CN110068687B - 血清中心肌肌钙蛋白i复合物的非诊断目的的定量测量方法 - Google Patents

血清中心肌肌钙蛋白i复合物的非诊断目的的定量测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，先将EDTA螯合基质环境和cTnC本身所包含的Ca2+，再外加Ca2+使cTnC和Ca2+重新结合，最后通过EDTA螯合和cTnC结合的Ca2+，对Ca2+检测，从而定量测量血清中所有与cTnC结合的cTnI复合物。本发明的方法明确了被测物质，实现了对待测物质的范围划定，定义了混合物中被测组分中具体形式。通过ICP‑MS法简化了蛋白质前处理步骤，消除了过程中引入的其他变量和由此导致的不确定度。不选用特征肽段进入质谱的检测方法，消除了由于异质性而产生的质荷比改变所产生的结果差异。不选用制备过程复杂表征困难的同位素标记的重组cTnI作为内标，简化了实验方案。标准物质定值结果可最终溯源到SI单位。

Description

血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法
技术领域
本发明涉及生物诊断标志物定量测量领域，特别是涉及一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的定量测量方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是目前公认的心肌梗塞的生物诊断标志物，因为心肌梗死后肌钙蛋白浓度升高与短期发病率和死亡率之间存在极好的相关性。心肌肌钙蛋白I检验结果的准确性直接影响着心肌梗塞等疾病的诊断，对于其治疗及预防都具有重要意义。
血清基质心肌肌钙蛋白I的临床免疫检测方法丰富，但是结果差异较大，其结果受到检测方法、抗体和标准物质的影响。目前最为准确的绝对定量参考测量方法为免疫亲和富集连同同位素稀释质谱法。该方法选用标准参考物质(SRM)2921，以同位素标记重组cTnI蛋白作为内标，选取三条特征肽段对血清基质中cTnI进行定量，其变异系数(CV)范围为10.0-14.3％。在这种方法下，肽段的选取、cTnI的异质性以及个体的独特性都会对cTnI的定量产生显著影响。
生物标志物的一些标准化问题是对相关的所涉实体的定义不足。在生物样品中，cTnI作为异质混合物存在不同的分子种类，在心肌病患者的血清中可检测到完整的cTnI和多达11种的修饰产物，这种微观异质性可以通过定义混合物中被测组分中具体形式实现标准化。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，先将EDTA螯合基质环境和cTnC本身所包含的Ca2+，再外加Ca2+使cTnC和Ca2+重新结合，最后通过EDTA螯合和cTnC结合的Ca2+，对Ca2+检测，从而定量测量血清中所有与cTnC结合的cTnI复合物。
具体包括以下步骤：
(1)选用SRM(E)标准物质配制CaCl2标准浓度曲线；
(2)用EDTA缓冲液配制cTnC的浓度梯度溶液；
(3)使用磁珠免疫亲和法提取血清中心肌肌钙蛋白I复合物；
(4)将提取出的复合物中加入500μL EDTA缓冲液；
(5)将配制的cTnC溶液和提取出的心肌肌钙蛋白I复合物冰上孵育过夜；
(6)将样品4℃透析24h，分别在5h、13h、20h时更换透析缓冲液；
(7)将样品超速离心，离心条件为温度4℃、转速12000r、时间30min；
(8)加入CaCl2缓冲液500μL，常温振荡反应4h，超速离心；
(9)准确称量加入的500μLEDTA缓冲液摇床常温孵育过夜，超滤离心后进行ICP-MS检测分析；ICP-MS方法采用全定量模式，检测Ca43、Ca44两种同位素。
(10)得到钙标准溶液浓度与CPS的拟合公式A；
将配制的cTnC溶液的CPS值代入拟合公式A，并得出样品内的Ca2+浓度，通过称量离心前与离心后离心管的质量差，将Ca2+浓度换算为质量单位，校正由于稀释和离心过程中由于体积变化而造成的实验误差，在实验过程中使用超纯水缓冲液中的Ca2+浓度忽略不计；
计算出的Ca2+质量与cTnC溶液浓度进行线性拟合，将通过质量法计算的cTnC的实际浓度与计算得到的溶液中钙离子质量拟合线性公式B；
将提取后的血清样品按照相同方法测得的CPS值代入两个线性拟合公式，并且校准体积后，得到血清中cTnI的定量结果。
其中，EDTA缓冲液为20mM Tris、200mM KCI、1mM DTT、5mM EGTA、10mM EDTA，pH6.5。
其中，透析缓冲液为20mM Tris、200mM KCl、1mM DTT，pH 7.5。
其中，CaCl2缓冲液为20mM Tris、200mM KCl、1mM DTT、5mM CaCl2，pH 7.5。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)本发明的方法明确了被测物质，实现了对待测物质的范围划定，定义了混合物中被测组分中具体形式。通过ICP-MS法简化了蛋白质前处理步骤，消除了过程中引入的其他变量和由此导致的不确定度。不选用特征肽段进入质谱的检测方法，消除了由于异质性而产生的质荷比改变所产生的结果差异。不选用制备过程复杂表征困难的同位素标记的重组cTnI作为内标，简化了实验方案。
(2)本发明的方法实现对血清中与cTnC结合的cTnI的准确定量；标准物质定值结果可最终溯源到SI单位。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法作进一步说明。
附图说明
图1为实施例中cTnI和cTnC SDS-PAGE电泳图；
图2为实施例中CaCl2标准浓度曲线图；
图3为实施例中cTnC与Ca2+线性拟合图；
图4为NIST标准物质SRM2921测量结果图。
具体实施方式
主要试剂：
肌钙蛋白C:Hytest公司，芬兰；
蛋白质预制胶：Solarbio公司，中国；
SDS：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国；
甲醇：J.T Baker公司，美国；
冰醋酸：北京试剂公司，中国；
甘油：国药集团有限公司，中国；
二硫苏糖醇DTT:Sigma公司，美国；
Tris:Amresco公司，美国；
溴酚蓝：国药集团有限公司，中国；
彩虹预染宽分子量蛋白Marker(10-260KD)：中科泰瑞公司，中国；
盐酸：优级纯，北京化学试剂公司，中国
二硫苏糖醇DTT:Sigma公司，美国
氯化钾：国药集团有限公司，中国
Tris:Alfa Aesar公司，中国
EDTA:Amrescd公司，美国
氯化钙：Biodee公司，中国
抗cTnI抗体：19C7，Hytest，芬兰
磁珠：DynabeadsTMMyOneTM Tosylactivated,Invitrogen，美国
蒸馏水：watsons公司，中国
透析膜：10Kd,Solarbio公司，中国
超滤离心管：Millipore公司，美国。
仪器设备：
垂直电泳槽：伯乐公司，美国；
分析天平：Sartorius BS323S型，最大称量为320g，精度为0.001g，德国；
超低温冰箱：DW-86L338型，Haier，中国；
摇床：KS260型，IKA公司，德国；
超纯水***:Milli-Q型，MILLIPORE公司，美国。
移液器(10,20,200,1000μl)：Thermo公司，德国
天平：ME235S型，感量0.01mg，Satorius公司，德国
振荡器：Heidolph公司，德国
恒温制冷摇床：Sartorius公司，德国
ICP-MS:7700型号，Aglient公司，美国。
1、血清基质心肌肌钙蛋白I标准物质制备
将采集的人血清样本进行人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)、梅毒、乙型肝炎表面抗原(HBV)、丙肝抗体(HCV)及常规生化全套。
检测得到的cTnI含量，将血清样本分成低、中、高三个浓度水平，分别记为1-2-1、1-2-2、1-2-3，每个浓度水平的血清混匀后过滤至无菌滤瓶。将血清样本分装至，-80℃冰箱冷冻保存。
2、电泳测定cTnC的分子量
(1)样品准备：将样品cTnC(0.5μg/ml)融化，待用。
上样缓冲液：100mgSDS，0.1mL二硫苏糖醇，1.0mL甘油，2mg溴酚蓝，2mL0.05mol/LTris-HCI缓冲液，加蒸馏水至10ml。
染色液：0.25g考马斯亮蓝，乙醇45mL，冰醋酸10mL，加水至100mL，混匀后用滤纸过滤使用。
脱色液：100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml去离子水。
(2)电泳
将蛋白质预制胶放入垂直电泳槽内，倒入电泳缓冲液，充分浸泡预制胶后，将样品和上样缓冲液以1:10的比例加入0.5ml离心管，混匀，离心。在90℃水浴锅中煮10分钟。将彩虹预染宽分子量蛋白Marker从-20℃取出，放至室温，离心待用。
加入样品和蛋白Marker后，设置电泳条件：电压100V，时间60分钟。电泳跑完后，染色15min后脱色处理，结果如图1所示。由图1可知TnC分子量约为18KD。
3、采用同位素稀释质谱法对肌钙蛋白I复合物进行准确定量
EDTA缓冲液：20mM Tris、200mM KCI、1mM DTT、5mM EGTA、10mM EDTA，pH 6.5。
透析缓冲液：20mM Tris、200mM KCl、1mM DTT，pH 7.5。
CaCl2缓冲液：20mM Tris、200mM KCl、1mM DTT、5mM CaCl2，pH 7.5。
(1)用EDTA缓冲液配制理论浓度为50、100、200、400、600μmol/L的CaCl2标准浓度曲线，如图2所示。
(2)用EDTA缓冲液配制cTnC的浓度梯度溶液，浓度为0.251，0.655，2.350，4.548ng/mL。
(3)将磁珠与cTnI抗体按照说明书上推荐步骤进行偶联。
(4)准确称取500μl血清，加入50μL磁珠-抗体复合物，37℃混匀90min，结合了目标物的磁珠以1mLTBST洗涤三次，1mlTBS洗涤一次。
(5)将洗涤后磁珠中加入500μL EDTA缓冲液，与配制的cTnC溶液冰上孵育振荡过夜。
(6)将样品4℃透析24h，分别在5h、13h、20h时更换缓冲液。
(7)将样品转移到超滤离心管中在温度4℃、转速12000r下离心30min。
(8)在离心管中加入480μL CaCl2缓冲液，室温孵育4h。(理论上应加入500μL，但是由于离心后超滤管里还有液体残余，仅能加入到480μL左右，由于Ca2+过量，所以对结果并不影响。)
(9)将样品在上述相同条件下离心后，准确加入480μL EDTA缓冲液。(理论上应加入500μL，但是由于离心后超滤管里还有液体残余，仅能加入到480μL左右，由于过量，所以对结果并不影响。)
(10)将样品离心后将离心液稀释1倍后进ICP-MS分析。ICP-MS方法采用全定量模式，检测Ca43、Ca44两种同位素。
钙标准溶液浓度与CPS的拟合公式为y＝55765.299x-26057.435，线性相关系数为R2＝0.99505。
将配制的cTnC溶液的CPS值代入拟合公式，并得出样品内的Ca2+浓度，通过称量离心前与离心后离心管的质量差，将Ca2+浓度换算为质量单位，校正由于稀释和离心过程中由于体积变化而造成的实验误差。在实验过程中使用超纯水缓冲液中的Ca2+浓度忽略不计。计算出的Ca2+质量与cTnC溶液浓度进行线性拟合，如图3所示，线性线拟合良好，线性相关系数为R2＝0.99264，将通过质量法计算的cTnC的实际浓度与计算得到的溶液中钙离子质量拟合线性方程为y＝3.105x-0.112。将提取后的血清样品按照相同方法测得的CPS值代入两个线性拟合公式，并且校准体积后所得结果如表1所示。
表1血清中cTnI定量结果
Figure GDA0002276341210000061
由表1中的结果可以看出：通过将血清中钙离子的CPS值代入进线性拟合公式，可得到两次测量的六次结果的平均值为0.26ng/mL，与生化分析仪中九强生物公司试剂盒的检测结果0.40ng/mL比偏小，这是由于试剂盒不区分cTnI的存在形式，会测量所有与该型号抗体反应的cTnI，而本实验是将特异性识别cTnI的抗体与磁珠偶合，最后对cTnC进行定量，实现定义所定量的目标为所有与cTnC结合的cTnI。
采用美国标准技术研究院标准物质SRM2921作为标准，评估该方法的可行性和准确性。由于SRM2921是人心肌提取的肌钙蛋白I、T、C的复合物，是评价该方法的理想目标物。其结果如附图4所示，由此可见，本方法可以实现对血清中与cTnC结合的cTnI的准确定量。
本文所提出的方法是在固定测量目标的形式上对其进行定量，该目标是被证明血液中主要的存在形式，同时可以解决标准化中所涉实体定义不足的问题。测定所有与肌钙蛋白C结合的心肌肌钙蛋白I是心肌肌钙蛋白I中最稳定存在的形式，可以一定程度上解决测量值不稳定的问题，另外该方法能够通过溯源途径溯源至钙离子标准物质。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，其特征在于：先将EDTA螯合基质环境和cTnC本身所包含的Ca2+，再外加Ca2+使cTnC和Ca2+重新结合，最后通过EDTA螯合和cTnC结合的Ca2+，对Ca2+检测，从而定量测量血清中所有与cTnC结合的cTnI复合物；具体包括以下步骤：
(1)选用SRM(E)标准物质配制CaCl2标准浓度曲线；
(2)用EDTA缓冲液配制cTnC的浓度梯度溶液；
(3)使用磁珠免疫亲和法提取血清中心肌肌钙蛋白I复合物；
(4)将提取出的复合物中加入500μL EDTA缓冲液；
(5)将配制的cTnC溶液和提取出的心肌肌钙蛋白I复合物冰上孵育过夜；
(6)将样品4℃透析24h，分别在5h、13h、20h时更换透析缓冲液；
(7)将样品超速离心，离心条件为温度4℃、转速12000r、时间30min；
(8)加入CaCl2缓冲液500μL，常温振荡反应4h，超速离心；
(9)准确称量加入的500μLEDTA缓冲液摇床常温孵育过夜，超滤离心后进行ICP-MS检测分析；
(10)得到钙标准溶液浓度与CPS的拟合公式A；
将配制的cTnC溶液的CPS值代入拟合公式A，并得出样品内的Ca2+浓度，通过称量离心前与离心后离心管的质量差，将Ca2+浓度换算为质量单位，校正由于稀释和离心过程中由于体积变化而造成的实验误差，在实验过程中使用超纯水缓冲液中的Ca2+浓度忽略不计；
计算出的Ca2+质量与cTnC溶液浓度进行线性拟合，将通过质量法计算的cTnC的实际浓度与计算得到的溶液中钙离子质量拟合线性公式B；
将提取后的血清样品按照相同方法测得的CPS值代入两个线性拟合公式，并且校准体积后，得到血清中cTnI的定量结果。
2.根据权利要求1所述的血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，其特征在于：所述EDTA缓冲液为20mM Tris、200mM KCI、1mM DTT、5mM EGTA、10mM EDTA，pH6.5。
3.根据权利要求2所述的血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，其特征在于：所述透析缓冲液为20mM Tris、200mM KCl、1mM DTT，pH 7.5。
4.根据权利要求3所述的血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，其特征在于：CaCl2缓冲液为20mM Tris、200mM KCl、1mM DTT、5mM CaCl2，pH 7.5。
5.根据权利要求4所述的血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，其特征在于：ICP-MS方法采用全定量模式，检测Ca43、Ca44两种同位素。
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