CN106480081A - 一种单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法，dCas9载体的序列如SEQ ID NO.6所示，图谱如附图2所示，CRISPRi载体通过将含有sgRNA启动子和sgRNA scaffold的基因片段重组到经酶切的dCas9载体中获得。发明利用CRISPRi技术，将dCas9蛋白和sgRNA scaffold构建到一个质粒***中，实现在一个质粒中同时表达sgRNA和dCas9蛋白。该***仅需要一次构建、一次转化即可实现sgRNA和dCas9蛋白的表达，该法过程简单、高效、快捷，大大简化质粒构建流程，缩短实验周期，提高工作效率。

Description

一种单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法。
背景技术
基因沉默技术通过降低基因表达水平改变表型，从而验证基因的功能，是目前基因功能验证的重要方法之一。目前，最常用的基因沉默手段主要是RNA干扰(RNAinterference，RNAi)和反义吗啉代寡核苷酸干扰(Morpholino)。Morpholino是***啉类似物修饰的反义寡核苷酸，与mRNA前体或与剪切处结合，通过空间位阻特异性抑制翻译或RNA剪切，实现基因沉默。但该法效应短暂且对成体表型几乎无影响，只适于生物发育初期基因功能研究。RNAi是生物体的一种在进化上保持高度保守的、能抵御外源基因或外来病毒侵犯的重要防御机制，是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象，广泛存在于动、植物等各种生物体内，主要用于基因功能分析、基因表达调控、信号传导、抗病毒、抗肿瘤、发育机制、发病机理等的研究。RNA i技术能够持久的抑制基因的表达，该技术是介导mRNA降解来抑制基因表达，克服了反义吗啉代寡核苷酸干扰的缺陷，但是该法阻滞效率及准确度较低，阻碍了其发展。
随着研究的进一步深入，人们发现当外源基因侵入细菌时，一种成簇而规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)会将基因片段整合保存，待相同基因片段再次入侵时，CRISPR及其相关蛋白会将该外源基因剪切破坏，这种现象在细菌和古细菌中普遍存在。在细菌和古细菌中，CRISPR是其适应性免疫***的重要部分。Cas蛋白与crRNA形成复合体，后者以碱基互补配对方式特异性识别外源基因，Cas蛋白发挥酶活性将其切断；CRISPR干扰(CRISPR inference,CRISPRi)***作用机制完全不同于RNAi技术，将Cas9蛋白酶活性去除，复合体仅与目的基因结合而非剪切，直接阻断编码区转录。与常用的基因沉默技术相比，CRISPRi技术具有以下突出优点:1)与RNAi介导mRNA降解相比，CRISPRi技术直接阻滞DNA转录，抑制RNA合成，阻滞级别更高、更准确；2)可对多个靶点同时编辑；3)实现可逆性基因沉默；4)沉默效率较高，载体构建简单，只需设计目的基因的sgRNA。因此，对CRISPRi技术的研究开发成为功能基因组学领域的研发热点，其将给基因功能研究、基因编辑、建立基因病动物模型、基因治疗的发展带来新的曙光。
麻省理工合成生物学中心的Sara Cleto团队利用CRISPRi技术抑制了谷氨酸棒状杆菌中的pck与pyk基因表达，减少非目标产物的合成从而提高了目标产物L-赖氨酸与L-谷氨酸在产物中的比例。威斯康辛大学的Gina C.Gordon团队通过CRISPRi技术抑制蓝藻中羧基体相关基因的表达提高了蓝藻从大气中固定二氧化碳的能力，从而提高了蓝藻的光合作用效率。上述两个方案均是采用CRISPRi技术抑制基因的表达，但是其由两个质粒构建而成，将sgRNA与dCas9蛋白在两个质粒***分开表达，需要2次转化才能完成基因的表达，具有构建过程繁琐、时间长、效率低的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够在一个CRISPR质粒***中同时表达dCas9和sgRNA，仅需一次转化即可完成sg RNA scaffold与dCas9蛋白的表达的单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法，该CRISPRi载体构建过程简单、快速，可大大提高效率。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种dCas9载体，所述的dCas9载体的序列如SEQ IDNO.6所示，图谱如附图2所示。
本发明的另一个目的是提供一种单质粒***的CRISPRi载体，所述的CRISPRi载体通过将含有sgRNA启动子和sgRNA scaffold的基因片段重组到经酶切的dCas9载体中获得。
具体地，所述的基因片段还包括酶切位点和重组臂。
优选地，所述的酶切位点为SpeI酶切位点。
具体地，所述的基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，所述的dCas9载体采用SpeI酶进行酶切。
具体地，所述的CRISPRi载体的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种所述的单质粒***的CRISPRi载体的制备方法，其包括如下步骤：
步骤(1)、设计并合成基因片段；
步骤(2)、将dCas9载体进行酶切，酶切后，采用琼脂糖凝胶电泳回收酶切过的dCas9载体；
步骤(3)、将所述的基因片段和所述的酶切过的dCas9载体在45～55℃下进行重组反应50～70min得到所述的CRISPRi载体。
具体地，步骤(3)中，进行所述的重组反应的反应体系为：
本发明的第四个目的是提供一种单质粒***的制备方法，其通过将所述的CRISPRi载体转化到大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，然后经培养抽取质粒得到所述的单质粒***。
具体地，将所述的CRISPRi载体冷加入到于冰上融化的大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，混匀，冰浴放置20～40min，然后于40～44℃热激80～100秒，冰浴1～3min，加入LB培养基，36～38℃恢复培养50～70min，离心后弃去上清，沉淀重悬后均匀涂布氯霉素筛选平板上，于36～38℃培养11～13h，然后挑选单菌落于LB培养基中，放入36～38℃摇床1～2h后，取菌液进行菌检PCR扩增并测序，将测序结果与设计序列进行比对，确定正确克隆，将正确克隆的菌液抽取质粒，即所述的单质粒***。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明利用CRISPRi技术，将dCas9蛋白和sgRNA scaffold构建到一个质粒***中，实现在一个质粒中同时表达sgRNA和dCas9蛋白。该***仅需要一次构建、一次转化即可实现sgRNA和dCas9蛋白的表达，该法过程简单、高效、快捷，大大简化质粒构建流程，缩短实验周期，提高工作效率。
附图说明
附图1为平板上的菌落图，其中，左图的平板含氯霉素和不含无水四环素，菌落呈蓝色；右图的平板含氯霉素和含无水四环素，菌落呈白色；
附图2为dCas9载体的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。本发明中的Gibson组装预混液购自NEB公司的货号：#E2611S。
实施例1：dCas9载体的合成
(1)、用常规基因合成方法合成如SEQ ID NO.7～9所示的三个片段；
(2)、将这三个片段放到PCR管中，按以下体系加入试剂，并反应；
50℃ 1h
4℃ ∞
(3)、然后将反应体系转化到stbl3感受态细胞中，然后经后处理得到dCas9载体，其序列如SEQ ID NO.6所示，图谱如附图2所示。
实施例2：
1、根据已知序列设计目标序列：“sgRNA启动子+酶切位点+sgRNA scaffold表达框”片段，采用常规基因合成方法合成目标序列。目标序列如SEQ ID NO.1所示；其中，重组臂的序列为ACGATATAAGTTGTTGAATTCTAAAGATCT和TTTTTTTGAAGCTTGGGCCCACGAGAGAGA，sgRNA启动子的序列为TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAAT，酶切位点的序列为ACTAGT，sgRNAscaffold表达框的序列为GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。
2、SpeI酶切dCas9载体，反应体系如表1所示，酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收酶切过的dCas9载体。
表1
组分 用量
dCas9载体 1μg
SpeI酶 1μl
10×SpeI buffer 5μl
ddH2O 补足50μl
总体积 50μl
3、于50℃下反应60min，将合成的“sgRNA启动子+酶切位点+sgRNA scaffold表达框”片段重组到SpeI内切酶切开的dCas9载体上，并于4℃保存，CRISPRi载体的序列如SEQID NO.2所示。重组反应体系如表2所示。
表2
4、转化与涂板
将上述重组产物冷加入到于冰上融化的大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，冰浴放置30min。42℃热激90秒，冰浴2min。加入400～500μL LB培养基，37℃恢复培养60min。5000rpm离心5min后弃去上清，沉淀重悬后均匀涂布氯霉素筛选平板上。于37℃培养12h。
5、克隆鉴定：
用无菌牙签挑选单菌落于200μl的LB培养基中，放入37℃摇床1～2h后，取菌液进行菌检PCR扩增(菌检与测序引物序列为：F:TCAAAGAGTTGGTAGCTCAG(SEQ ID NO.3)；R:ACTCCTGTTGATAGATCCAG(SEQ ID NO.4))，菌检PCR扩增的反应体系如表3所示，扩增程序如表4所示，剩余菌液继续放入摇床。6h后将检到目标大小条带的菌液送测序4个。测序引物即菌检引物。
将测序结果与设计序列进行比对，确定正确克隆。
表3
组分 用量(μl)
菌液 3μl
F引物 1μl
R引物 1μl
taq酶 1μl
10×taq buffer 3μl
ddH2O 20μl
dNTPs 1μl
总体积 30μl
表4
6、将正确克隆的菌液抽取质粒，即目标质粒。
7、实施例中以LacZ为靶位点设计sgRNA序列，重组到目标质粒上，LacZ-sgRNA序列为(SEQ ID NO.5)：AGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTAGCGGATAACAATTTCACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT(其中倾斜部分为重组臂；sgRNA的重组方法同第三步)。
8、转化涂板
转化涂板方法同第四步，平板为氯霉素抗性并添加无水四环素。
9、克隆鉴定
克隆鉴定方法同第五步，挑取蓝色单克隆菌检并测序。菌检与测序引物同第五步。
10、将测序鉴定正确的菌液在含氯霉素，+/-无水四环素的平板上划线：可见在不含无水四环素的平板上菌落呈蓝色，在含有无水四环素的平板上菌落呈白色，说明LacZ基因被CRISPRi***抑制。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种dCas9载体，其特征在于：所述的dCas9载体的序列如SEQ ID NO.6所示，图谱如附图2所示。
2.一种单质粒***的CRISPRi载体，其特征在于：所述的CRISPRi载体通过将含有sgRNA启动子和sgRNA scaffold的基因片段重组到经酶切的如权利要求1所述的dCas9载体中获得。
3.根据权利要求2所述的单质粒***的CRISPRi载体，其特征在于：所述的基因片段还包括酶切位点和重组臂。
4.根据权利要求3所述的单质粒***的CRISPRi载体，其特征在于：所述的酶切位点为SpeI酶切位点。
5.根据权利要求2所述的单质粒***的CRISPRi载体，其特征在于：所述的基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求2所述的单质粒***的CRISPRi载体，其特征在于：所述的dCas9载体采用SpeI酶进行酶切。
7.根据权利要求2所述的单质粒***的CRISPRi载体，其特征在于：所述的CRISPRi载体的序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种如权利要求2至7中任一项所述的单质粒***的CRISPRi载体的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
步骤(1)、设计并合成基因片段；
步骤(2)、将dCas9载体进行酶切，酶切后，采用琼脂糖凝胶电泳回收酶切过的dCas9载体；
步骤(3)、将所述的基因片段和所述的酶切过的dCas9载体在45～55℃下进行重组反应50～70min得到所述的CRISPRi载体。
9.根据权利要求8所述的单质粒***的CRISPRi载体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，进行所述的重组反应的反应体系为：
10.一种单质粒***的制备方法，其特征在于：其通过将权利要求2至7中任一项所述的CRISPRi载体转化到大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，然后经培养抽取质粒得到所述的单质粒***。
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