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C,如由相对于IgG对照增加的荧光值所指示的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示的。
胎盘层比较:由流式细胞术分析的分别从胎盘的母体、绒毛和新生儿层分离的细胞显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达,如由相对于IgG对照增加的荧光值所指示的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示的。
总结:通过流式细胞术分析胎盘和脐衍生的细胞已确定这些细胞系的身份。胎盘和脐衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、B、C是阳性的,并且对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该身份与变量中的变化一致,所述变化包括供体、传代、培养容器表面涂层、消化酶和胎盘层。观察到单独荧光值直方曲线平均值和范围中的一些变化,但在所测试的所有条件下的所有阳性曲线均为正态的并且显示荧光值大于IgG对照,由此证实了细胞包含具有标志物的阳性表达的同质群体。
实施例9
产后组织表型的免疫组织化学表征
通过免疫组织化学分析在人产后组织(即脐带和胎盘)内发现的细胞的表型。
方法及材料
组织制备:收获得到人脐带和胎盘组织并在4℃下浸没于4%(w/v)低聚甲醛中固定过夜。使用针对以下的表位的抗体进行免疫组织化学分析:波形蛋白(1∶500;Sigma,St.Louis,Mo.)、结蛋白(1∶150,针对兔产生;Sigma;或1∶300,针对小鼠产生;Chemic on,Temecula,Calif.)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA;1∶400;Sigma)、细胞角蛋白18(CK18;1∶400;Sigma)、血管性血友病因子(vWF;1∶200;Sigma)以及CD34(人CD34III类;1∶100;DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外,测试以下标志物,抗人GROα--PE(1∶100;Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J)、抗人GCP-2(1∶100;Santa Cruz Biotech,SantaCruz,Calif)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1;1∶100;Santa Cruz Biotech)、以及抗人NOGO-A(1∶100;Santa Cruz Biotech)。将固定的标本用外科手术刀修剪并置于包含乙醇的干冰浴上的OCT包埋的化合物(Tissue-Tek OCT;Sakura,Torrance,Calif)内。然后使用标准冰冻切片机(徕卡显微***(Leica Microsystems))对冰冻块进行切片(10μm厚),并安装于载玻片上进行染色。
免疫组织化学:免疫组织化学类似于以前研究进行(例如Messina等人,2003,Exper.Neurol.184:816-829)。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗组织切片后,将其与含PBS、4%(v/v)的山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)和0.3%(v/v)的Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液接触1小时以进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下,在流程的所有步骤中省略Triton以防止表位丢失。此外,在一抗通过免疫山羊制备(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下,在整个流程中使用3%(v/v)驴血清替代山羊血清。一抗在阻断溶液中稀释后,施加到切片上并在室温下保持4小时。去除一抗溶液,并且在施加含阻断剂连同山羊抗-小鼠IgG--德克萨斯红(1∶250;MolecularProbes,Eugene,Oreg.)和/或山羊抗兔IgG--Alexa 488(1∶250;Molecular Probes)或驴抗山羊IgG--FITC(1∶150;Santa Cruz Biotech)的二抗溶液(室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用适当的奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)观察荧光。阳性染色表示为超过对照染色的荧光信号。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)捕获代表性图像。对于三柒样本,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用AdobePhotoshop软件(Adobe,San Jose,Calif.)制作分层剪辑。
结果
脐带表征:波形蛋白、结蛋白、SMA、CKI8、vWF和CD34标志物在脐带内存在的细胞亚群中表达。具体地,vWF和CD34表达局限于脐带内所含的血管。CD34+细胞位于最内层(内腔侧)。在脐带的所有基质和血管中存在波形蛋白表达。SMA限制于基质以及动脉和静脉的外壁上,但不包含在血管自身内。CK18和结蛋白仅在血管中观察到,结蛋白局限于中层和外层。
胎盘表征:波形蛋白、结蛋白、SMA、CKI8、vWF和CD34均在胎盘内观察到并且是区域特异性的。
GROalpha、GCP-2、ox-LDL RI和NOGO-A组织表达:这些标志物无一在脐带或胎盘组织内观察到。
总结:波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、血管性血友病因子和CD34在人脐带和胎盘内的细胞中表达。
实施例10
使用寡核苷酸阵列分析产后组织衍生的细胞
使用Affymetrix GENECHIP阵列,对脐和胎盘衍生的细胞与成纤维细胞、人间充质干细胞和源自人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱进行比较。该分析提供了产后衍生细胞和这些细胞经鉴定的独特分子标志物的表征。
方法及材料
细胞的分离和培养:经患者同意在正常足月分娩后从国家疾病研究交流会(NDRI,Philadelphia,Pa.)获得人脐带和胎盘。收到组织后,如实施例6所述的那样分离细胞。将细胞培养于明胶包被的组织培养塑料瓶上的生长培养基(使用DMEM-LG)中。将培养物在37℃和5%CO2下孵育。
人真皮成纤维细胞购自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.;批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。将两种细胞系均培养于含10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中。细胞生长于标准组织处理的塑料制品上。
人间充质干细胞(hMSC)购自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.;批号2F1655、2F1656和2F1657)并根据制造商说明书在MSCGM培养基(Cambrex)中培养。细胞在37℃和5%CO2下生长于标准组织培养塑料制品上。
经患者同意,从NDRI接收人髂嵴骨髓。骨髓根据Ho等人(W003/025149)概括的方法处理。以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率,将骨髓与裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3和0.1mM EDTA,pH7.2)混合。对细胞悬浮液进行涡旋,在环境温度下温育2分钟,并在500xg下离心10分钟。弃去上清液,将细胞沉淀物重悬于补充有10%(v/v)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的极限必需培养基α(Invitrogen)中。再次离心细胞,并将细胞沉淀物重悬于新鲜培养基中。使用台盼蓝染色排除法(Sigma,St.Louis,Mo.)计算存活的单核细胞。将单核细胞以5×104个细胞/cm2接种于组织培养塑料瓶中。在标准大气O2或5%O2下,并于37℃和5%CO2下孵育细胞。将细胞培养5天而不更换培养基。在培养5天后,除去培养基和非贴壁细胞。在培养中维持贴壁细胞。
mRNA的分离和GENECHIP分析:使用细胞刮刀将活跃生长的细胞培养物从烧瓶移除到冷PBS中。以300xg将细胞离心5分钟。除去上清液,并将细胞重悬浮于新鲜PBS中,再次离心。除去上清液,并将细胞沉淀物立即冻存于-80℃。提取细胞mRNA,将其转录成cDNA,再转录成cRNA并用生物素标记。将生物素标记的cRNA与HG-U133A基因芯片寡核苷酸阵列(Affymetrix,Santa Clara Calif.)杂交。根据制造商说明书进行杂交和数据收集。使用“微阵列显著性分析”(SAM)1.21版计算机软件进行分析(Stanford University;Tusher,V.G.等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5116-5121)。
结果
分析十四个不同细胞群。细胞连同传代信息、培养基底和培养基一起列于表10-1中。
表10-1:微阵列研究分析的细胞。细胞系通过其识别码连同在分析时的传代、细胞 生长基底和生长培养基一起列出。
细胞群 | 传代 | 基底 | 培养基 |
脐(022803) | 2 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
脐(042103) | 3 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
脐(071003) | 4 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
胎盘(042203) | 12 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
胎盘(042903) | 4 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
胎盘(071003) | 3 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
ICBM(070203)(5%O2) | 3 | 塑料 | MEM 10%FBS |
ICBM(062703)(标准O2) | 5 | 塑料 | MEM 10%FBS |
ICBM(062703)(5%O2) | 5 | 塑料 | MEM 10%FBS |
hMSC(Lot 2F1655) | 3 | 塑料制品 | MSCGM |
hMSC(Lot 2F1656) | 3 | 塑料 | MSCGM |
hMSC(Lot 2F1657) | 3 | 塑料 | MSCGM |
人成纤维细胞(9F0844) | 9 | 塑料 | DMEM-F12,10%FBS |
人成纤维细胞(CCD39SK) | 4 | 塑料 | DMEM-F12,10%FBS |
通过主成分分析对细胞中差异表达的290个基因进行分析,从而评估数据。该分析可以对群体间相似性进行相对比较。
表10-2示出了计算用于比较细胞对的欧氏距离。欧氏距离基于按照不同细胞类型间差异表达的290个基因得出的细胞比较结果。欧氏距离与290个基因的表达间的相似性成反比(即,距离越大,存在越小的相似性)。
表10-2:细胞对的欧氏距离。
表10-3、10-4和10-5示出了在胎盘衍生的细胞中增加的基因表达(表10-3)、在脐衍生的细胞中增加的基因表达(表10-4)、以及在脐和胎盘衍生的细胞中减少的基因表达(表10-5)。名称为“探针组ID”的一列是指位于芯片特定位置上的若干寡核苷酸探针的组的制造商识别码,这些探针杂交于指定的基因(“基因名称”列),所述基因包含可以指定登录号(“NCBI登录号”列)在NCBI(基因库)数据库中找到的序列。
表10-3:表现出与测定的其它细胞系相比在胎盘衍生的细胞中具有特定增加的表 达量的基因。
表10-4:表现出与测定的其它细胞系相比在脐衍生的细胞中具有特定增加的表达 量的基因。
表10-5:表现出与测定的其它细胞系相比在脐和胎盘衍生的细胞中具有减小的表 达量的基因。
表10-6、10-7和10-8示出了在人成纤维细胞(表10-6)、ICBM细胞(表10-7)和MSC(表10-8)中增加的基因表达。
表10-6:表现出与测定的其它细胞系相比在成纤维细胞中具有增加的表达量的基 因。
表10-7:表现出与测定的其它细胞系相比在ICBM来源细胞中具有增加的表达量的 基因。
表10-8:表现出与测定的其它细胞系相比在MSC细胞中具有增加的表达量的基因。
总结:进行本检测以提供源于脐带和胎盘的产后细胞的分子表征。该分析包括源于三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。该检测还包括两个不同的表皮成纤维细胞系、三种间充质干细胞系和三种髂嵴骨髓细胞系。使用包含22,000个基因的探针的寡核苷酸阵列分析这些细胞表达的mRNA。结果表明290个基因在这五个不同细胞类型中差异表达。这些基因包括在胎盘衍生的细胞中特异性增加的十种基因和在脐带衍生的细胞中特异性增加的七种基因。发现五十四个基因与其它细胞类型相比在胎盘和脐带中具有特定降低的表达水平。所选基因的表达已通过PCR加以证实(参见之后的实施例)。这些结果证实例如与骨髓来源细胞和成纤维细胞相比,产后衍生细胞具有独特基因表达谱。
实施例11
产后衍生细胞中的细胞标志物
在前述实施例中,从胎盘和人脐带衍生的细胞的相似性和差异性通过将其基因表达谱与其它来源衍生的细胞的那些进行比较(使用寡核苷酸阵列)来评估。鉴定六个“标签”基因:氧化LDL受体1、白介素-8、凝乳酶、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3(CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)。这些“标签”基因在产后衍生细胞中以相对较高的水平表达。
进行该实施例中所述的程序以验证微阵列数据并寻找基因和蛋白表达之间的一致/不一致,以及建立一系列可靠测定法,用于检测胎盘和脐衍生的细胞的唯一识别符。
方法及材料
细胞:使胎盘衍生的细胞(三种分离物,包括主要为新生儿的一种分离物,如由染色体核型分析所鉴定)、脐衍生的细胞(四种分离物)、以及正常人真皮成纤维细胞(NHDF;新生儿和成人)生长于经明胶包被的T75***含有青霉素/链霉素的生长培养基中。间充质干细胞(MSCS)生长于间充质干细胞生长培养基套装(MSCGM;Cambrex,Walkerville,Md.)。
对于IL-8方案,将细胞从液氮解冻,并以5,000个细胞/cm2铺平板于经明胶包被的烧瓶中,在生长培养基中生长48小时,并随后在10毫升血清饥饿培养基[DMEM-低葡萄糖(Gibco,Carlsbad,Calif.),青霉素/链霉素(Gibco,Carlsbad,Calif.)和0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA;Sigma,St.Louis,Mo.)]中再生长8小时。该处理之后,提取RNA并将上清液以150xg离心5分钟以去除细胞碎片。然后将上清液在-80℃下冷冻,以进行ELISA分析。
用于ELISA测定的细胞培养物:将来源于胎盘和脐的产后细胞以及来源于人新生儿***的人成纤维细胞培养于明胶包被的T75***生长培养基中。在液氮中冷冻11代的细胞。将细胞解冻并转移到15毫升离心管中。在150xg下离心5分钟后,弃去上清液。将细胞重悬于4毫升培养基中并计数。将细胞以375,000个细胞/烧瓶在含有15毫升生长培养基的75cm2烧瓶中培养24小时。将培养基更换为血清饥饿培养基并培养8小时。在温育结束时收集血清饥饿培养基,以14,000xg离心5分钟(并保存于-20℃下)。
为了估算每个烧瓶中细胞的数量,在每个烧瓶中添加2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)。将细胞从烧瓶中分离后,用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移到15毫升离心管中并以150xg离心5分钟。去除上清液,并将1毫升生长培养基添加至每管中以重悬细胞。使用血球计估算细胞数量。
ELISA测定:使用ELISA测定法(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)分析由细胞分泌到血清饥饿培养基中的IL-8的量。根据制造商提供的使用说明,测试所有测定法。
总RNA分离:从汇合的产后衍生细胞和成纤维细胞提取RNA,或对于IL-8表达,由如上所述处理的细胞提取RNA。根据制造商的说明书(小量提取试剂盒;Qiagen,Valencia,Calif)用350微升包含β-巯基乙醇的缓冲液RLT(Sigma,St.Louis,Mo.)裂解细胞。根据制造商的说明书(小量提取试剂盒;Qiagen,Valencia,Calif)提取RNA并使其经受DNase处理(2.7U/样本)(Sigma St.Louis,Mo.)。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。
逆转录:也从人胎盘和脐中提取RNA。将组织(30毫克)悬浮于700微升含有2-巯基乙醇的缓冲液RLT中。将样本进行机械匀浆,并根据制造商说明书进行RNA提取。RNA用50微升经DEPC处理的水提取并保存于-80℃下。使用随机六聚体和逆转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)以25℃下10分钟、37℃下60分钟和95℃下10分钟,对RNA进行逆转录。将样本保存于-20℃下。
使用实时和常规PCR进一步研究cDNA微阵列识别为产后细胞中独特调控的基因(标签基因——包括氧化LDL受体、白介素-8、凝乳酶和浆膜蛋白)。
实时PCR:PCR使用基因表达产品在cDNA样本上进行:根据制造商的说明书(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)使用具有ABI Prism7000SDS软件(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)的7000序列检测***将氧化LDL受体(Hs00234028);凝乳酶(Hs00166915);浆膜蛋白(Hs00382515);CXC配体3(Hs00171061);GCP-2(Hs00605742);IL-8(Hs00174103);以及GAPDH(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)与cDNA和通用PCR主混合物混合。热循环条件为初始50℃下2分钟和95℃下10分钟,随后为95℃下15秒和60℃下1分钟的40个循环。根据制造商的说明书(使用者手册#2,得自Applied Biosystems,ABI Prism7700序列检测***)分析PCR数据。
常规PCR:使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Mass.,USA)进行常规PCR以验证实时PCR得出的结果。使用2微升的cDNA溶液、1xAmpliTaqGold通用混合物PCR反应缓冲液(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)和94℃5分钟的最初变性进行PCR。针对每个引物对优化扩增。对于IL-8、CXC配体3和浆膜蛋白(94℃下15秒,55℃下15秒和72℃下30秒,30个循环);对于凝乳酶(94℃下15秒,53℃下15秒和72℃下30秒,38个循环);对于氧化LDL受体1和GAPDH(94℃下15秒,55℃下15秒和72℃下30秒,33个循环)。用于扩增的引物列于表11-1中。最终PCR反应物中引物浓度为1微摩尔,不同的是GAPDH,其为0.5微摩尔。GAPDH引物与实时PCR相同,不同的是未将制造商的探针添加于最终PCR反应物中。将样本在2%(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳,并用溴化乙锭(Sigma,St.Louis,Mo.)染色。用667Universal Twinpack胶片(VWR International,SouthPlainfield,N.J.)和焦距宝丽来(Polaroid)照相机(VWR International,SouthPlainfield,N.J.)采集图像。
表11-1:使用的引物
免疫荧光:使用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)在室温下固定PPDC 10分钟。使用脐和胎盘衍生的细胞在第0代(PO)(在分离后直接)和第11代(P 11)各一个分离物(胎盘衍生的细胞的两个分离物,脐衍生的细胞的两个分离物)和成纤维细胞(P11)。使用针对以下表位的抗体进行免疫组织化学分析:波形蛋白(1∶500,Sigma,St.Louis,Mo.)、结蛋白(1∶150;Sigma--针对兔产生;或1∶300;Chemicon,Temecula,Calif--针对小鼠产生)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA;1∶400;Sigma)、细胞角蛋白18(CK18;1∶400;Sigma)、血管性血友病因子(vWF;1∶200;Sigma)以及CD34(人CD34III类;1∶100;DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外,在第11代产后细胞上测试以下标志物:抗人GROα--PE(1:100;Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人GCP-2(1:100;Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1;1∶100;Santa Cruz Biotech)、以及抗人NOGA-A(1∶100;Santa Cruz Biotech)。
将培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,并暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)和0.3%(v/v)的Triton(Triton X-100;Sigma,St.Louis,Mo.)的蛋白质阻断溶液30分钟以进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下,在流程的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位丢失。此外,在一抗通过免疫山羊制备(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下,在整个过程中使用3%(v/v)驴血清替代山羊血清。一抗在阻断溶液中稀释后,加到培养物上在室温下保持1小时。去除一抗溶液,并且在施加含阻断剂连同山羊抗-小鼠IgG--德克萨斯红(1∶250;MolecularProbes,Eugene,Oreg.)和/或山羊抗兔IgG--Alexa 488(1∶250;Molecular Probes)或驴抗山羊IgG--FITC(1∶150;Santa Cruz Biotech)的二抗溶液(室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用在倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)上的适当荧光滤光器显现荧光。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)捕获代表性图像。对于三染样本,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe软件(Adobe,San Jose,Calif)制作分层剪辑。
制备细胞以进行FACS分析:在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif)中洗涤烧瓶中的贴壁细胞,并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)脱离。将细胞收获、离心并以每毫升1×107个的细胞浓度重悬于PBS中的3%(v/v)FBS中。将一百微升等分试样递送至锥形管中。使用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen,San Diego,Calif)对已对细胞内抗原染色的细胞进行透化处理。根据制造商的说明书,将抗体加入等分试样中,并将细胞在4℃下在黑暗中孵育30分钟。在孵育之后,将细胞用PBS洗涤并离心以移除过量的抗体。将需要二抗的细胞重悬于100微升3%FBS中。根据制造商的说明书添加二抗并将细胞在4℃下在黑暗中孵育30分钟。在孵育之后,将细胞用PBS洗涤并离心以移除过量的二抗。将洗涤后的细胞重悬于0.5毫升PBS中并用流式细胞术进行分析。使用以下抗体:氧化LDL受体1(sc-5813;Santa Cruz,Biotech)、GROa(555042;BD Pharmingen,Bedford,Mass.)、小鼠IgG1κ(P-4685和M-5284;Sigma)、驴抗山羊IgG(sc-3743;Santa Cruz,Biotech.)。用FACScaliburTM(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)进行流式细胞术分析。
结果
对源于人胎盘、成人和新生儿成纤维细胞以及间充质干细胞(MSC)的细胞的cDNA进行的用于所选“标签”基因的实时PCR结果指示,与其它细胞相比较,氧化LDL受体和凝乳酶两者以更高的水平在胎盘衍生的细胞中表达。通过AACT方法分析得自实时PCR的数据并以对数尺度表示。浆膜蛋白和氧化LDL受体表达的水平在脐衍生的细胞中比其它细胞中更高。在产后衍生细胞与对照之间未发现CXC配体3和GCP-2的表达水平的显著差异。通过常规PCR验证实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察结果。使用上表11-1列出的常规PCR CXC配体3引物,在产后衍生细胞与对照之间未发现CXC配体3的表达水平的显著差异。
产后细胞中细胞因子IL-8的产量在生长培养基培养的和血清饥饿的产后来源细胞中升高。所有实时PCR数据用常规PCR并通过测序PCR产物进行验证。
当在无血清培养基中生长的细胞的上清液中检测IL-8的存在性时,在来源于脐带细胞和胎盘细胞的一些分离株的培养基中检测到最高量(表11-2)。在来源于人表皮成纤维细胞的培养基中未检测到IL-8。
表11-2:通过ELISA测量的IL-8蛋白质表达
ND:未检测到
还通过FACS针对氧化LDL受体、GCP-2和GROα的产生检测胎盘衍生的细胞。所测细胞对GCP-2呈阳性。该方法并未检测到氧化LDL受体和GRO。
还通过免疫细胞化学分析针对所选蛋白质的产生测试胎盘衍生的细胞。在刚分离(第0代)之后,将人胎盘衍生的细胞用4%低聚甲醛固定并暴露于六种蛋白质的抗体:血管性血友病因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白两者呈正柒。该模式在整个11代均得以保持。仅少数第0代细胞(<5%)对细胞角蛋白18呈正染。
通过免疫细胞化学分析,针对所选蛋白质的产生探测在第0代时源于人脐带的细胞。在刚分离(第0代)之后,将细胞用4%低聚甲醛固定并暴露于六种蛋白质的抗体:血管性血友病因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐衍生的细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的,其中染色模式直到第11代是一致的。
总结:通过微阵列和PCR(实时和常规两种)已确定如下四种基因的基因表达水平之间的一致性:氧化LDL受体1、凝乳酶、浆膜蛋白和IL-8。这些基因的表达在PPDC的mRNA水平受到差异调控,且IL-8在蛋白水平也受到差异调控。在源于胎盘的细胞中,并未通过FACS分析在蛋白质水平上检测到氧化LDL受体的存在。GCP-2和CXC配体3的差异表达并未在mRNA水平上得到证实,然而,通过FACS在胎盘衍生的细胞中在蛋白质水平上检测到GCP-2。尽管该结果并未由最初得自微阵列实验的数据反映出,但这可能是由于方法灵敏度中的差异。
在刚分离(第0代)之后,人胎盘衍生的细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白两者呈正染。也在第11代观察到该模式。波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达可在生长培养基和在这些过程中利用的条件下随传代进行而在细胞中得以维持。针对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达,探测在第0代时源于人脐带的细胞,并且该细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白均是阳性的。染色模式在整个11代均得以保持。
实施例12
产后衍生细胞的体外免疫学评价
体外评价产后来源细胞(PPDC)的免疫学特性,以便预测在体内移植时这些细胞是否会引发任何免疫反应。通过流式细胞术分析PPDC是否存在HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2。这些蛋白由抗原递呈细胞(APe)表达并且是初始CD4+T细胞的直接刺激所需的(Abbas&Lichtman,CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY,第5版(2003)Saunders,Philadelphia,第171页)。还通过流式细胞术分析细胞系对HLA-G(Abbas&Lichtman,2003,supra)、CD 178(Coumans等人,(1999)Journal of Immunological Methods 224,185-196)和PD-L2(Abbas&Lichtman,2003,同上;Brown等人(2003)The Journal of Immunology,170:1257-1266)的表达。存在于胎盘组织中的细胞对这些蛋白的表达被认为介导子宫内胎盘组织的免疫豁免状态。为了预测胎盘和脐衍生的细胞系在体内引发免疫应答的程度,在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中测试所述细胞系。
方法及材料
细胞培养:在包被有2%明胶(Sigma,St.Louis,Mo.)的T75烧瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中,将细胞培养至汇合。
抗体染色:在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif.)中洗涤细胞,并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Mo.)脱离。将细胞收获、离心并以每毫升1×107个的细胞浓度重悬于PBS中的3%(v/v)FBS中。根据制造商的说明书,将抗体(表12-1)加入一百微升的细胞悬浮液中并在4℃下于黑暗中孵育30分钟。在孵育之后,将细胞用PBS洗涤并离心以移除未结合的抗体。将细胞重悬浮于五百微升PBS中,并使用FACSCaliburTM仪器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)通过流式细胞术进行分析。
表12-1:抗体
抗体 | 制造商 | 目录号 |
HLA-DRDPDQ | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555558 |
CD80 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 557227 |
CD86 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555665 |
B7-H2 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 552502 |
HLA-G | Abcam(Cambridgeshire,UK) | ab 7904-100 |
CD 178 | Santa Cruz(San Cruz,CA) | sc-19681 |
PD-L2 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 557846 |
小鼠IgG2A | Sigma(St.Louis,MO) | F-6522 |
小鼠IgG1κ | Sigma(St.Louis,MO) | P-4685 |
混合淋巴细胞反应:将标记为细胞系A的10代脐衍生的细胞和标记为细胞系B的11代胎盘衍生的细胞的冻存小瓶放在干冰上运送至CTBR(CTBR(Senneville,Quebec),以使用CTBR SOP No.CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多个男性和女性志愿捐献者收集外周血单核细胞(PBMC)。用丝裂霉素C处理刺激物(供体)同种异体PBMC、自体PBMC和产后细胞系。将自体和丝裂霉素C处理的刺激细胞添加至应答(受体)PBMC并培养4天。孵育后,将[3H]胸腺嘧啶核苷添加至每种样本并培养18小时。收获细胞后,提取放射性标记的DNA并使用闪烁计数器测定[3H]-胸腺嘧啶核苷结合。
将同种异体供体(SIAD)的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的同种异体供体的平均增殖再除以接受者的基线增殖。将PPDC的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的产后细胞系的平均增殖率再除以接受者的基线增殖率。
结果
混合淋巴细胞反应--胎盘衍生的细胞:筛选七名人志愿献血者,以鉴定出在与其它六名献血者的混合淋巴细胞反应中显示出强增殖应答的单个同种异体供体。将该供体选择为同种异体阳性对照供体。将剩余的六名献血者选择为受体。将异源阳性对照供体和胎盘衍生的细胞系用丝裂霉素C处理并培养于混合淋巴细胞反应物中使其与六种单独的异源受体反应。使用具有三种受体/板的两个细胞培养板,一式三份进行反应(表12-2)。平均刺激指数在1.3(板2)至3(板1)的范围内,并且同种异体供体阳性对照在46.25(板2)至279(板1)的范围内(表12-3)。
表12-2:混合淋巴细胞反应数据-细胞系B(胎盘)
板ID:板2
表12-3:在与六种单独的同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中胎盘细胞和同种 异体供体的平均刺激指数。
混合淋巴细胞反应--脐衍生的细胞:筛查六名人志愿献血者,以鉴定出在与其它五名献血者的混合淋巴细胞反应中将表现稳健增殖反应的单个异源供体。将该供体选择为同种异体阳性对照供体。将剩余的五名献血者选择为受体。将异源阳性对照供体和胎盘细胞系用丝裂霉素处理并培养于混合淋巴细胞反应物中使其与五种单独的异源接受者反应。使用具有三种接受者/板的两个细胞培养板,一式三份进行反应(表12-4)。平均刺激指数在6.5(板1)至9(板2)的范围内,并且同种异体供体阳性对照在42.75(板1)至70(板2)的范围内(表12-5)。
表12-4:混合淋巴细胞反应数据-细胞系A(脐带)
增殖测定法的DPM
板ID:板1
板ID:板2
表12-5:在与五种单独的异源接受者的混合淋巴细胞反应中脐带衍生的细胞和异 源供体的平均刺激指数。
受体 | 脐带 | |
板1(接受者1-4) | 42.75 | 6.5 |
板2(接受者5) | 70 | 9 |
抗原递呈细胞标志物-胎盘衍生的细胞:流式细胞术分析的胎盘衍生的细胞的直方图示出了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的,这表明胎盘细胞系缺少直接刺激CD4+T细胞所需的细胞表面分子。
免疫调节标志物-胎盘衍生的细胞:流式细胞术分析的胎盘衍生的细胞的直方图示出了PD-L2的阳性表达,如相对于IgG对照荧光值增加所指出的,并说明了CD178和HLA-G的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的。
抗原递呈细胞标志物-脐衍生的细胞:流式细胞术分析的脐衍生的细胞的直方图示出了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的,这表明脐细胞系缺少直接刺激CD4+T细胞所需的细胞表面分子。
免疫调节细胞标志物-脐衍生的细胞:流式细胞术分析的脐衍生的细胞的直方图示出了PD-L2的阳性表达,如相对于IgG对照荧光值增加所指出的,并说明了CD178和HLA-G的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的。
总结:在用胎盘衍生的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中,平均刺激指数在1.3至3的范围内,并且同种异体阳性对照的平均刺激指数在46.25至279的范围内。在用脐衍生的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中,平均刺激指数在6.5至9的范围内,并且同种异体阳性对照的平均刺激指数在42.75至70的范围内。胎盘和脐衍生的细胞系对于刺激蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的,如通过流式细胞术所测定的。胎盘和脐衍生的细胞系对于免疫调节蛋白HLA-G和CD178的表达是阴性的,并且对于PD-L2的表达是阳性的,如通过流式细胞术所测定的。异源供体PBMC包含表达HLA-DR、DQ、CD8、CD86和B7-H2的抗原递呈细胞,从而允许刺激初始CD4+T细胞。胎盘和脐衍生的细胞上缺少初始CD4+T细胞直接刺激所需的抗原递呈细胞表面分子以及存在免疫调节蛋白PD-L2,可导致与异源对照相比这些细胞在MLR中表现出低刺激指数。
实施例13
产后衍生细胞分泌的营养因子
测定所选营养因子从胎盘和脐衍生的细胞的分泌。选择用于检测的因子包括:(1)已知具有血管生成活性的那些,例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen等人(1997)CibaFound.Symp.212:215-26)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(Salcedo等人(2000)Blood 96;34-40)、白介素-8(IL-8)(Li等人(2003)J.Immunol.170:3369-76)、角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes等人.(2004)Ann.Thorac.Surg.77:812-8)、基质金属蛋白酶1(TIMP1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板衍生生长因子(PDGF-bb)、促血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、基质细胞衍生因子1α(SDF-1α);(2)已知具有神经营养/神经保护活性的那些,例如脑衍生神经营养因子(BDNF)(Cheng等人(2003)Dev.Biol.258;319-33)、白介素-6(IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、转化生长因子β2(TGFβ2);以及(3)已知具有趋化因子活性的那些,例如巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、Rantes(调节激活正常T细胞表达和分泌)、I309、胸腺活化调节趋化因子(TARe)、嗜酸细胞活化趋化因子、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)、IL-8。
方法及材料
细胞培养:将得自胎盘和脐的PPDC以及源于人新生儿***的人成纤维细胞培养于明胶包被的T75烧瓶中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中。冻存第11代的细胞并保存在液氮中。细胞解冻后,将生长培养基添加至所述细胞,接着转移到15毫升离心管中并以150xg将细胞离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀物重悬于4毫升生长培养基中,并对细胞进行计数。将细胞以375,000个细胞/75cm2含有15毫升生长培养基的烧瓶接种,并培养24小时。将培养基更换为无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco),0.1%(w/v)牛血清白蛋白(Sigma),青霉素/链霉素(Gibco))并培养8小时。在温育结束时通过在14,000xg下离心5分钟收集条件无血清培养基,并保存于-20℃下。
为了估算每个烧瓶中的细胞数量,用PBS洗涤细胞,并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA分离。通过添加8毫升生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。以150xg将细胞离心5分钟。去除上清液,并将细胞重悬于1毫升生长培养基中。使用血球计估算细胞数量。
ELISA测定:使细胞在37℃下于5%二氧化碳和大气氧中生长。也将胎盘来源细胞(批号101503)培养于5%氧气或β-巯基乙醇(BME)中。通过ELISA测定法(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)测定每个细胞样本产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有测定法均根据制造商的说明书进行。
SearchLightTM多路ELISA测定:使用SearchLightTM蛋白质组阵列(PierceBiotechnology Inc.)测定趋化因子(MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、1309、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF)。蛋白质组阵列为用于定量测定每孔2至16种蛋白的多重夹心ELISA。通过以2×2、3×3或4×4的模式将4至16种不同捕获抗体点样于96孔板的每孔中,来产生阵列。夹心ELISA流程后,对整块板拍照以采集板的每孔内每个点样处产生的化学发光信号。每个点样中产生的信号量与原标准品或样本中的靶蛋白的量成比例。
结果
ELISA测定:MCP-1和IL-6由胎盘和脐衍生的细胞和表皮成纤维细胞分泌(表13-1)。SDF-1α由5%O2中培养的胎盘衍生的细胞和成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由在BME或5%O2存在下所培养的脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞分泌。GCP-2也由人成纤维细胞分泌。ELISA测定法不可检测TGF-β2。
表13-1:ELISA结果:营养因子的检测
关键:ND:未检测到,=/-sem
SearchLightTM多路ELISA测定法:TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8由脐衍生的细胞分泌(表13-2和13-3)。TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子和IL-8由胎盘衍生的细胞分泌(表13-2和13-3)。未检测到Ang2、VEGF或PDGF-bb。
表13-2:SEARCHLIGHT多路ELISA测定结果
关键:hFB(人成纤维细胞),P1(胎盘衍生的细胞(042303)),U1(脐衍生的细胞(022803)),
P3(胎盘衍生的细胞(071003)),U3(脐衍生的细胞(071003))。ND:未检测到。
表13-3:SEARCHLIGHT多路ELISA测定结果
关键:hFB(人成纤维细胞),P1(胎盘衍生的PPDC(042303)),U1(脐衍生的PPDC(022803)),
P3(胎盘衍生的PPDC(071003)),U3(脐衍生的PPDC(071003))。ND:未检测到。
实施例14
产后衍生细胞的短期神经分化
检测胎盘和脐衍生的细胞(共称为产后衍生细胞或PPDC)分化成神经谱系细胞的能力。
方法及材料
产后细胞的分离和扩增:分离得自胎盘和脐组织的PPDC并如实施例6所述的那样扩增。
改进的Woodbury-Black方案(A):该测定改编自最初实施以测试骨髓基质细胞的神经诱导潜力的测定(1)。解冻脐衍生的细胞(022803)P4和胎盘衍生的细胞(042203)P3并使培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到近汇合(75%)。然后使细胞进行胰蛋白酶消化并以6,000个细胞/孔接种于Titretek II载玻片(VWR International,Bristol,Conn.)。作为对照,也在相同条件下接种间充质干细胞(P3;1F2155;Cambrex,Walkersville,Md.)、成骨细胞(P5;CC2538;Cambrex)、脂肪衍生的细胞(Artecel,美国专利6,555,374 B1)(P6;供体2)和新生人表皮成纤维细胞(P6;CC2509;Cambrex)。
将所有细胞最初在包含15%(v/v)胎牛血清(FBS;Hyclone,Logan,Utah)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF;20纳克/毫升;Peprotech,Rocky Hill,N.J.)、表皮生长因子(EGF;20纳克/毫升;Peprotech)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中扩增4天。在四天后,将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS;Invitrogen)中冲洗并随后在DMEM/F12培养基+20%(v/v)FBS+青霉素/链霉素中培养24小时。在24小时之后,将细胞用PBS冲洗。然后将细胞在诱导培养基中培养1-6小时,该诱导培养基由包含200mM丁基化羟基苯甲醚、10μM氯化钾、5毫克/毫升胰岛素、10μM毛喉素、4μM丙戊酸和2μM皮质醇(所有化学品均得自Sigma,St.Louis,Mo.)的DMEM/FI2(无血清)组成。接着将细胞固定于100%冰冷的甲醇中并进行免疫细胞化学分析(参见下文方法)以评估人巢蛋白的表达。
改进的Woodbury-Black方案(B):解冻PPDC(脐(022803)P11;胎盘(042203)P11和成人真皮成纤维细胞(1F1853,P11)并使培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到近汇合(75%)。然后使细胞进行胰蛋白酶消化并以类似于(A)的密度接种,但是接种到(1)24孔组织培养物处理的板(TCP,Falcon brand,VWR International),(2)TCP孔+室温下吸附1小时的2%(w/v)明胶,或者(3)TCP孔+20μg/毫升的吸附的小鼠层粘连蛋白(在37℃下吸附最低2小时;Invitrogen)上。
正如(A)中的情况,使细胞初始扩增并在前述时间段替换培养基。如前所述在第5天6小时的时候固定一组培养物,此时用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)在室温下固定10分钟。在第二组培养物中,移除培养基并转换成神经祖细胞扩增培养基(NPE),该神经祖细胞扩增培养基由包含B27(B27补充剂;Invitrogen)、L-谷氨酰胺(4mM)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的Neurobasal-A培养基(Invitrogen)组成。NPE培养基进一步补充有视黄酸(RA;1μM;Sigma)。4天之后移除该培养基并将培养物用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)在室温下固定10分钟,并且染色以进行巢蛋白、GFAP和TuJ1蛋白质表达(参见表14-1)。
表14-1:所用一抗汇总
两阶段分化方案:解冻PPDC(脐(042203)P11,胎盘(022803)P11)、成人真皮成纤维细胞(P11;1F1853;Cambrex)并使培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到近汇合(75%)。然后使细胞进行胰蛋白酶消化并以2,000个细胞/cm2接种,但在补充有bFGF(20纳克/毫升;Peprotech,Rocky Hill,N.J.)和EGF(20纳克/毫升;Peprotech)的NPE培养基[整个培养基组合物被进一步称为NPE+F+E]的存在下接种到经层粘连蛋白包被的24孔板(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)上。同时,也将从海马(P4;062603)分离的成鼠神经祖细胞铺到24孔层粘连蛋白包被的板的NPE+F+E培养基中。将所有培养物在此类条件下维持6天时间(在该时间内喂养细胞一次),此时将培养基转换成表14-2所列的分化条件再进行7天。将培养物用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)在室温下固定10分钟,并且染色以进行人或大鼠巢蛋白、GF AP和TuJ1蛋白质表达。
表14-2:用于两阶段分化的条件汇总
多生长因子方案:解冻脐衍生的细胞(P11;(042203))并使培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到近汇合(75%)。然后使细胞进行胰蛋白酶消化并在NPE+F(20纳克/毫升)+E(20纳克/毫升)存在下以2,000个细胞/cm2接种到24孔层粘连蛋白包被的板(BD Biosciences)上。此外,一些孔包含NPE+F+E+2%FBS或10%FBS。在“预分化”条件四天后,移除所有培养基并将样本转换到补充有音猬因子(SHH;200纳克/毫升;Sigma,St.Louis,Mo.)、FGF8(100纳克/毫升;Peprotech)、BDNF(40纳克/毫升;Sigma)、GDNF(20纳克/毫升;Sigma)和视黄酸(1μM;Sigma)的NPE培养基中。在培养基更换后七天,将培养物用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)在室温下固定10分钟,并且染色以进行人巢蛋白、GFAP和TuJ1、结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达。
神经祖细胞共培养方案:将成鼠海马祖细胞(062603)作为神经球或单细胞(10,000个细胞/孔)铺板到层粘连蛋白包被的24孔皿(BD Biosciences)的NPE+F(20纳克/毫升)+E(20纳克/毫升)中。
单独地,解冻脐衍生的细胞(042203)P11和胎盘衍生的细胞(022803)P11并使培养物在NPE+F(20纳克/毫升)+E(20纳克/毫升)中以5,000个细胞/cm2扩增48小时。然后使细胞进行胰蛋白酶消化并以2,500个细胞/孔接种到神经祖细胞的现有培养物上。此时,将现有培养基替换为新鲜培养基。在四天后,将培养物用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)在室温下固定10分钟,并且针对人核蛋白(hNuc;Chemicon)(上表14-1)染色以鉴定PPDC。
免疫细胞化学分析:免疫细胞化学使用表14-1列出的抗体进行。将培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,并暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemicon,Temecula,Calif)和0.3%(v/v)的Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液30分钟以进入细胞内抗原。一抗在阻断溶液中稀释后,加到培养物上在室温下保持1小时。接着,去除一抗溶液,并且在施加含阻断溶液连同山羊抗-小鼠IgG--德克萨斯红(1∶250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和山羊抗兔IgG--Alexa 488(1∶250;Molecular Probes)的二抗溶液(室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用适当的奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)观察荧光。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)捕获代表性图像。对于三染样本,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,Calif)制作分层剪辑。
结果
改进的Woodbury-Black方案(A):在该神经诱导组合物中孵育时,所有细胞类型转化成具有两极形态和延伸突起的细胞。还观察到其它更大的非两极形态。此外,诱导的细胞群对巢蛋白即多能神经干细胞和祖细胞的标志物呈正染。
改进的Woodbury-Black方案(B):当在组织培养塑料(TCP)皿上重复时,除非层粘连蛋白被预吸附到培养物表面,否则观察不到巢蛋白表达。为进一步评估表达巢蛋白的细胞是否可随后继续产生成熟神经元,将PPDC和成纤维细胞暴露于NPE+RA(1μM),即已知诱导神经干细胞和祖细胞分化成此类细胞的培养基组合物(2,3,4)。针对未成熟和成熟神经元的标志物TuJl、星形胶质细胞的标志物GFAP和巢蛋白对细胞染色。在检测不到TuJl的条件下,观察不到神经元形态的细胞。此外,PPDC不再表达巢蛋白和GFAP,如由免疫细胞化学测定。
两阶段分化:将脐和胎盘PPDC分离物(以及分别作为阴性和阳性对照细胞类型的人成纤维细胞和啮齿动物神经祖细胞)铺板到粘连蛋白(神经促进)包被的皿上并暴露于已知促进神经祖细胞分化成神经元和星形胶质细胞的13种不同的生长条件(和两种对照条件)。此外,加入两种条件以检测GDF5和BMP7对PPDC分化的影响。一般来讲,采用两步分化方案,其中首先将细胞置于神经祖细胞扩增条件6天,随后于完全分化条件7天。在形态学上,脐和胎盘衍生的细胞两者在该过程的整个时程中均表现出细胞形态的根本性变化。然而,除在对照条件、神经祖细胞铺板的条件中之外,未观察到神经元或星形胶质细胞状的细胞。对人巢蛋白、TuJ1和GFAP呈阴性的免疫细胞化学分析证实了形态学观察。
多种生长因子:在暴露于多种神经分化剂一周后,针对表示神经祖细胞(人巢蛋白)、神经元(TuJ1)和星形胶质细胞(GFAP)的标志物对细胞染色。在不含血清的培养基中第一阶段生长的细胞具有与在含血清(2%或10%)的培养基中的那些细胞不同的形态学,这指示潜在的细胞分化。具体地,在使脐衍生的细胞暴露于EGF和bFGF,随后暴露于SHH、FGF8、GDNF、BDNF和视黄酸的两步过程之后,细胞示出类似于培养的星形胶质细胞形态的较长延伸的突起。当分化的第一阶段中包括2%FBS或10%FBS时,细胞数目增加并且细胞形态与高密度的对照培养物相同。潜在的神经分化并未通过对人巢蛋白、TuJ1或GFAP的免疫细胞化学分析加以证实。
神经祖细胞和PPDC共培养:将PPDC铺板到比神经扩增条件(NPE+F+E)早两天接种的大鼠神经祖细胞的培养物中。虽然铺板PPDC的视觉的证实证明了这些细胞作为单细胞铺板,但是在铺板后4天的人特异性核染色(hNuc)(共6天)示出其趋于成球形并避免与神经祖细胞接触。此外,在PPDC贴壁的情况下,这些细胞展开并似乎受大鼠起源的分化神经元神经支配,这表明PPDC可分化成肌细胞。该观察在相差显微术下以形态为基础。另一个观察在于通常较大细胞体(大于神经祖细胞)具有类似于神经祖细胞的形态学,在多个方向上生出较薄突起。hNuc染色(存在于二分之一细胞核中)示出在一些情况下这些人细胞可与大鼠祖细胞融合且假定其表型。仅包含神经祖细胞的对照具有比包含脐或胎盘PPDC的共培养物孔更少的总祖细胞和表观分化细胞,这进一步表明脐和胎盘衍生的细胞两者通过释放趋化因子和细胞因子或通过接触介导的效应影响神经祖细胞的分化和行为。
总结:实施多个方案以测定PPDC分化成神经谱系细胞的短期潜力。这些包括将形态的相差显微镜成像与巢蛋白、TuJ1和GFAP的免疫细胞化学分析结合,所述巢蛋白、TuJ1和GFAP分别是与多能神经干细胞和祖细胞、未成熟和成熟神经元、以及星形胶质细胞相关联的蛋白质。
实施例15
产后衍生细胞的长期神经分化
评估脐和胎盘衍生的细胞(共称为产后衍生细胞或PPDC)经受长期分化成神经谱系细胞的能力。
方法及材料
PPDC的分离和扩增:分离PPDC并如前面实施例所述的那样扩增。
PPDC细胞解冻和铺板:将先前在生长培养基中生长的冷冻的PPDC等分试样(脐(022803)P11;(042203)P11;(071003)P12;胎盘(101503)P7)解冻并以5,000个细胞/cm2铺到经层粘连蛋白包被的T-75烧瓶(BD,Franklin Lakes,N.J.)的Neurobasal-A培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中,所述Neurobasal-A培养基包含B27(B27补充剂,Invitrogen)、L-谷氨酰胺(4mM)和青霉素/链霉素(10毫升),该组合在本文称为神经祖细胞扩增(NPE)培养基。使NPE培养基进一步补充bFGF(20纳克/毫升,Peprotech,Rocky Hill,N.J.)和EGF(20纳克/毫升,Peprotech,Rocky Hill,N.J.),本文称之为NPE+bFGF+EGF。
对照细胞铺板:此外,解冻成人真皮成纤维细胞(P11,Cambrex,Walkersville,Md.)和间充质干细胞(P5,Cambrex)并以相同的细胞接种密度铺板于经层粘连蛋白包被的T-75***NPE+bFGF+EGF中。作为进一步对照,使成纤维细胞、脐和胎盘PPDC生长于生长培养基中(对所有培养物而言时间是特异的)。
细胞扩增:将所有培养物的培养基用新鲜的培养基每周替代一次并观察细胞的扩增。一般来讲,每种培养物因在NPE+bFGF+EGF中生长受限而在一个月的时间内传代一次。
免疫细胞化学分析:在一个月的时间之后,将所有烧瓶用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich)在室温下固定10分钟。使用针对TuJ1(BIII微管蛋白;1∶500;Sigma,St.Louis,Mo.)和GFAP(胶质原纤维酸性蛋白;1∶2000;DakoCytomation,Carpinteria,Calif.)的抗体进行免疫细胞化学分析。简而言之,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗培养物后,将其与含PBS、4%(v/v)的山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif.)和0.3%(v/v)的Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液接触30分钟以进入细胞内抗原。一抗在阻断溶液中稀释后,加到培养物上在室温下保持1小时。接着,去除一抗溶液,并且在施加含阻断剂连同山羊抗-小鼠IgG--德克萨斯红(1∶250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和山羊抗兔IgG--Alexa 488(1∶250;Molecular Probes)的二抗溶液(室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用适当的奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)观察荧光。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)捕获代表性图像。对于三染样本,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,Calif.)制作分层剪辑。
表15-1:所用一抗汇总
结果
NPE+bFGF+EGF培养基减缓PPDC的增殖并改变其形态。在刚铺板之后,使PPDC亚群贴壁于经层粘连蛋白包被的培养烧瓶中。这可能是由于细胞死亡随冻/融过程而变化或是因为新的生长条件。贴壁的细胞采用不同于生长培养基中观察的那些的形态。
脐衍生的细胞的克隆表达神经元蛋白质:在解冻/铺板后一个月固定培养物并针对神经元蛋白质TuJ1和GFAP(星形胶质细胞中所见的中间丝状体)进行染色。虽然发现生长培养基中生长的所有对照培养物以及NPE+bFGF+EGF培养基中生长的人成纤维细胞和MSC为TuJ1-/GFAP-,但是却在脐和胎盘PPDC中检测到TuJ1。在具有和不具有神经元样形态的细胞中观察表达。并未在任一种培养物中观察到GFAP的表达。具有神经元样形态的表达TuJ1的细胞的百分比小于或等于全部群体的1%(n=3测试的脐衍生的细胞分离物)。虽然并未定量,但是脐衍生的细胞培养物中不具有神经元形态的TuJ1+细胞的百分比高于胎盘衍生的细胞培养物。这些结果似乎是特异的,因为生长培养基中年龄匹配的对照不表达TuJ1。
总结:开发了用于从脐衍生的细胞产生分化神经元(基于TuJ1表达和神经元形态)的方法。虽然在一个月前并未在体外检测到TuJ1的表达,但是很明显至少一个较小的脐衍生的细胞群可在暴露于补充有L-谷氨酰胺、碱性FGF和EGF的基本培养基一个月之后通过默认分化或通过长期诱导而产生神经元。
实施例16
用于神经祖细胞支持的PPDC营养因子
检查脐和胎盘衍生的细胞(共称为产后衍生细胞或PPDC)通过非接触依赖性(营养)机制对成体神经干细胞和祖细胞存活和分化的影响。
方法及材料
成体神经干细胞和祖细胞分离:通过在CO2窒息后断颈处死Fisher 344成鼠。使用咬骨钳将全脑完整移除,并且基于脑部运动区和躯体感觉区后方的冠状切口解剖海马组织(Paxinos,G.&Watson,C.1997.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates)。将组织在Neurobasal-A培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中洗涤,所述Neurobasal-A培养基包含B27(B27补充剂;Invitrogen)、L-谷氨酰胺(4mM;Invitrogen)和青霉素/链霉素(Invitrogen),该组合在本文称为神经祖细胞扩增(NPE)培养基。使NPE培养基进一步补充bFGF(20纳克/毫升,Peprotech,Rocky Hill,N.J.)和EGF(20纳克/毫升,Peprotech,RockyHill,N.J.),本文称之为NPE+bFGF+EGF。
在洗涤之后,移除上覆脑膜,并用外科手术刀将组织切碎。收集组织糜并将胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)作为75%的总体积添加。另外添加DNase(100微升/8毫升总体积,Sigma,St.Louis,Mo.)。接着,使组织/培养基依序经过18号规格针、20号规格针,最终25号规格针各一次(所有的针得自Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)。将混合物以250g离心3分钟。移除上清液,添加新鲜的NPE+bFGF+EGF并使沉淀物重悬。所得的细胞悬浮液经过40微米细胞滤网(Becton Dickinson),铺板到经层粘连蛋白包被的T-75烧瓶(BectonDickinson)或24-孔低簇板(Becton Dickinson),并生长于NPE+bFGF+EGF培养基中直至获得足够的细胞数进行列出的研究。
PPDC铺板:将先前生长于生长培养基的产后衍生细胞(脐(022803)P12、(042103)P12、(071003)P12;胎盘(042203)P12)以5,000个细胞/跨孔插件(按24孔板定制尺寸)铺板并在插件的生长培养基中生长一周以实现汇合。
成体神经祖细胞铺板:将作为神经球或作为单细胞生长的神经祖细胞以约2,000个细胞/孔的密度接种到经层粘连蛋白包被的24孔板的NPE+bFGF+EGF中一天以促进细胞贴附。一天之后,根据以下方案加入包含产后细胞的跨孔插件:
a.跨孔(生长培养基中脐衍生的细胞,200微升)+神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
b.跨孔(生长培养基中胎盘衍生的细胞,200微升)+神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
c.跨孔(成人真皮成纤维细胞[1F 1853;Cambrex,Walkersville,Md.]P12,生长培养基中,200微升)+神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
d.对照:单独神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
e.对照:单独神经祖细胞(仅NPE,1毫升)
免疫细胞化学分析:在共培养7天之后,用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich)在室温下固定所有条件10分钟。使用针对下表14-1列出的表位的抗体进行免疫细胞化学分析。简而言之,将培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,并暴露于含PBS、4%(v/v)的山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif.)和0.3%(v/v)的Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液30分钟以进入细胞内抗原。一抗在阻断溶液中稀释后,加到培养物上在室温下保持1小时。接着,去除一抗溶液,并且在施加含阻断溶液连同山羊抗-小鼠IgG--德克萨斯红(1∶250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和山羊抗兔IgG--Alexa 488(1∶250;MolecularProbes)的二抗溶液(室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用适当的奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)观察荧光。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)捕获代表性图像。对于三染样本,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,Calif.)制作分层剪辑。
表16-1:所用一抗汇总
神经祖细胞分化的定量分析:对海马神经祖细胞分化的量化进行检测。每个条件下计数最少1000个细胞,或者如果更少,在该条件下观察细胞总数。对给定染色剂呈阳性的细胞的百分比通过用阳性细胞数除以如由DAPI(核)染色确定的细胞总数来评估。
质谱分析和2D凝胶电泳:为鉴定因共培养而独特分泌的因子,将在培养物固定之前取得的条件培养基样本在-80℃下冷冻过夜。然后将样本施加至超滤旋转装置(MW截断30kD)。将保留物施加于免疫亲和色谱上(抗-Hu-白蛋白;IgY)(免疫亲和不从样本中移除白蛋白)。通过MALDI分析滤液。将流过物施加于Cibachron Blue亲和色谱。通过SDS-PAGE和2D凝胶电泳分析样本。
结果
PPDC共培养刺激成体神经祖细胞分化:在与脐或胎盘衍生的细胞一起培养之后,源于成体大鼠海马的共培养的神经祖细胞表现出沿中枢神经***的所有三个主要谱系方向均显著分化。该效应在共培养中五天后明显观察到,多个细胞转变成有复杂突起并且损失其***中祖细胞的亮相位(phase bright)特征性特性。相反地,在不存在bFGF和EGF时单独生长的神经祖细胞似乎不健康并且存活受到限制。
在所述过程完成之后,针对表示未分化干细胞和祖细胞(巢蛋白)、未成熟和成熟神经元(TuJ1)、星形胶质细胞(GFAP)和成熟少突胶质细胞(MBP)的标志物对培养物进行染色。当对照条件未表现出显著分化时沿所有三种谱系方向的分化得到确认,如由大多数细胞中保持巢蛋白阳性染色所证实的那样。虽然脐和胎盘衍生的细胞两者诱导细胞分化,但在具有胎盘衍生的细胞的共培养物中所有三种谱系的分化程度比具有脐衍生的细胞的共培养物更小。
在与脐衍生的细胞共培养之后,对分化的神经祖细胞的百分比进行定量(表16-2)。脐衍生的细胞显著增强成熟少突胶质细胞(MBP)的数目(在两种对照条件中,24.0%vs.0%)。此外,共培养增强了培养物中GFAP+星形胶质细胞和TuJ1+神经元的数目(分别为47.2%和8.7%)。这些结果通过巢蛋白染色加以确认,指示出在共培养之后祖细胞状态损失(在对照条件4中,13.4%vs.71.4%)。
虽然分化还似乎受成人成纤维细胞影响,但此类细胞不能促进成熟少突胶质细胞的分化或者其不能产生可观量的神经元。虽然未定量,然而成纤维细胞却似乎增强了神经祖细胞的存活。
表16-2:对照和相对于脐衍生的细胞跨孔共培养中祖细胞分化的量化(E=EGF,F
=bFGF)
独特化合物的鉴定:检测得自脐和胎盘衍生的共培养物的条件培养基连同适当的对照(NPE培养基±1.7%血清,得自与成纤维细胞的共培养物的培养基)的差异。鉴定潜在独特的化合物并从其对应2D凝胶中切离。
总结:成体神经祖细胞与脐或胎盘PPDC的共培养导致那些细胞分化。该实施例示出的结果指示,在与脐衍生的细胞共培养之后成体神经祖细胞的分化尤为突出。具体地,在脐衍生的细胞共培养物中产生显著百分比的成熟少突胶质细胞。
实施例17
产后衍生细胞的移植
产后脐和胎盘衍生的细胞可用于再生治疗。对利用可生物降解材料将产后衍生细胞(PPDC)所产生的组织向SCID小鼠中移植进行评估。所评估的材料为Vicryl非织造材料、35/65PCL/PGA泡沫和RAD 16自组装肽水凝胶。
方法及材料
细胞培养:使脐和胎盘衍生的细胞生长于经明胶包被的***生长培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco,Carlsbad Calif.)、15%(v/v)胎牛血清(目录号SH30070.03;Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)β巯基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)、青霉素/链霉素(Gibco))中。
样本制备:将一百万个活细胞接种到5mm直径、2.25mm厚的Vicryl非织造支架(64.33毫克/cc;批号3547-47-1)或5mm直径35/65PCL/PGA泡沫(批号3415-53)上的15微升生长培养基中。在添加更多生长培养基以覆盖支架之前,使细胞贴壁两小时。使细胞在支架上生长过夜。另外将不具有细胞的支架在培养基中温育。
RAD16自组装肽(3D Matrix,Cambridge,MA)作为无菌1%(w/v)水溶液获得,其在临用前以1∶1与含10%(w/v)蔗糖(Sigma,St Louis,Mo.)、10mM HEPES的Dulbecco′s改良培养基(DMEM;Gibco)中的1×106个细胞混合。RAD 16水凝胶中细胞的最终浓度为1×106个细胞/100微升。
测试材料(N=4/Rx)
a. Vicryl非织造材料+1×106个脐衍生的细胞
b. 35/65PCL/PGA泡沫+1×106个脐衍生的细胞
c. RAD 16自组装肽+1×106个脐衍生的细胞
d. Vicryl非织造材料+1×106个胎盘衍生的细胞
e. 35/65PCL/PGA泡沫+1×106个胎盘衍生的细胞
f. RAD 16自组装肽+1×106个胎盘衍生的细胞
g. 35/65PCL/PGA泡沫
h. Vicryl非织造材料
动物准备:根据动物福利法案(Animal Welfare Act)的现行要求处理和维持动物。遵守以上公法通过秉承动物福利规定(9CFR)并遵循实验动物护理和使用指南(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)第7版颁布的现行标准来实现。
小鼠(小家鼠)/Fox Chase SCID/雄性(Harlan Sprague Dawley,Inc., Indianapolis,Ind.),5周龄:SCID小鼠的所有处理在罩子下方进行。将小鼠各自称重并利用腹膜内注射60毫克/kg KETASET(ketaminehydrochloride,Aveco Co.,Inc.,FortDodge,Iowa)和10毫克/kg ROMPUN(xylazine,Mobay Corp.,Shawnee,Kans.)和盐水的混合物来麻醉。在诱导麻醉后,使用电动动物剪将动物从颈背部区域到背腰骶区域的整个背部的毛发剪光。然后用二醋酸氯己定擦洗该区域,用醇冲洗,干燥,并涂抹1%有效碘的碘伏水溶液。将眼用软膏施用到眼以防止麻醉期间该组织干燥。
皮下植入技术:在小鼠的背部制作每个长度约为1.0cm的四个皮肤切口。两个颅部位横向位于背部侧胸区域上方所触摸到的肩胛下缘尾向约5mm处,一个处于脊柱左边且一个处于右边。另两个横向位于尾骶腰部水平的臀肌区域上方所触摸到的髂嵴尾向约5mm处,中线的每一侧各有一个。根据实验设计将植入物随机置入这些部位。将皮肤和下层***分离以形成小袋,并将植入物放置(或者对于RAD16注射)在切口的尾向约1-em处。将适当的测试材料植入到皮下间隙中。然后用金属夹闭合皮肤伤口。
动物畜舍:在整个研究过程中,在64°F-79°F的温度范围和30%至70%的相对湿度内,将小鼠各自圈养在小隔离笼子中,并维持约12小时光照/12小时黑暗的循环。将温度和相对湿度尽可能最大程度地维持在规定范围之内。饮食由Irradiated Pico Mouse Chow5058(Purina Co.)和不限量饲喂的水组成。
小鼠以其指定间隔吸入二氧化碳处以安乐死。切下覆盖其皮肤的皮下植入部位并冷冻以进行组织学分析。
组织学:将具有植入物的切离的皮肤用10%中性缓冲的***(Richard-AllanKalamazoo,Mich.)固定。中心对切具有上覆组织和相邻组织的样本,并使用常规方法在切割面上经石蜡处理和包埋。五微米的组织切片通过显微切片机获得并使用常规方法用苏木精和伊红(Poly Scientific Bay Shore,N.Y.)进行染色。
结果
30天后,组织最小限度的向内生长到SCID小鼠皮下植入的泡沫(无细胞)中。相比之下,大量组织填充到植入有脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞的泡沫中。在Vicryl非织造支架中观察到一些组织向内生长。接种有脐或胎盘衍生的细胞的非织造支架示出基质沉积和成熟血管增加。
总结:用人脐或胎盘衍生的细胞接种合成的可吸收非织造/泡沫盘(5.0mm直径×1.0mm厚度)或自组装肽水凝胶并经皮下双侧地植入SCID小鼠的背棘区域中。结果展示产后衍生细胞可显著增加可生物降解支架中良好质量的组织形成。
实施例18
脐衍生细胞中的端粒酶表达
端粒酶的功能是合成端粒重复序列,端粒重复序列用于保护染色体完整性并延长细胞的复制寿命(Liu,K等人,PNAS,1999;96:5147-5152)。端粒酶由两种组分组成:端粒酶RNA模板(hTER)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调控通过hTERT而非hTER的转录进行测定。因此hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)为用于测定细胞的端粒酶活性的可接受方法。
细胞分离.进行实时PCR实验以测定人脐带组织衍生的细胞的端粒酶产生。根据上述实验制备人脐带组织来源细胞。一般来讲,在正常分娩后洗涤从国家疾病研究交流会(Philadelphia,Pa.)获得的脐带以去除血液和细胞碎片,并进行机械离解。然后将组织用包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶的消化酶在37℃下于培养基中孵育。人脐带组织衍生的细胞根据以上实施例所列的方法进行培养。从Cambrex(Walkersville,Md)获得间充质干细胞和正常表皮成纤维细胞(cc-2509批号9F0844)。多能人睾丸胚胎性癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2细胞(NTERA-2cl.Dl)(参见Plaia等人,Stem Cells,2006;24(3):531-546)购自ATCC(Manassas,Va.)并根据以上所列方法进行培养。
总RNA的分离.使用试剂盒(Qiagen,Valencia,Ca.)从细胞提取RNA。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。使用随机六聚体引物和逆转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,Ca.),将RNA逆转录,在25℃下10分钟,在37℃下60分钟并且在95℃下10分钟。将样本保存于-20℃下。
实时PCR.根据制造商的说明书(Applied Biosystems),使用Applied BiosystemsAssays-On-DemandTM(也称为Gene Expression Assays),对cDNA样本进行PCR。这种商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简而言之,使用具有ABI prism 7000SDS软件(Applied Biosystems)的7000序列检测***,将hTert(人端粒酶基因)(Hs00162669)和人GAPDH(内对照)与cDNA和Universal PCR预混液混合。热循环条件为初始50℃下2分钟和95℃下10分钟,随后为95℃下15秒和60℃下1分钟的40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。
就hTert和18S RNA测定人脐带组织衍生的细胞(ATCC登录号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞。如表18-1所示,hTert和因此的端粒酶未在人脐带组织衍生的细胞中检出。
测定人脐带组织衍生的细胞(分离物022803,ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2细胞,并且结果显示两个批次的人脐带组织衍生的细胞中均未表达端粒酶,而畸胎瘤细胞系显示出高水平的表达(表18-2)。
因此,可得出如下结论:本发明的人脐带组织衍生的细胞不表达端粒酶。
贯穿整个说明书参考了各种专利和其它出版物。这些出版物各自全文以引用方式并入本文。
尽管上文已结合实施例和优选实施方案描述了本发明的各个方面,但应当理解本发明的范围不受以上描述内容的限定,而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。
Claims (26)
1.一种治疗视网膜变性的方法,包括向受治疗者的眼中施用产后衍生细胞群,其中所述细胞群分泌桥分子,并且其中所述桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。
2.一种向受治疗者的眼中施用产后衍生细胞群的方法,其中所述细胞群分泌桥分子,并且其中所述桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述产后衍生细胞群包括从基本上不含血的人脐带组织中分离的人脐带组织衍生的细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述从基本上不含血的人脐带组织中分离的细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少一种神经表型的细胞的潜力,在传代时保持正常核型,并且具有以下特征:
a) 在培养中40次群体倍增的潜力;
b) 产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;
c) 不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141;以及
d) 相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码白介素8和浆膜蛋白1的基因表达增加。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述细胞群分泌受体酪氨酸激酶(RTK)营养因子。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述营养因子为BDNF、NT3、HGF、PDGF-CC、PDGF-DD和GDNF。
7.根据权利要求4所述的方法,其中所述细胞群分泌受体酪氨酸激酶(RTK)营养因子。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述营养因子为BDNF、NT3、HGF、PDGF-CC、PDGF-DD和GDNF。
9.一种通过权利要求1至3中任一项所述的方法制备的条件培养基。
10.一种减轻或保护视网膜细胞或组织免受氧化性损伤的方法,包括向受治疗者的眼中施用产后衍生细胞群,其中所述产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织中分离。
11.一种拯救视网膜变性中的视网膜色素上皮(RPE)细胞功能障碍的方法,所述方法包括向受治疗者的眼中施用产后衍生细胞群,其中所述产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织中分离,其中所述细胞群分泌桥分子,并且其中所述桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。
12.一种用于减少视网膜变性中的感光细胞损失的方法,所述方法包括将产后衍生细胞群以有效减少感光细胞损失的量施用于受治疗者的眼中,其中所述产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织中分离,其中所述产后衍生细胞群分泌桥分子,并且其中所述桥分子选自MFG-E8、Gas6、TSP-1和TSP-2。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述产后衍生细胞群分泌受体酪氨酸激酶(RTK)营养因子。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述营养因子为BDNF、NT3、HGF、PDGF-CC、PDGF-DD和GDNF。
15.根据权利要求10、11或12所述的方法,其中将所述产后衍生细胞群与至少一种其它试剂一起施用。
16.一种用于减少视网膜变性中的感光细胞损失的方法,包括向受治疗者的眼中施用包含产后衍生细胞群的组合物,其中所述组合物以有效减少感光细胞损失的量施用,其中所述产后衍生细胞从基本上不含血的人脐带组织中分离,其中所述产后衍生细胞分泌桥分子,并且其中所述桥分子选自MFG-E8、C:\AAAA\CPCH1761542P.170731.1450.EMAIL.THRU-134FD563F2.ZIPGas6、TSP-1和TSP-2。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述产后衍生细胞群分泌受体酪氨酸激酶(RTK)营养因子。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述营养因子为BDNF、NT3、HGF、PDGF-CC、PDGF-DD和GDNF。
19.根据权利要求15所述的方法,其中所述组合物为药物组合物。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
21.根据权利要求11、12或16所述的方法,其中所述视网膜变性为年龄相关性黄斑变性。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述年龄相关性黄斑变性为干性年龄相关性黄斑变性。
23.根据权利要求10、11、12或16所述的方法,其中所述从基本上不含血的人脐带组织中分离的细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少一种神经表型的细胞的潜力,在传代时保持正常核型,并且具有以下特征:
a) 在培养中40次群体倍增的潜力;
b) 产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;
c) 不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141;以及
d) 相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,编码白介素8和浆膜蛋白1的基因表达增加。
24.根据权利要求4所述的方法,其中所述细胞群对HLA-A、B、C呈阳性,并且对HLA-DR、DP、DQ呈阴性。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述细胞群对HLA-A、B、C呈阳性,并且对HLA-DR、DP、DQ呈阴性。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中向眼施用选自向眼内部施用或在眼后施用。
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