CN110066749A - 一种微生物复合菌制剂及其应用 - Google Patents

一种微生物复合菌制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物复合菌制剂及其制备方法和应用，该微生物复合菌制剂至少包括瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8发酵产物和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NS12发酵产物。本发明将NS8发酵液和NS12发酵液进行混合，得到的微生物复合菌制剂具有防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤中的用途，为受到紫外线照射损伤的皮肤提供了候选的保护物，可用于制备皮肤用品组合物。

Description

一种微生物复合菌制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药及食品技术领域，尤其涉及一种微生物复合菌制剂及其应用。
背景技术
皮肤作为抵御各种环境压力的有效屏障，在调节人体内环境平衡方面发挥着重要作用。太阳紫外线辐射(主要是UVA和UVB)已被广泛认为是引起几种皮肤疾病的主要原因，如红斑、干燥、色素异常、炎症、老化和皮肤癌。连续暴露在紫外线辐射下会降低细胞抗氧化酶***的效率，促进自由基和活性氧物质(ROS)的积累。这种光氧化应激会对皮肤和表皮组织的细胞DNA、蛋白质、脂类和碳水化合物造成损害。另外一个重要方面，皮肤暴露于紫外线后，长时间激活黑色素生成，造成黑色素过度沉积。黑色素生物合成途径在紫外线辐射期间产生活性氧和过氧化氢，相反，活性氧介导的应激也导致黑素细胞中黑素生成失调。在这种情况下，鼓励紫外线防护是皮肤护理中采用的主要健康策略。
常见的防晒成分，多来源于合成的或部分天然产品，如曲酸、维生素C、类胡萝卜素和多酚。这些物质存在稳定性差、造价高等实际应用的问题，因此有必要寻求其它可替代的有效成分。
近年来，乳杆菌Lactobacillus等益生菌促进人体健康的功能和机制逐渐受到人们的关注和公认，尤其是维护和提高机体免疫力方面，比如改善肠道炎症、预防癌症等。
最新的一些临床试验和实验室研究表明，益生菌提高机体免疫力的作用不仅仅局限于胃肠道功能，还可以改善或治疗过敏性皮炎、婴幼儿湿疹、慢性皮肤创伤等症状，这说明益生菌对于皮肤***的免疫调节也十分有效。
授权公告号为CN101090706B的发明专利公开了有效量的属于副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌菌种中的至少一种微生物、其部分或其代谢物与有效量的属于双歧杆菌乳或双歧杆菌菌种中的至少一种微生物、其部分或其代谢物的组合在制备用于治疗和/或预防与干性皮肤相关或不相关的反应型敏感性皮肤的皮肤用组合物中的应用。
授权公告号为CN102105132B的发明专利公开了有效量的至少一种益生微生物和/或其部分和/或其代谢物作为用于治疗和/或预防油性皮肤或具有油性趋势的皮肤以及相关皮肤病症的试剂的美容应用。
因此，有必要开发更多益生菌作为皮肤保护的候选物，以维持皮肤的健康状况，并减轻紫外线介导的皮肤光损伤。
发明内容
本发明提供了一种微生物复合菌制剂及其应用，该微生物复合菌制剂具有防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤中的用途，为受到紫外线照射损伤的皮肤提供了候选的保护物，可用于制备皮肤用品组合物。
具体技术方案如下：
一种微生物复合菌制剂，至少包括微生物A的发酵产物和微生物B的发酵产物；
所述微生物A为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8；
所述微生物B为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)NS12；
所述发酵产物均为微生物发酵后过滤获得的无菌发酵液。
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NS12分离自锡林郭勒地区的Koumiss，由中国科学院心理健康重点实验室行为生物学实验室分离鉴定并保存，均为市售产品，不涉及菌种的保藏。
本发明中德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)NS12对瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8起到协同增效的作用，进一步提高微生物复合菌制剂在修复紫外线造成的皮肤损伤中的作用效果。
经过细胞学实验发现，NS8和NS12发酵产物的混合制剂具有较高的清除自由基、抑制黑色素生成和改善脂质和胆固醇代谢的活性。
进一步经过皮肤测试，NS8和NS12复合菌组合可以有效防护由紫外线造成的皮肤红斑、皮肤黑色素沉积、皮肤失水等损伤。通过分子生物学手段，我们还发现复合菌组合可以有效抑制紫外线诱导的酪氨酸酶活性，并同时保护紫外线对皮肤抗氧化酶***的影响。
进一步地，本发明提供了一种具体的微生物复合菌制剂，由微生物A的发酵产物和微生物B的发酵产物组成；
以微生物复合菌制剂的体积计，微生物A发酵产物的体积分数为50～90％，微生物B发酵产物的体积分数为10～50％。
作为优选，微生物A发酵产物的体积分数为75％，微生物B发酵产物的体积分数为25％。
进一步地，所述微生物A发酵产物或微生物B发酵产物的制备方法，包括：
(1)取微生物A或微生物B，活化后，进行种子培养，得到种子培养液；
(2)将种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物；
(3)将所述发酵产物离心，取上清液，过滤后，得到无菌的微生物A发酵液或微生物B发酵液。
作为优选，所述种子培养时采用的种子培养基为10％的脱脂乳水溶液；以体积分数计，种子培养液接种至发酵培养基的接种量为5％；
所述发酵培养基为体积分数10％的脱脂乳水溶液；发酵培养的温度为35～45℃，时间为10～15h。
本发明微生物复合菌制剂的制备方法为将微生物A发酵液和微生物B发酵液按比例混合，得到微生物复合菌制剂。
本发明还提供了所述的微生物复合菌制剂在制备防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤用品组合物中的应用。
进一步地，所述微生物复合菌制剂的施用计量为50～150μL/cm2。
进一步地，本发明通过试验发现，所述微生物复合菌制剂通过抑制紫外线引起的表皮增厚防护紫外线造成的皮肤损伤。
进一步地，本发明通过试验发现，所述微生物复合菌制剂通过缓解紫外线引起的皮肤失水和/或红斑防护紫外线造成的皮肤损伤。
进一步地，本发明通过试验发现，所述微生物复合菌制剂通过减少紫外线引起的黑色素沉积防护紫外线造成的皮肤损伤。
进一步地，所述皮肤用组合物包括成人或儿童使用的护肤用品组合物和医药用品组合物，例如防晒化妆品和皮肤护理品等；
其中，用于制备防晒化妆品时，可将微生物复合菌制剂作为配料用于乳状液、面膜、霜剂、喷剂等主要用于皮肤表面的防护产品。
其中，用于制备皮肤护理品时，可将微生物复合菌制剂作为配料用于乳状液、面膜、霜剂、喷剂等主要用于皮肤表面的晒后护理产品或日常护理产品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8发酵液和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NS12发酵液进行混合，得到的微生物复合菌制剂具有防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤中的用途，为受到紫外线照射损伤的皮肤提供了候选的保护物，可用于制备皮肤用品组合物。
(2)本发明微生物复合菌制剂通过抑制紫外线引起的表皮增厚、缓解紫外线引起的皮肤失水和红斑、减少紫外线引起的黑色素沉积的方式，提高皮肤对于紫外线对其所造成的损伤。
(3)本发明微生物复合菌制清除自由基的能力与维生素C相当，而稳定性则明显优于维生素；其抑制黑色素生成效果曲酸等功效相当，而安全性优于曲酸。
(4)本发明微生物复合菌制的制备方法简单，成本低，有利于其产业利用；且其本质来自于食物，具有天然、安全、无毒、无污染等特点，可用于制备化妆品或皮肤护理品中，应用广泛，社会效益和经济效益显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中涉及的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NS12分离自锡林郭勒地区的Koumiss，由中国科学院心理健康重点实验室行为生物学实验室分离鉴定并保存，均为市售产品，不涉及菌种的保藏。
实施例1微生物复合菌制剂的制备
1、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8
具体步骤为：
1)将-80℃冻存的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8接种到MRS培养基中复苏，然后将单个克隆接种到种子培养基中，进行种子发酵，得到高密度的种子液；
MRS培养基的成分(g/L)：
种子发酵的条件：培养温度为37℃，培养时间为20小时。
2)按质量分数为5％的比例将种子液接种至(体积分数)10％脱脂乳的水溶液中，40℃发酵12小时，进行第一次扩大发酵培养，然后按相同的条件按质量分数为5％的比例将种子液接种至10％脱脂乳的水溶液中，40℃发酵24小时，进行第二次扩大发酵培养，得到发酵产物；
3)将发酵产物于3,000g离心10分钟，转移离心后的上清液；
4)将发酵上清液通过孔径0.22μm的滤膜进行无菌过滤，得到无菌的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8发酵液。
2、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NS12
1)将-80℃冻存的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)NS12接种到MRS培养基中复苏，然后按质量分数为5％的接种量接种到种子培养基中，进行种子发酵，得到高密度的种子液；
MRS培养基的组分和用量：同上。
种子发酵的条件：培养温度为37℃，培养时间为20小时。
2)按质量分数为5％的比例将种子液接种至(体积分数还是质量分数)10％脱脂乳的水溶液中，40℃发酵12小时，进行第一次扩大发酵培养，然后按相同的条件按质量分数为5％的比例将种子液接种至10％脱脂乳的水溶液中，40℃发酵24小时，进行第二次扩大发酵培养，得到发酵产物；
发酵培养基的组分和用量：10％脱脂乳的水溶液。
3)将发酵产物于3,000g离心10分钟，转移离心后的上清液；
4)将发酵上清液通过孔径0.22μm的滤膜进行无菌过滤，得到无菌的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)NS12发酵液。
3、微生物复合菌制剂
将步骤1获得的无菌瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8发酵产物A和步骤2获得的无菌德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)NS12发酵产物B进行混合，得到微生物复合菌制剂；
其中，以微生物复合菌制剂的总体积计，发酵产物A的体积分数为75％，发酵产物B的体积分数为25％。
实施例2微生物复合菌制剂在抑制紫外线引起的表皮增厚的作用
1)雌性SKH-1无毛小鼠(8周龄，分三组:对照组/UVB照射组/UVB照射+微生物复合菌制剂组；每组10只)，饲喂标准饮食和自来水，并在23℃条件下，12小时光/12小时暗循环保持在SPF环境中；
2)通过使用紫外线灯(峰值辐射为313nm)，动物每周三次暴露在紫外线照射下；将UVB的初始剂量设置为36mJ/cm2，随后每周增加1/3辐照量，直到总辐射剂量达到1.8J/cm2(总共8周)。
3)每天用200μL实施例1制备的微生物复合菌制剂于2平方厘米背部皮肤给药，给药时间为照射前一小时。
4)用二氟甲烷和颈椎脱位处死动物后，迅速分离背部皮肤。
5)皮肤样品固定在4％多聚甲醛中，制成常规石蜡切片，苏木精/伊红(H&E)染色。
6)切片的显微图像由Pannoramic扫描仪(美国Perkinelmer)捕获，选择每个样品的四个不同区域，测量样品中表皮的厚度。
测试结果：
表1.小鼠表皮厚度(单位：μm)
处理 表皮厚度(μm)
对照 21.1023±1.2099
UVB 96.0328±11.1482
UVB+微生物复合菌制剂 49.3251±8.1999
如表1所示，微生物复合菌制剂可以显著抑制由紫外线引起的表皮增厚现象。
实施例3微生物复合菌制剂缓解紫外线引起的皮肤失水功能
1)雌性SKH-1无毛小鼠(8周龄，分三组:对照组/UVB照射组/UVB照射+微生物复合菌制剂组；每组10只)，饲喂标准饮食和自来水，并在23℃条件下，12小时光/12小时暗循环保持在SPF环境中。
2)通过使用紫外线灯(峰值辐射为313nm)，动物每周三次暴露在紫外线照射下。将UVB的初始剂量设置为36mJ/cm2，随后每周增加1/3辐照量，直到总辐射剂量达到1.8J/cm2(总共8周)。
3)每天用200μL微生物复合菌制剂于2平方厘米背部皮肤给药，给药时间为照射前一小时。
4)辐照周期结束后，采用多探针适配***MPa5(德国Courage-Khaz aka)TM300探针，测量活体皮肤的经皮失水量(TEWL)。
测试结果：
表2.小鼠表皮经皮失水量(单位：g/m2/h)
处理 皮失水量(g/m<sup>2</sup>/h)
对照 18.9564±5.9723
UVB 51.7600±15.2326
UVB+微生物复合菌制剂 23.5320±4.0354
如表2所示，微生物复合菌制剂可以显著抑制由紫外线引起的皮肤水分丢失。
实施例4微生物复合菌制剂缓解紫外线引起的皮肤发红(红斑)的作用
1)雌性SKH-1无毛小鼠(8周龄，分三组:对照组/UVB照射组/UVB照射+微生物复合菌制剂组；每组10只)，饲喂标准饮食和自来水，并在23℃条件下，12小时光/12小时暗循环保持在SPF环境中。
2)通过使用紫外线灯(峰值辐射为313nm)，动物每周三次暴露在紫外线照射下。将UVB的初始剂量设置为36mJ/cm2，随后每周增加1/3辐照量，直到总辐射剂量达到1.8J/cm2(总共8周)。
3)每天用200μL微生物复合菌制剂于2平方厘米背部皮肤给药，给药时间为照射前一小时。
4)辐照周期结束后，采用多探针适配***MPa5(德国Courage-Khazaka)MX 18探针，测量活体皮肤的红斑系数。
测试结果：
表3.小鼠皮肤红斑(单位：红斑系数)
如表3所示，微生物复合菌制剂可以显著抑制由紫外线引起的皮肤发红或红斑现象。
实施例5微生物复合菌制剂缓解紫外线引起的皮肤黑色素沉积
1)对10只棕色豚鼠(雌性，300-350g)进行紫外线辐照实验；照射程序和局部给药与SKH-1小鼠的实验(即：实施例1的实验)相似，但UVB的初始剂量设置为120mJ/cm2，并持续到出现明显的色素沉着为止(总共3周)。
2)在第一次UVB照射前，将豚鼠置于水合氯醛(250mg/kg)深度麻醉下，用婴儿理发器将背部毛发剔出三个无毛区域(2平方厘米，分别为辐照区(即：UVB)、辐照区+微生物复合菌制剂防御区(即：UVB+微生物复合菌制剂)、辐照区+5％曲酸区(即：UVB+曲酸))，同时留出1个有毛的空白对照(即：Control)区域。
3)辐照周期结束后，采用多探针适配***MPa5(德国Courage-Khaz aka)MX 18探针，测量活体皮肤的黑色素系数。
表4.小鼠黑色素(单位：黑色素系数)
处理 黑色素(黑色素系数)
Control 321.5000±60.6042
UVB 654.400±119.3470
UVB+微生物复合菌制剂 420.8730±100.4512
UVB+曲酸 553.0279±98.1094
测试结果：
如表4所示，微生物复合菌制剂可以显著抑制由紫外线引起的黑色素沉积，且效果好于对照品曲酸。

Claims (10)

1.一种微生物复合菌制剂，其特征在于，至少包括微生物A的发酵产物和微生物B的发酵产物；
所述微生物A为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)NS8；
所述微生物B为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)NS12；
所述发酵产物均为微生物发酵后过滤获得的无菌发酵液。
2.如权利要求1所述的微生物复合菌制剂，其特征在于，由微生物A的发酵产物和微生物B的发酵产物组成；
以微生物复合菌制剂的体积计，微生物A发酵产物的体积分数为50～90％，微生物B发酵产物的体积分数为10～50％。
3.如权利要求1所述的微生物复合菌制剂，其特征在于，由微生物A的发酵产物和微生物B的发酵产物组成；
以微生物复合菌制剂的体积计，微生物A发酵产物的体积分数为75％，微生物B发酵产物的体积分数为25％。
4.如权利要求1所述的微生物复合菌制剂，其特征在于，所述微生物A发酵液或微生物B发酵液的制备方法，包括：
(1)取微生物A或微生物B，活化后，进行种子培养，得到种子培养液；
(2)将种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物；
(3)将所述发酵产物离心，取上清液，过滤后，得到无菌的微生物A发酵液或微生物B发酵液。
5.如权利要求1～4任一项所述的微生物复合菌制剂在制备防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤用品组合物中的应用。
6.如权利要求5所述的微生物复合菌制剂在制备防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤用品组合物中的应用，其特征在于，所述微生物复合菌制剂的施用计量(或浓度)为50～150μL/cm2。
7.如权利要求5所述的微生物复合菌制剂在制备防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤用品组合物中的应用，其特征在于，所述微生物复合菌制剂通过抑制紫外线引起的表皮增厚防护紫外线造成的皮肤损伤。
8.如权利要求5所述的微生物复合菌制剂在制备防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤用品组合物中的应用，其特征在于，所述微生物复合菌制剂通过缓解紫外线引起的皮肤失水和/或红斑防护紫外线造成的皮肤损伤。
9.如权利要求5所述的微生物复合菌制剂在制备防护紫外线造成的皮肤损伤的皮肤用品组合物中的应用，其特征在于，所述微生物复合菌制剂通过减少紫外线引起的黑色素沉积防护紫外线造成的皮肤损伤。
10.如权利要求1～9任一项所述的应用，其特征在于，所述皮肤用组合物包括成人或儿童使用的护肤用品组合物和医药用品组合物。
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