CN110018266A - 一种快速定量分析48种氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速定量分析48种氨基酸的方法。本发明提供了一种衍生化HPLC‑MS/MS法的定量分析检测氨基酸含量的衍生化试剂组合，包括衍生化试剂A和衍生化试剂B；其中，衍生化试剂A为正丙醇和3‑甲基吡啶的混合溶液，衍生化试剂B为的二氯甲烷、氯甲酰丙酯和异辛烷的混合溶液。并进一步建立了基于该衍生化方法的稳定同位素内标液组合、样品前处理方法和液相色谱‑串联质谱方法。本发明提出的衍生化试剂衍生化效率高，试剂毒性低；方法所需样品量少、处理简单、快速、重复性好，检测成本低；实现了仅用了22min对48种氨基酸的绝对定量分析，大大缩短了分析时间，提高了检测通量；具有很大的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种快速定量分析48种氨基酸的方法。
背景技术
氨基酸是含有氨基和羧基官能团的一类有机化合物，是蛋白质的基本组成单位和代谢产物，是一类重要的生物标志物。对人体液(包括血液，尿液，脑脊液，组织液)中氨基酸含量进行分析，可用于氨基酸代谢障碍类疾病的筛查和辅助诊断及人体营养状况的评估和监测。
氨基酸代谢障碍类疾病常导致多个氨基酸水平发生变化，这对传统的分析方法提出了挑战，一次分析一个化合物的ELISA法完全不适用于这类化合物的分析。另外，氨基酸同分异构体的存在进一步增加了分析的难度。由于大部分氨基酸为低分子量、高极性化合物，目前，氨基酸分析常采用柱前或柱后衍生-色谱法或色谱/质谱法进行分析。
在临床上应用的氨基酸分析方法主要包括离子交换色谱-柱后茚三酮衍生化法(IEX)，OPA/FMOC柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)，iTraq柱前衍生-液相色谱串联质谱法(iTraq-LC-MS/MS)等。但是，这些方法各自存在一些缺陷，限制了它们在临床实验室的推广应用：IEX法存在数据采集时间长(>120min)及不能对甲硫氨酸和同型瓜氨酸等重要生物标志物进行分离的缺点；OPA/FMOC-HPLC法一次只能分析20多种常见氨基酸，数据采集时间比IEX法快，但一个样品也需30min，抗基质干扰能力差、同分异构体分离能力差，导致方法特异性不高；iTraq-LC-MS/MS法具有快速、灵敏等优点，但该法所使用的iTraq试剂价格昂贵，且该法对含硫氨基酸，如甲硫氨酸，胱氨酸，半胱氨酸，同型胱氨酸，同型半胱氨酸等的检测存在重复性差，回收率低(<80％)的缺点。
九十年代初，有学者提出采用氯甲酰酯衍生-气相色谱质谱法对氨基酸进行分析，该法显著提高了方法灵敏度及检测通量，但该法无法检测含胍基的氨基酸，如瓜氨酸，同型瓜氨酸，精氨酸等，而这一类化合物在筛查和诊断尿素循环障碍类疾病(属氨基酸代谢障碍类疾病)具有重要意义。Phenomenex公司推出的EZ:Faast衍生化-HPLC-MS/MS法检测血浆氨基酸就是在上述氯甲酰酯衍生化前处理的基础上开发的方法，该法可对胍基类氨基酸进行分析，，但前处理过程采用固相萃取法提取氨基酸后进行衍生化反应的方案，需要的血浆量大(100μL血浆)，试验步骤多，操作繁琐，从而影响了方法回收率和准确度；其次，Phenomenex EZ:Faastt衍生化试剂中的吡啶及三氯甲烷具有高毒性。再次，Phenomenex EZ:Faast仅用了3个化合物作为内标，不能对分子结构各异的氨基酸在样品前处理过程中萃取、衍生化反应的差异及数据采集过程中存在的基质效应、离子抑制效应等导致的差异进行校准，无法对所有分析物进行绝对定量分析。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速定量分析48种氨基酸的方法。
本发明的第一个目的是提供一种HPLC-MS/MS法定量分析检测氨基酸的衍生化试剂组合。
本发明的第二个目的是提供一种13C3-标记的氨基酸酯化物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的内标液组合。
本发明的第四个目的是提供一种衍生化HPLC-MS/MS法定量分析氨基酸含量的样品前处理的方法。
本发明的第五个目的是提供一种衍生化HPLC-MS/MS法的分析检测氨基酸的方法。
本发明的第六个目的是提供一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒。
本发明的第七个目的是提供所述衍生化试剂组合、所述制备方法、所述内标液组合、所述样品前处理方法、所述方法或所述试剂盒任一在检测氨基酸中的应用。
本发明的第八个目的是提供所述衍生化试剂组合、所述制备方法或所述内标液组合任一在制备衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒种的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明提供了一种衍生化HPLC-MS/MS法的定量分析检测氨基酸含量的衍生化试剂组合，并进一步建立了基于该衍生化方法的稳定同位素内标液组合、样品前处理方法和液相色谱-串联质谱方法。
一种HPLC-MS/MS法分析检测氨基酸的衍生化试剂组合，包括衍生化试剂A和衍生化试剂B；其中，衍生化试剂A为正丙醇和3-甲基吡啶的混合溶液，衍生化试剂B为的二氯甲烷、氯甲酰丙酯和异辛烷的混合溶液。
本衍生化方法基于氨基酸的氨基和羧基，在水相体系中能迅速与氯甲酰丙酯及正丙醇反应生成酯化物的原理。3-甲基吡啶为该反应的催化剂，二氯甲烷和异辛烷的加入有利于反应温和进行，并提高了反应效率。
优选地，所述衍生化试剂组合能用于定量分析检测氨基酸、含氨基的小分子化合物或羧基的小分子化合物含量。
优选地，以体积分数计算，衍生化试剂A含有70％～80％的正丙醇和20％～30％的3-甲基吡啶。
优选地，衍生化试剂A中，正丙醇和3-甲基吡啶的体积比为77：23。
优选地，以体积分数计算，衍生化试剂B含有65％～75％的二氯甲烷、15％～20％的氯甲酰丙酯和20％～5％的异辛烷。
优选地，衍生化试剂B中，二氯甲烷、氯甲酰丙酯和异辛烷的体积比为71.6：17.4：11。
本法采用氯甲酰丙酯/丙醇衍生化方法，衍生化试剂采用3-甲基吡啶及二氯甲烷分别替代了Phenomenex EZ:Faast衍生化试剂中的高毒性的吡啶及三氯甲烷，优化后的衍生化试剂有效提高了衍生化效率和产物的萃取效率，提高了方法灵敏度，只需2.5μL样本即可完成48种氨基酸的定量分析(原法需要100μL血浆)。
本发明要求保护一种13C3-标记的氨基酸酯化物的制备方法，待标记氨基酸溶液依次加入所述衍生化试剂A和所述衍生化试剂B混合，再加入中性盐/过饱和的中性盐溶液混匀，得到混合溶液，用乙酸乙酯对混合溶液进行萃取得到萃取液，萃取液以乙酸乙酯稀释，即得，待标氨基酸混合液、13C3-丙醇、3-甲基吡啶、衍生化试剂B的体积比为：20～60：4～10：1～4：4～12。
优选地，待标记氨基酸溶液中各氨基酸酯化物的浓度需≥校准曲线第二个浓度级别校准品中相应氨基酸的浓度。
优选地，待标记氨基酸溶液、13C3-丙醇、3-甲基吡啶、衍生化试剂B的体积比为200：31：10：30。
由于在LC-MS/MS法中，存在基质效应，即相同浓度的分析物在不同基质(如水、血、尿)中，采用LC-MS/MS分析检测到的响应(即峰面积或峰高)不同，通常情况下，基质为水的样品，分析物响应会明显高于基质为血浆的样品。如果校准品用水配制，而检测样品是血浆，则不能真实反应血浆中分析物的浓度。为抵消基质效应，需加入与分析物结构类似而样品中又不存在的化合物作为内标，同位素标记的分析物就是最好的内标。此外，内标液的使用还可以抵消样品前处理过程中吸液，移液操作以及仪器吸样过程产生的不准确度。
因此，本发明要求保护一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的内标液组合，包括内标液A和内标液B；
内标液A为D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚的水溶液，D3-蛋氨酸的浓度为2～10μmol/L，D4-胱硫醚的浓度为0.5～2μmol/L；
内标液B为氨基酸的13C3-标记的氨基酸酯化物，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、α-氨基己二酸、鸟氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、同型精氨酸、同型瓜氨酸、还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、焦谷氨酸、吡哌酸和δ-氨基戊酮酸的一种或几种。
检测时，根据待检测氨基酸的种类选择加入内标液B的氨基酸的种类，当以上44中氨基酸全部加入内标液B时，可以用于以下48种氨基酸的检测：氨基酸为乙醇胺、焦谷氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、1-甲基组氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、β-丙氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、肌氨酸、β-氨基异丁酸、α-氨基丁酸、甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸、组氨酸、酵母氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、α-氨基己二酸、吡哌酸、精氨酰琥珀酸、胱硫醚、犬尿氨酸、精氨酸、同型精氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、丝氨酸、同型瓜氨酸、羟脯氨酸、N-乙酰基天冬氨酸、苏氨酸、N-甘氨酰脯氨酸、δ-氨基戊酮酸、脯氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、缬氨酸、色氨酸、还原型谷胱甘肽、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和酪氨酸；去掉某种氨基酸后相应的无法对样品中该氨基酸进行绝对定量分析；另外，去掉焦谷氨酸可能会影响样品中焦谷氨酸及乙醇胺测定的准确度，去掉同型瓜氨酸可能会影响样品中同型瓜氨酸及δ-羟赖氨酸测定的准确度。
此内标液组合可以长期保存，4℃下可保存至少一年。
本发明通过合成稳定同位素内标，极大地降低了分析成本，避免购买昂贵的氨基酸同位素标记物，尤其是部分氨基酸暂无商业用途的同位素标记物，实现了对氨基酸的绝对定量分析。同时，由于合成的13C3-标记的胱硫醚及甲硫氨酸酯化物在乙酸乙酯中不稳定，不利于长期储存使用，故本专利使用了内标液A作为补充，以实现对胱硫醚及甲硫氨酸的绝对定量分析(D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚分别与分析物结构一致)；此外，乙醇胺与5-羟基赖氨酸不能被衍生化试剂同位素13C3-丙醇标记，故这两种氨基酸采用与其保留时间接近的其它氨基酸同位素作为内标来定量(乙醇胺使用13C3标记的焦谷氨酸为内标，δ-羟赖氨酸使用13C3标记的同型瓜氨酸为内标)。
优选地，内标液A中D3-蛋氨酸的浓度为5μmol/L。
优选地，内标液A中D4-胱硫醚的浓度为1μmol/L。
优选地，氨基酸的13C3-标记的氨基酸酯化物制备方法采用以上所述方法。
针对具体检测样本的不同，各氨基酸的浓度依照待测样本中各氨基酸的浓度范围而调整。
以检测样品为血浆时为例，给出相应的待标记的氨基酸的浓度，并不表示本发明仅仅可以用于检测血浆(或血液)样本，并不表示本发明只保护一下浓度的氨基酸。
优选地，待测样品为血浆时，待标记的氨基酸浓度分别为：焦谷氨酸100～1000μmol/L、N-甘氨酰甘氨酸20～200μmol/L、3-甲基组氨酸20～200μmol/L、1-甲基组氨酸20～200μmol/L、甘氨酸200～2000μmol/L、天冬酰胺500～5000μmol/L、β-丙氨酸20～200μmol/L、丙氨酸200～20004μmol/L、γ-氨基丁酸10～100μmol/L、肌氨酸50～500μmol/L、β-氨基异丁酸20～200μmol/L、α-氨基丁酸20～200μmol/L、γ-羧基谷氨酸10-100μmol/L、组氨酸50～500μmol/L、酵母氨酸10～100μmol/L、天冬氨酸20～200μmol/L、谷氨酸50～500μmol/L、α-氨基己二酸20～200μmol/L、吡哌酸20～200μmol/L、精氨酰琥珀酸10～100μmol/L、犬尿氨酸20～200μmol/L、精氨酸100～1000μmol/L、同型精氨酸25～250μmol/L、谷氨酰胺200～2000μmol/L、瓜氨酸100～1000μmol/L、丝氨酸100-1000μmol/L、同型瓜氨酸25～250μmol/L、羟脯氨酸40～400μmol/L、N-乙酰基天冬氨酸25～250μmol/L、苏氨酸100～1000μmol/L、N-甘氨酰脯氨酸20～200μmol/L、δ-氨基戊酮酸20～200μmol/L、脯氨酸100～1000μmol/L、鸟氨酸50～500μmol/L、赖氨酸100～1000μmol/L、缬氨酸100～1000μmol/L、色氨酸50～500μmol/L、还原型谷胱甘肽50～500μmol/L、苯丙氨酸100～1000μmol/L、亮氨酸100～1000μmol/L、异亮氨酸100～1000μmol/L、半胱氨酸100～1000μmol/L、同型半胱氨酸100～1000μmol/L、酪氨酸50～500μmol/L。
更优选地，待测样品为血浆时，待标记的氨基酸浓度分别为：焦谷氨酸100.0μmol/L，N-甘氨酰甘氨酸20.0μmol/L，3-甲基组氨酸20.0μmol/L，1-甲基组氨酸20.0μmol/L，甘氨酸200.0μmol/L，天冬酰胺50.0μmol/L，β-丙氨酸20.0μmol/L，丙氨酸200.0μmol/L，γ-氨基丁酸10.0μmol/L，肌氨酸50.0μmol/L，β-氨基异丁酸20.0μmol/L，α-氨基丁酸20.0μmol/L，γ-羧基谷氨酸10.0μmol/L，组氨酸50.0μmol/L，酵母氨酸10.0μmol/L，天冬氨酸20.0μmol/L，谷氨酸50.0μmol/L，α-氨基己二酸20.0μmol/L，吡哌酸20.0μmol/L，精氨酰琥珀酸10.0μmol/L，犬尿氨酸20.0μmol/L，精氨酸100.0μmol/L，同型精氨酸25.0μmol/L，谷氨酰胺200.0μmol/L，瓜氨酸100.1μmol/L，丝氨酸100.0μmol/L，同型瓜氨酸5.0μmol/L，羟脯氨酸40.0μmol/L，N-乙酰基天冬氨酸25.0μmol/L，苏氨酸100.0μmol/L，N-甘氨酰脯氨酸20.0μmol/L，δ-氨基戊酮酸20.0μmol/L，脯氨酸100.0μmol/L，鸟氨酸50.0μmol/L，赖氨酸100.0μmol/L，缬氨酸100.0μmol/L，色氨酸50.0μmol/L，还原型谷胱甘肽70.0μmol/L，苯丙氨酸100.0μmol/L，亮氨酸100.0μmol/L，异亮氨酸100.0μmol/L，半胱氨酸75.0μmol/L，同型半胱氨酸60.0μmol/L，酪氨酸50.0μmol/L。
进一步，本发明要求保护一种衍生化HPLC-MS/MS法的定量分析检测氨基酸含量的样品前处理方法，包括以下步骤：
S1.将样品以水稀释液，依次加入所述内标液A和三羟丙基膦溶液，混合反应，得到混合溶液1；
S2.将混合溶液1、所述衍生化试剂A和所述衍生化试剂B迅速混合、进行衍生化反应，得到混合溶液2；
S3.向混合溶液2加入中性盐/过饱和的中性盐溶液和以上任一所述内标液B，得到混合溶液3；
S4.用乙酸乙酯萃取混合溶液3，干燥萃取液；
S5.甲醇水混合液复溶干燥后的萃取液，过滤膜；
其中，混合溶液1中三羟丙基膦的浓度不低于0.5mg/mL；样品稀释液、以上任一所述内标液A、所述衍生化试剂A、所述衍生化试剂B和以上任一所述内标液B的体积比为25～50：10～20：20～40：12～25：25～50，
甲醇水混合液中甲醇和水的体积比为4～5：6～5；
甲醇水混合液的体积是样品稀释液体积的2～4倍。
本发明在样品中加入三羟丙基膦，可将胱氨酸，同型胱氨酸及氧化型谷胱甘肽分别还原为半胱氨酸，同型半胱氨酸及还原型谷胱甘肽，也可将结合在蛋白上的含硫氨基酸解离，从而测得样品中更稳定，对疾病诊断更有意义的总的半胱氨酸、总的同型半胱氨酸及总的还原型谷胱甘肽的含量。
优选地，待测样本为血浆或尿液稀释20倍。
优选地，待测样本为脑脊液稀释10倍。
优选地，步骤S1中，反应>30s。
优选地，步骤S2中，迅速混合>3s。
优选地，步骤S2中，反应>1min。
最优选地，步骤S2中，反应3min。
优选地，样品稀释液、内标液A、衍生化试剂A、衍生化试剂B和内标液B的体积比为5：1：4：2.5：5
优选地，甲醇水混合液中甲醇和水的体积比为2：3。
优选地，甲醇水混合液的体积是样品稀释液体积的2倍；
优选地，中性盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠中的一种。
更优选地，中性盐为氯化钠。
中性盐的加入能够增强水相的离子强度，加速两相分离，提高萃取效率。
一种衍生化HPLC-MS/MS法的定量分析检测氨基酸含量的方法，使用所述方法进行样品前处理。
优选地，液相色谱采用C18反相色谱柱，柱温为25～50℃。
更优选地，色谱柱为Agilent ZorbaxElipseAAA色谱柱。
优选地，反向C18色谱柱的规格为150×3.0mm i.d.,3.0μm。
优选地，柱温为35℃
优选地，流动相A为1～10mmol/L甲酸铵水溶液；
流动相B为乙腈、甲醇和水的混合液，以体积计算，流动相B含有50～75％的乙腈、40～20％的甲醇和5～10％的水；
流动相流速为0.3～0.5mL/min；
梯度洗脱程序为：0～1.0min 40％流动相B，第1.0～7.0min流动相B逐渐升至60％，7.0～16.0min流动相B逐渐升至70％，18.0～20min流动相B恒定为100％，20.1～22min流动相B恒定为40％；
进样体积2～20μL。
更优选地，流动相A为5mmol/L甲酸铵水溶液。
更优选地，流动相B为体积比为70：25：5的乙腈、甲醇和水混合液。
更优选地，流动相流速为0.4mL/min。
更优选地，进样体积10μL。
更优选地，采用液相色谱连接Q TRAP串联质谱进行数据采集。
更优选地，Q TRAP串联质谱采用正离子电喷雾模式对样品进行离子化，预设多反应监测模式对样品进行数据采集。
串联质谱(MS/MS)采集参数见表1。
表1：
更优选地，检测样品为血浆、血清、脑脊液、尿液、组织匀浆液、土壤提取液、或环境水样。
一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒，包括所述衍生化试剂组合、所述内标液组合和待测氨基酸的标准品。
优选地，待测氨基酸的标准品，包括标准品1、标准品2和标准品3，其中，标准品1为：乙醇胺、甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、α-氨基己二酸、胱硫醚、鸟氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、同型精氨酸、同型瓜氨酸、5-羟基赖氨酸、还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、焦谷氨酸、吡哌酸、δ-氨基戊酮酸、γ-羧基谷氨酸、犬尿氨酸、酵母氨酸和精氨酰琥珀酸的一种或几种的标准品溶液。
标准品2为：天冬酰胺、N-乙酰天冬氨酸、甘氨酰甘氨酸、谷氨酰胺和甘氨酰脯氨酸中的一种或几种的标准品溶液。
标准品3为：色氨酸的标准品溶液。
标准品1为42种在酸性溶液中化学性质稳定的氨基酸，大部分氨基酸溶于水，少数大分子氨基酸必须加入酸才能溶解，此溶液稳定，置-80℃冰箱冻存，可稳定保存至少3年。
标准品2为酸性溶液中不稳定的5种氨基酸，故单独用纯水配制，置-80℃冰箱冻存，可稳定至少3年。
标准品3为色氨酸，由于色氨酸与其它氨基酸混合时，化学性质不稳定，故单独配制，置-80℃冰箱冻存，可稳定保存至少3年。
以下内容也属于本发明的保护范围：
所述衍生化试剂组合、所述制备方法、所述内标液组合、所述样品前处理方法、所述方法或所述试剂盒任一在检测氨基酸中的应用；
所述衍生化试剂组合、所述制备方法或所述内标液组合任一在制备衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒中的应用。
优选地，所述氨基酸为氨基酸为乙醇胺、焦谷氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、1-甲基组氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、β-丙氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、肌氨酸、β-氨基异丁酸、α-氨基丁酸、甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸、组氨酸、酵母氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、α-氨基己二酸、吡哌酸、精氨酰琥珀酸、胱硫醚、犬尿氨酸、精氨酸、同型精氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、丝氨酸、同型瓜氨酸、羟脯氨酸、N-乙酰基天冬氨酸、苏氨酸、N-甘氨酰脯氨酸、δ-氨基戊酮酸、脯氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、缬氨酸、色氨酸、还原型谷胱甘肽、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸和酪氨酸中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1，分析速度快：48种氨基酸定量分析仅用了22min(见图1)，大大缩短了分析时间，提高了检测通量；
2，特异性高：每一个分析物由两对离子对监测，提高了方法特异性，另外高效的液相分离方法对同分异构体实现了基线分离，排除了同分异构现象带来的干扰(见图4)；
3，每一个氨基酸均有一个同位素内标进行标定，提高了方法的准确性和重复性；
4，灵敏度高：方法定量下限低至0.01μmol/L，只需2.5μL血浆即可完成48种氨基酸的定量分析
本发明所述方法分析血浆样品的氨基酸水平，采用氯甲酰丙酯/丙醇衍生化试剂对样品进行前处理，优化了衍生化试剂的配方，提高了衍生化效率，降低了试剂毒性；本法由于所需样品量少，故样品经水稀释后可直接进行衍生化反应，样品处理简单，快速，重复性好；本法不需采用Phenomenex EZ:Faast要求的固相萃取提取氨基酸，也不需采用化学试剂去除蛋白，操作更为简单；利用HPLC-MS/MS法，使48种氨基酸(包括5组同分异构体)都得到了很好的保留和分离；对每一个氨基酸的质谱参数均进行了优化，得到了响应值高，特异性强的离子对进行数据采集；采用氯甲酰丙酯/13C3-丙醇合成了44种氨基酸的同位素标记物作为内标，加上补充的内标液A，实现了48种氨基酸的绝对定量分析。
本方法可以对48种氨基酸进行快速定量分析，检测下限达到0.01μmol/L，准确度89.9～113.4％，批内和批间变异系数分别在0.8％～7.7％和2.6％～14.5％之间，达到了国际上权威组织(如美国FDA)推荐的建立生物分析方法所需达到的指标。
本发明提出的衍生化试剂衍生化效率高，试剂毒性低；方法所需样品量少、处理简单、快速、重复性好，检测成本低；实现了仅用了22min对48种氨基酸的绝对定量分析，大大缩短了分析时间，提高了检测通量；具有很大的推广应用价值。
附图说明
图1为48种氨基酸LC-MS/MS图；每一个峰对应一个氨基酸，每一种颜色的曲线对应一个离子对，各峰编号对应表1中各氨基酸。
图2为无氨基酸代谢异常的儿童氨基酸谱图(A)与患有新生儿胆汁淤积综合症的儿童氨基酸谱图(B)；患者血浆中甲硫氨酸，瓜氨酸和赖氨酸含量明显升高，符合新生儿胆汁淤积综合症患者血浆氨基酸谱改变。
图3为对照例1的色谱图；苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)均含有氨基、羧基及羟基，衍生化试剂B用量为50μL时，导致苏氨酸，丝氨酸分别出现2个衍生化产物，对应羟基未被酰胺化(1)和羟基被酰胺化(2)的产物。
图4为五组同分异构体在以乙腈(A)，甲醇(B)，或乙腈/甲醇/水(70/25/5，v：v：v)(C)为流动相B的色谱图，流动相A均为5mmol/L甲酸铵水溶液。β-Ala，β-丙氨酸；Ala，丙氨酸；Sar，肌氨酸；GABA，γ-氨基丁酸；AIB,β-氨基异丁酸；ABU，α-氨基丁酸；Hyp，4-强脯氨酸；N-Asp，N-乙酰天冬氨酸；Leu，亮氨酸；Ileu，异亮氨酸；3Me-His，3-甲基组氨酸；1Me-His，1-甲基组氨酸。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例均以检测血浆样本为例，并不表示本发明的技术方案仅仅适用于血浆样本的检测。
实施例1一种快速定量分析48种氨基酸的方法
一、试剂
吡哌酸(purity≥97.0％)和α-氨基丁酸(purity≥99.0％)标准品购自安谱公司(上海,中国)，其余氨基酸标准品及三羟丙基膦、甲酸铵均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。氯甲酰丙酯、3-甲基吡啶，异辛烷及正丙醇购自Tokyo Chemical Industry Co.(Tokyo,Japan).13C3-丙醇，D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚购自Cambridge Isotope Laboratories(Andover,MA,USA)。
溶液配制
氨基酸标准储备液：准确称取各氨基酸标准品，用超纯水或1mol/L HCl溶液溶解定容。
标准品1：按下表2准确称取氨基酸标准品，加入水或1mol/L盐酸水溶液1mL溶解，配出单标储备液。按下表准确取一定体积的单标储备液至25mL容量瓶，加水至刻度定容，加水至刻度定容，置-80℃冰箱冻存，可稳定保存至少3年。
表2：
其中，乙醇胺标准品为液体，密度为1.012g/mL at 25℃(浓度为828.5mmol/L)，直接以移液枪移取乙醇胺标准品30.2μl至25mL容量瓶与其它氨基酸标液混合定容。
标准品2：按表3准确称取氨基酸标准品，加入水1mL溶解，配出单标储备液。按下表准确取一定体积的单标储备液至25mL容量瓶，加水至刻度定容，置-80℃冰箱冻存，可稳定至少3年。
表3：
标准品3：取色氨酸标准品25.3mg，加入1mL水溶解，配成浓度为123.82mmol/L的储备液。取色氨酸储备液202μl至25mL容量瓶，加水至刻度定容，置-80℃冰箱冻存，可稳定至少3年。
校准品：用于未知样品中氨基酸定量，需要配制>3个浓度级别校准品(建议5-7个浓度级别)。现以7个浓度级别校准品为例，校准品：配好后当天用完。
校准品7：取标准品1、标准品2、标准品3加水混合，体积比为1：1：1：7；
校准品6：取校准品7，以水稀释2倍；
校准品2：取校准品7，以水稀释100倍；
校准品5：取100μl校准品6与100μl校准品2混合；
校准品4：取100μl校准品5与100μl校准品2混合；
校准品3：取100μl校准品4与100μl校准品2混合；
校准品1：取校准品2，以水稀释5倍。
各氨基酸校准品浓度见表4。
表4：
三羟丙基膦水溶液：称取一定量三羟丙基膦，加水溶解定容至0.5mg/mL。
衍生化试剂A：正丙醇/3-甲基吡啶(77/23，v：v)。
衍生化试剂B：二氯甲烷/氯甲酰丙酯/异辛烷(71.6/17.4/11，v：v：v)。
内标液A：分别称取一定量D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚，加水溶解，配成储备液。取一定体积D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚储备液混合，加水稀释，配成含D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚浓度分别为5μmol/L和1μmol/L的使用液；
内标液B：取氨基酸混合溶液200μl，加入31μl13C3-丙醇，10μl 3-甲基吡啶混合，加入30μl衍生化试剂B，迅速漩涡混合1min，加入过量氯化钠后，乙酸乙酯400μl萃取5次，合并萃取液至25mL容量瓶，加乙酸乙酯定容。分装后，-20℃冻存，
其中氨基酸混合溶液各种氨基酸的浓度为：焦谷氨酸100.0μmol/L，N-甘氨酰甘氨酸20.0μmol/L，3-甲基组氨酸20.0μmol/L，1-甲基组氨酸20.0μmol/L，甘氨酸200.0μmol/L，天冬酰胺50.0μmol/L，β-丙氨酸20.0μmol/L，丙氨酸200.0μmol/L，γ-氨基丁酸10.0μmol/L，肌氨酸50.0μmol/L，β-氨基异丁酸20.0μmol/L，α-氨基丁酸20.0μmol/L，γ-羧基谷氨酸10.0μmol/L，组氨酸50.0μmol/L，酵母氨酸10.0μmol/L，天冬氨酸20.0μmol/L，谷氨酸50.0μmol/L，α-氨基己二酸20.0μmol/L，吡哌酸20.0μmol/L，精氨酰琥珀酸10.0μmol/L，犬尿氨酸20.0μmol/L，精氨酸100.0μmol/L，同型精氨酸25.0μmol/L，谷氨酰胺200.0μmol/L，瓜氨酸100.1μmol/L，丝氨酸100.0μmol/L，同型瓜氨酸5.0μmol/L，羟脯氨酸40.0μmol/L，N-乙酰基天冬氨酸25.0μmol/L，苏氨酸100.0μmol/L，N-甘氨酰脯氨酸20.0μmol/L，δ-氨基戊酮酸20.0μmol/L，脯氨酸100.0μmol/L，鸟氨酸50.0μmol/L，赖氨酸100.0μmol/L，缬氨酸100.0μmol/L，色氨酸50.0μmol/L，还原型谷胱甘肽70.0μmol/L，苯丙氨酸100.0μmol/L，亮氨酸100.0μmol/L，异亮氨酸100.0μmol/L，半胱氨酸75.0μmol/L，同型半胱氨酸60.0μmol/L，酪氨酸50.0μmol/L。
二、样品前处理
取血浆2.5μl至1mL平底玻璃管中，加水47.5μl稀释后，依次加入10μl内标使用液A及10μl三羟丙基膦溶液，混合，放置3～5min，依次加入衍生化试剂A40μl和衍生化试剂B 25μl，迅速混合3s，静置3min后，依次加入50μl饱和氯化钠溶液，50μl内标使用液B及150μl乙酸乙酯，漩涡混合，离心2min(2000rpm)促进两相分离，取上清液至96孔板中，再以200μl乙酸乙酯萃取一次，合并萃取液，氮气吹干，加入100μl甲醇-水混合液(2:3，v:v)复溶，过0.2um GHP滤膜(AcroPrepTM 96-well filterplate,Pall,USA)，待仪器分析。
三、样品数据采集
采用岛津Ultrahigh Pressure Nexera液相***(Kyoto,Japan)连接ABSciex3200Q TRAP串联质谱仪(Foster City,CA,USA)进行数据采集。
采用安捷伦Zorbax Elipse AAA色谱柱(150×3.0mm i.d.,3.0μm)对衍生化后的氨基酸进行色谱分析，柱温箱温度设置为35℃。
流动相包括A：5mmol/L甲酸铵水溶液；B：乙腈/甲醇/水混合液(70：25：5，v/v/v)。
流动相流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：0～1.0min 40％流动相B，第1.0～7.0min流动相B逐渐升至60％，7.0～16.0min流动相B逐渐升至70％，18.0～20min流动相B恒定为100％，20.1～22min流动相B恒定为40％。
进样体积10μL。
质谱采用正离子电喷雾模式对样品进行离子化，预设多反应监测模式(scheduledmultiple reaction monitoring)对分析物进行数据采集。每一个分析物包含两对MRM离子对，用于定性和定量分析，每一个内标由一对MRM离子对监测。各MRM离子对的检测参数见表5。
表5：48种氨基酸名称及质谱采集参数(编号对应图1中各流出峰)
*DP,去簇电压,EP,射入电压；CE碰撞能；MRM1，多反应监测定量离子对；MRM2，多反应监测定性离子对；IS，同位素内标监测离子对。
四、检测结果
48种氨基酸LC-MS/MS检测结果见图1，48中氨基酸均可被检出。每一个出峰时间不同颜色的峰代表监测的一个离子对，每个化合物检测3个离子对，分别是定量离子对，定性离子对和内标离子对(见表2：48种氨基酸名称及质谱采集参数)。由于多个化合物在同一时间出峰且不同化合物响应值有高有低(见左纵坐标)，为更加清晰的展示每一个化合物的出峰时间，故将谱图分为两副展示。
实施例2一种一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒
一、组成
衍生化试剂组合、内标液组合和标准品
其中，衍生化试剂组合为：实施例1中配制的衍生化试剂A和衍生化试剂B；
内标液组合为：实施例1中配制的内标液A和内标液B；
标准品为：标准品1、标准品2和标准品3。
二、使用方法
(1)校准品配制
按照实施例1的方法配制校准品1～校准品7。
(2)样品前处理
同实施例1。
(3)样品数据采集
同实施例1。
实施例4检测临床样本
一、检测样本
选取无氨基酸代谢异常的志愿者和患有新生儿胆汁淤积综合症的患者的血浆进行检测。
二、检测方法
如实施例1所述。
三、检测结果
检测结果如图2所示。患有新生儿胆汁淤积综合症的患者血浆中甲硫氨酸，瓜氨酸和赖氨酸含量明显升高，无氨基酸代谢异常的志愿者血浆氨基酸谱无异常。
实施例5质控样品的检测
一、检测样本
本法的精密度及准确度通过测试ERNDIM(European Research Network forEvaluation and Improvement of Screening,Diagnosis,and Treatment of InheritedDisorders ofMetabolism，www.erndim.org)提供的质控样品进行检测。
本法检测了ERNDIM提供的3个质控品(no.201701,201702,201703)，其浓度包含了低、中、高三个浓度级别。
二、检测方法
如实施例1所述。本法测出值与全世界250家实验室测出值的中位数(目标值)进行对比，计算出方法准确度((本法测出值/250家实验室测出值的中位数)*100％)。通过在同一批次内对同一质控品测试6次，及连续12个批次测试质控品，评估方法批内精密度和批间精密度(批内变异系数及批间变异系数)。
三、检测结果
ERNDIM提供的质控品中包含26种氨基酸，除牛磺酸和胱氨酸不在本法检测范围内，其余24种氨基酸均可定量(表6)，批内和批间变异系数分别在0.8％～7.7％和2.6％～14.5％之间。除同型半胱氨酸和异亮氨酸外，其余氨基酸检测准确度在89.9～113.4％之间。本法由于在样品中加入三羟丙基膦，测出总的同型半胱氨酸而非游离半胱氨酸，故测出值与其它实验室值比偏高，另外，本法无法对旋光异构体异亮氨酸及别异亮氨酸进行完全分离，故测出值为异亮氨酸及别异亮氨酸的总和。
表6：
对照例1
一、检测样本
氨基酸校准品。
二、检测方法
如实施例1所述。仅将衍生化试剂B的用量改为为50μL。
三、检测结果
检测结果如图3所示。色谱图中，由于苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)均含有氨基、羧基及羟基，衍生化试剂B用量为50μL时，导致苏氨酸，丝氨酸分别出现2个衍生化产物，对应羟基未被酰胺化(1)和羟基被酰胺化(2)的产物。
对照例2
一、检测样本
氨基酸校准品。
二、检测方法
如实施例1所述。仅将流动相A中甲酸铵浓度改为10mmol/L。
三、检测结果
结果显示，色谱图中多数氨基酸响应下降，降低了检测灵敏度。
对照例3
一、检测样本
氨基酸校准品。
二、检测方法
如实施例1所述。仅将流动相A中甲酸铵浓度改为1mmol/L。
三、检测结果
结果显示，色谱图中3-甲基组氨酸等峰型变差，不利于氨基酸的定量检测。
对照例4
一、检测样本
氨基酸校准品。
二、检测方法
如实施例1所述，仅将流动相B改为采用纯乙腈。
三、检测结果
检测结果如图4A所示。色谱图中4A组同分异构体可得到基线分离，但亮氨酸/异亮氨酸无法实现基线分离，不利于氨基酸的定量检测。
对照例5
一、检测样本
氨基酸校准品。
二、检测方法
如实施例1所述，仅将流动相B改为纯甲醇。
三、检测结果
检测结果如图4B所示。采用纯甲醇导致羟脯氨酸和N-乙酰天冬氨酸共流出，不利于氨基酸的定量检测。
Claims (10)
1.一种HPLC-MS/MS法分析检测氨基酸的衍生化试剂组合，其特征在于，包括衍生化试剂A和衍生化试剂B；其中，衍生化试剂A为正丙醇和3-甲基吡啶的混合溶液，衍生化试剂B为的二氯甲烷、氯甲酰丙酯和异辛烷的混合溶液。
2.一种13C3-标记的氨基酸酯化物的制备方法，其特征在于，待标记氨基酸溶液依次加入权利要求1所述衍生化试剂A和权利要求1所述衍生化试剂B混合，再加入中性盐/过饱和的中性盐溶液混匀，得到混合溶液，用乙酸乙酯对混合溶液进行萃取得到萃取液，萃取液以乙酸乙酯稀释，即得内标液B，氨基酸混合液、13C3-丙醇、3-甲基吡啶、衍生化试剂B的体积比为：20～60：4～10：1～4：4～12。
3.一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的内标液组合，其特征在于，包括内标液A和内标液B；
内标液A为D3-蛋氨酸和D4-胱硫醚的水溶液，D3-蛋氨酸的浓度为2～10μmol/L，D4-胱硫醚的浓度为0.5～2μmol/L；
内标液B为氨基酸的13C3-标记的氨基酸酯化物，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、α-氨基己二酸、鸟氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、同型精氨酸、同型瓜氨酸、还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、焦谷氨酸、吡哌酸和δ-氨基戊酮酸的一种或几种，优选地，采用权利要求2所述方法制备13C3-标记的氨基酸酯化物。
4.一种衍生化HPLC-MS/MS法定量分析氨基酸含量的样品前处理的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将样品以水稀释液，依次加入权利要求2所述内标液A和三羟丙基膦溶液，混合反应，得到混合溶液1；
S2. 将混合溶液1、权利要求1所述衍生化试剂A和权利要求1所述衍生化试剂B迅速混合，进行衍生化反应，得到混合溶液2；
S3. 向混合溶液2加入中性盐/过饱和的中性盐溶液和权利要求2所述内标液B，得到混合溶液3；
S4. 用乙酸乙酯萃取混合溶液3，干燥萃取液；
S5. 甲醇水混合液复溶干燥后的萃取液，过滤膜；
其中，混合溶液1中三羟丙基膦的浓度不低于0.5mg/mL；
样品稀释液、权利要求2所述内标液A、权利要求1所述衍生化试剂A、权利要求1所述衍生化试剂B和权利要求2所述内标液B的体积比为25～50：10～20：20～40：12～25：25～50；甲醇水混合液中甲醇和水的体积比为4～5：6～5；
甲醇水混合液的体积是样品稀释液体积的2～4倍。
5.一种衍生化HPLC-MS/MS法的分析检测氨基酸的方法，其特征在于，使用权利要求4所述方法进行样品前处理。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，液相色谱采用反向C18色谱柱，柱温为25～50℃，反向C18色谱柱的规格为150×3.0mm i.d., 3.0μm；
优选地，流动相A为1～10mmol/L甲酸铵水溶液；
流动相B为乙腈、甲醇和水的混合液，以体积计算，流动相B含有50～75%的乙腈、40～20%的甲醇和5～10%的水；
流动相流速为0.3～0.5mL/min；
梯度洗脱程序为：0～1.0min 40%流动相B，第1.0～7.0 min流动相B逐渐升至60%，7.0～16.0 min 流动相B逐渐升至70%，18.0～20 min流动相B恒定为100%，20.1～22.0 min流动相B恒定为40%；
进样体积2～20μL。
7.根据权利要求6 所述方法，其特征在于，乙醇胺的采集参数：多反应监测定量离子对1为148.1/ 62.1(m/z)、去簇电压36 V、射入电压6 V、碰撞能16 V，多反应监测定量离子对2为148.1/ 62.1(m/z)、去簇电压36 V、射入电压6 V、碰撞能15 V，同位素内标监测离子对175.2/84.1 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压7 V、碰撞能6 V；
焦谷氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为172.2/84.1 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压7 V、碰撞能24 V，多反应监测定量离子对2为172.2/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压6 V、碰撞能17 V，同位素内标监测离子对175.2/84.1 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压7 V、碰撞能24 V；
精氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为303.2/70.1 (m/z)、去簇电压54 V、射入电压7 V、碰撞能57 V，多反应监测定量离子对2为303.2/156.2 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压5 V、碰撞能30 V，同位素内标监测离子对306.3/70.1 (m/z)、去簇电压54 V、射入电压7 V、碰撞能57 V；
同型精氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为317.2/84.1 (m/z)、去簇电压56V、射入电压4 V、碰撞能50 V，多反应监测定量离子对2为317.2/126.1 (m/z)、去簇电压56V、射入电压4 V、碰撞能35 V，同位素内标监测离子对320.3/84.1 (m/z)、去簇电压56 V、射入电压4 V、碰撞能50 V；
谷氨酰胺的采集参数：多反应监测定量离子对1为275.2/172.2 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压4 V、碰撞能20 V，多反应监测定量离子对2为275.2/84.1 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压5 V、碰撞能30 V，同位素内标监测离子对278.3/175.2 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压4 V、碰撞能20 V；
瓜氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为304.2/156.1 (m/z)、去簇电压33 V、射入电压10 V、碰撞能24 V，多反应监测定量离子对2为304.2/287.2 (m/z)、去簇电压32 V、射入电压11 V、碰撞能14 V，同位素内标监测离子对307.3/156.1 (m/z)、去簇电压33 V、射入电压10 V、碰撞能24 V；
甘氨酰甘氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为261.2/102.0 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能21 V，多反应监测定量离子对2为261.2/144.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能21 V，同位素内标监测离子对264.3/102.0 (m/z)、去簇电压40V、射入电压6 V、碰撞能16 V；
3-甲基-组氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为298.2/96.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压4 V、碰撞能50 V，多反应监测定量离子对2为298.2/256.2 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压5 V、碰撞能27 V，同位素内标监测离子对301.3/96.1 (m/z)、去簇电压50V、射入电压4 V、碰撞能50 V；
丝氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为234.2/146.1 (m/z)、去簇电压37 V、射入电压6 V、碰撞能17 V，多反应监测定量离子对2为234.2/174.1 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压5 V、碰撞能14 V，同位素内标监测离子对237.2/146.1 (m/z)、去簇电压37 V、射入电压6 V、碰撞能17 V；
同型瓜氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为318.2/170.2 (m/z)、去簇电压41V、射入电压4 V、碰撞能25 V，多反应监测定量离子对2为318.2/127.1 (m/z)、去簇电压41V、射入电压3 V、碰撞能30 V，同位素内标监测离子对321.3/170.2 (m/z)、去簇电压41 V、射入电压4 V、碰撞能25 V；
羟脯氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为260.2/172.2 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能19 V，多反应监测定量离子对2为260.2/86.1 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压6 V、碰撞能32 V，同位素内标监测离子对263.3/172.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能19 V；
1-甲基-组氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为298.2/124.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压4 V、碰撞能38 V，多反应监测定量离子对2为298.2/210.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压4 V、碰撞能25 V，同位素内标监测离子对301.2/124.1 (m/z)、去簇电压50V、射入电压4 V、碰撞能38 V；
δ-羟赖氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为334.2/125.1 (m/z)、去簇电压48V、射入电压4 V、碰撞能39 V，多反应监测定量离子对2为334.2/125.1 (m/z)、去簇电压48V、射入电压4 V、碰撞能61 V，同位素内标监测离子对321.3/170.2 (m/z)、去簇电压41 V、射入电压4 V、碰撞能25 V；
N-乙酰天冬氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为260.2/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压4 V、碰撞能25 V，多反应监测定量离子对2为260.2/172.2 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压4 V、碰撞能25 V，同位素内标监测离子对260.2/172.2 (m/z)、去簇电压37 V、射入电压5 V、碰撞能18 V；
苏氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为248.2/74.1 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压6 V、碰撞能31 V，多反应监测定量离子对2为248.2/160.2 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压5 V、碰撞能16 V，同位素内标监测离子对251.3/74.1 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压6 V、碰撞能31 V；
甘氨酰脯氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为301.2/158.2 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压3.5 V、碰撞能21 V，多反应监测定量离子对2为301.2/70.0 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压4.5 V、碰撞能45 V，同位素内标监测离子对304.3/161.2 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压3.5 V、碰撞能21 V；
甘氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为204.2/102.0 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6 V、碰撞能16 V，多反应监测定量离子对2为204.2/118.1 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6 V、碰撞能16 V，同位素内标监测离子对207.2/102.0 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6 V、碰撞能16 V；
天冬酰胺的采集参数：多反应监测定量离子对1为243.2/157.1 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压3.5 V、碰撞能14 V，多反应监测定量离子对2为243.2/115.0 (m/z)、去簇电压44V、射入电压3.5 V、碰撞能19 V，同位素内标监测离子对246.2/160.2 (m/z)、去簇电压45V、射入电压3.5 V、碰撞能14 V；
δ-氨基戊酮酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为260.2/158.1 (m/z)、去簇电压41 V、射入电压5 V、碰撞能18 V，多反应监测定量离子对2为260.2/200.1 (m/z)、去簇电压41 V、射入电压6 V、碰撞能12 V，同位素内标监测离子对263.3/158.1 (m/z)、去簇电压41V、射入电压5 V、碰撞能18 V；
β-丙氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为218.2/116.1 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压5 V、碰撞能19 V，多反应监测定量离子对2为218.2/158.1 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压6 V、碰撞能13 V，同位素内标监测离子对221.3/116.1 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压5 V、碰撞能19 V；
丙氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为218.2/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能17 V，多反应监测定量离子对2为218.2/158.1 (m/z)、去簇电压39 V、射入电压6 V、碰撞能13 V，同位素内标监测离子对221.2/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能17 V；
γ-氨基丁酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为232.2/172.2 (m/z)、去簇电压36V、射入电压4 V、碰撞能13 V，多反应监测定量离子对2为232.2/86.1 (m/z)、去簇电压32V、射入电压5 V、碰撞能24 V，同位素内标监测离子对235.3/172.1 (m/z)、去簇电压36 V、射入电压4 V、碰撞能13 V；
肌氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为218.2/116.0 (m/z)、去簇电压37 V、射入电压5 V、碰撞能16 V，多反应监测定量离子对2为218.2/88.1 (m/z)、去簇电压37 V、射入电压7 V、碰撞能24 V，同位素内标监测离子对221.3/116.0 (m/z)、去簇电压37 V、射入电压5 V、碰撞能16 V；
β-氨基异丁酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为232.2/130.1 (m/z)、去簇电压32 V、射入电压5 V、碰撞能19 V，多反应监测定量离子对2为232.2/172.2 (m/z)、去簇电压36 V、射入电压5 V、碰撞能14 V，同位素内标监测离子对235.3/130.1 (m/z)、去簇电压32V、射入电压5 V、碰撞能19 V；
α-氨基丁酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为232.2/144.1 (m/z)、去簇电压30V、射入电压8 V、碰撞能16 V，多反应监测定量离子对2为232.2/172.1 (m/z)、去簇电压30V、射入电压6 V、碰撞能11 V，同位素内标监测离子对235.3/144.1 (m/z)、去簇电压30 V、射入电压8 V、碰撞能16 V；
脯氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为244.2/156.1 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压4 V、碰撞能18 V，多反应监测定量离子对2为244.2/70.1 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压6 V、碰撞能40 V，同位素内标监测离子对247.3/156.1 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压4 V、碰撞能18 V；
鸟氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为347.2/287.2 (m/z)、去簇电压47 V、射入电压3.5 V、碰撞能14 V，多反应监测定量离子对2为347.2/156.1 (m/z)、去簇电压47 V、射入电压3.5 V、碰撞能26 V，同位素内标监测离子对350.3/290.2 (m/z)、去簇电压47 V、射入电压3.5 V、碰撞能14 V；
甲硫氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为278.1/190.2 (m/z)、去簇电压41 V、射入电压4.5 V、碰撞能17 V，多反应监测定量离子对2为278.1/142.1 (m/z)、去簇电压41V、射入电压4.5 V、碰撞能23 V，同位素内标监测离子对281.2/190.2 (m/z)、去簇电压41V、射入电压4.5 V、碰撞能17 V；
组氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为370.2/196.2 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压6 V、碰撞能27 V，多反应监测定量离子对2为370.2/284.2 (m/z)、去簇电压48 V、射入电压6 V、碰撞能23 V，同位素内标监测离子对373.2/196.2 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压6 V、碰撞能27 V；
赖氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为361.3/170.2 (m/z)、去簇电压46 V、射入电压6 V、碰撞能26 V，多反应监测定量离子对2为361.3/301.2 (m/z)、去簇电压48 V、射入电压6 V、碰撞能15 V，同位素内标监测离子对364.4/170.1 (m/z)、去簇电压46 V、射入电压6 V、碰撞能26 V；
酵母氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为429.3/369.2 (m/z)、去簇电压36 V、射入电压8 V、碰撞能19 V，多反应监测定量离子对2为429.3/170.2 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6 V、碰撞能29 V，同位素内标监测离子对435.4/375.4 (m/z)、去簇电压36 V、射入电压8 V、碰撞能19 V；
缬氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为246.3/158.2 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压6 V、碰撞能15 V，多反应监测定量离子对2为246.3/116.1 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压9 V、碰撞能25 V，同位素内标监测离子对249.3/158.2 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压6 V、碰撞能15 V；
天冬氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为304.3/216.2 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能17 V，多反应监测定量离子对2为304.3/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能27 V，同位素内标监测离子对310.4/219.2 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压5 V、碰撞能17 V；
谷氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为318.2/172.2 (m/z)、去簇电压44 V、射入电压5.5 V、碰撞能21 V，多反应监测定量离子对2为318.2/84.1 (m/z)、去簇电压44 V、射入电压5 V、碰撞能38 V，同位素内标监测离子对324.3/175.2 (m/z)、去簇电压44 V、射入电压5.5 V、碰撞能21 V；
色氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为333.2/245.2 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压5.5 V、碰撞能22 V，多反应监测定量离子对2为333.2/273.1 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6 V、碰撞能16 V，同位素内标监测离子对336.3/245.1 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压5.5 V、碰撞能22 V；
γ-羧基谷氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为344.2/258.2 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压4.5 V、碰撞能15 V，多反应监测定量离子对2为344.2/170.1 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压4.5 V、碰撞能26 V，同位素内标监测离子对350.3/264.3 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压4.5 V、碰撞能15 V；
总的还原型谷胱甘肽的采集参数：多反应监测定量离子对1为564.3/162.1 (m/z)、去簇电压55 V、射入电压6 V、碰撞能30 V，多反应监测定量离子对2为564.3/447.2 (m/z)、去簇电压55 V、射入电压7 V、碰撞能19 V，同位素内标监测离子对570.4/162.1 (m/z)、去簇电压55 V、射入电压6 V、碰撞能30 V；
α-氨基己二酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为332.2/98.1 (m/z)、去簇电压35V、射入电压5.5 V、碰撞能37 V，多反应监测定量离子对2为332.2/244.2 (m/z)、去簇电压35 V、射入电压4 V、碰撞能18 V，同位素内标监测离子对338.3/98.1 (m/z)、去簇电压35V、射入电压5.5 V、碰撞能37 V；
苯丙氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为294.2/206.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压5 V、碰撞能17 V，多反应监测定量离子对2为294.2/120.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压4 V、碰撞能35 V，同位素内标监测离子对297.3/206.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压5 V、碰撞能17 V；
亮氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为260.2/172.2 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6.5 V、碰撞能18 V，多反应监测定量离子对2为260.2/86.1 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压7 V、碰撞能28 V，同位素内标监测离子对263.3/172.2 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压6.5 V、碰撞能18 V；
异亮氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为260.2/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压6 V、碰撞能24 V，多反应监测定量离子对2为260.2/172.2 (m/z)、去簇电压43 V、射入电压5 V、碰撞能16 V，同位素内标监测离子对263.3/130.1 (m/z)、去簇电压40 V、射入电压6 V、碰撞能24 V；
吡哌酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为258.3/128.1 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压4 V、碰撞能29 V，多反应监测定量离子对2为258.3/170.2 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压5 V、碰撞能19 V，同位素内标监测离子对261.3/128.1 (m/z)、去簇电压38 V、射入电压4 V、碰撞能29 V；
精氨琥珀酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为529.3/469.3 (m/z)、去簇电压47V、射入电压6 V、碰撞能23 V，多反应监测定量离子对2为529.3/156.1 (m/z)、去簇电压50V、射入电压6 V、碰撞能43 V，同位素内标监测离子对535.5/475.4 (m/z)、去簇电压47 V、射入电压6 V、碰撞能23 V；
总的半胱氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为336.2/190.1 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压5.5 V、碰撞能18 V，多反应监测定量离子对2为336.2/248.2 (m/z)、去簇电压48 V、射入电压6 V、碰撞能17 V，同位素内标监测离子对339.3/193.2 (m/z)、去簇电压42 V、射入电压5.5 V、碰撞能18 V；
胱硫醚的采集参数：多反应监测定量离子对1为479.3/230.2 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压7 V、碰撞能23 V，多反应监测定量离子对2为479.3/142.1 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压7 V、碰撞能28 V，同位素内标监测离子对485.4/233.3 (m/z)、去簇电压45 V、射入电压7 V、碰撞能23 V；
总的同型半胱氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为350.2/142.1 (m/z)、去簇电压46 V、射入电压5.5 V、碰撞能24 V，多反应监测定量离子对2为350.2/204.1 (m/z)、去簇电压46 V、射入电压5.5 V、碰撞能24 V，同位素内标监测离子对353.3/142.1 (m/z)、去簇电压48 V、射入电压5.5 V、碰撞能18 V；
酪氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为413.3/136.1 (m/z)、去簇电压31 V、射入电压3.5 V、碰撞能45 V，多反应监测定量离子对2为413.3/222.1 (m/z)、去簇电压31 V、射入电压3.5 V、碰撞能33 V，同位素内标监测离子对416.3/136.1 (m/z)、去簇电压31 V、射入电压3.5 V、碰撞能45 V；
犬尿氨酸的采集参数：多反应监测定量离子对1为423.2/146.1 (m/z)、去簇电压50 V、射入电压4.5 V、碰撞能42 V，多反应监测定量离子对2为423.2/260.1 (m/z)、去簇电压50V、射入电压4.5 V、碰撞能21 V，同位素内标监测离子对426.3/146.1 (m/z)、去簇电压50V、射入电压4.5 V、碰撞能42 V。
8.一种衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述衍生化试剂组合、权利要求3所述内标液组合和待测氨基酸的标准品；优选地，待测氨基酸的标准品，包括标准品1、标准品2和标准品3，其中，标准品1为：乙醇胺、甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、肌氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、α-氨基己二酸、胱硫醚、鸟氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、同型精氨酸、同型瓜氨酸、5-羟基赖氨酸、还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、焦谷氨酸、吡哌酸、δ-氨基戊酮酸、γ-羧基谷氨酸、犬尿氨酸、酵母氨酸和精氨酰琥珀酸的一种或几种的标准品溶液；
标准品2为：天冬酰胺、N-乙酰天冬氨酸、甘氨酰甘氨酸、谷氨酰胺和甘氨酰脯氨酸中的一种或几种的标准品溶液；
标准品3为：色氨酸的标准品溶液。
9.权利要求1所述衍生化试剂组合、权利要求2所述制备方法、权利要求3所述内标液组合、权利要求4所述样品前处理方法、权利要求5所述方法或权利要求8所述试剂盒任一在检测氨基酸中的应用。
10.权利要求1所述衍生化试剂组合、权利要求2所述制备方法或权利要求3所述内标液组合任一在制备衍生化HPLC-MS/MS法检测氨基酸含量的试剂盒种的应用。
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