CN110016008B - 特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，荧光探针的结构式如下：
Figure DDA0002034038440000011
一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括以下步骤，步骤一，将3‑醛基‑4‑氯‑7‑二乙氨基香豆素溶于无水乙腈中，再依次加入4‑二甲氨基苯酚盐酸盐、三乙胺，惰性气体保护，回流反应后旋干溶剂，得到化合物A；步骤二，将化合物A和丙二腈溶于无水二氯甲烷中，再加入三乙胺作碱，惰性气体保护，冰浴反应后分离，得到荧光探针。本发明具有特异性识别多硫化氢和生物硫醇的有益效果。

Description

特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针
技术领域
本发明涉及荧光探针制备技术领域。更具体地说，本发明涉及一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针。
背景技术
生物硫醇(半胱氨酸(Cysteine，Cys)、同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)、谷胱甘肽(Glutataione，GSH))是许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞生命活动过程中具有重要作用。其中，半胱氨酸不仅是谷胱甘肽、乙酰辅酶和牛磺酸的前体，同时也是生物体硫铁络合物中硫配体的提供者，人体中缺少半胱氨酸会导致生长缓慢、毛发色素脱色、水肿、嗜睡、肝功能损伤、肌肉松弛、身体虚弱等症状。半胱氨酸的浓度异常也可能会引起阿尔兹海默氏症、心血管疾病、癌症的发生。谷胱甘肽是细胞内最丰富的非蛋白生物巯基化合物，与细胞体内许多功能密切相关：包括细胞内氧化还原活性,异型生物质的代谢,细胞内信号转导和基因调控等。半胱氨酸，谷胱甘肽在体内生物酶的作用下又能相互转化，它们在生物体内含量变化，与许多疾病密切联系。因此，检测细胞内的它们生物硫醇的检测具有十分重要的意义。
在调节各种生理过程中，H2Sn具有很高的效力，包括激活离子通道，转录因子和肿瘤抑制因子；如何检测生物硫醇、多硫化氢，备受关注，近年来，大量的荧光探针，包括荧光蛋白、荧光染料，被用于生物体某种对象的检测，但是现在的绝大部分探针都不具备同时区分H2Sn和生物硫醇这2种物质的能力，所以开发出一种能够同时区分它们的探针具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，其能够同时区分H2Sn和生物硫醇。
本发明还有一个目的是提供一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其原料易得，且中间产物制备无须进行分离纯化，即可直接进行下步荧光探针制备，制备方法简单。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，荧光探针的结构式如下：
Figure BDA0002034038420000021
提供了一种特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，将3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素溶于无水乙腈中，再依次加入4-二甲氨基苯酚盐酸盐、三乙胺，惰性气体保护，回流反应后旋干溶剂，提纯得化合物A，化合物A的结构式为：
Figure BDA0002034038420000022
步骤二，将化合物A和丙二腈溶于无水二氯甲烷中，再加入三乙胺作碱，惰性气体保护，冰浴反应后分离，得到荧光探针。
优选的是，步骤一及步骤二中的惰性气体均为氩气。
优选的是，步骤一中，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与4-二甲氨基苯酚盐酸盐的摩尔比为1:1-3，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与三乙胺的摩尔比为1:1-3，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与无水乙腈的摩尔体积比为1mmol:5-15mL，其中，进行回流反应具体为80-100℃回流反应4-5h。
优选的是，步骤一中，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与4-二甲氨基苯酚盐酸盐的摩尔比为1:1，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与三乙胺的摩尔比为1:1，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与无水乙腈的摩尔体积比为1mmol:5mL，其中，进行回流反应具体为80℃回流反应4h。
优选的是，步骤二中，化合物A与丙二腈的用量比为1mmol:1-3mmol，化合物A与三乙胺的用量比为1mmol:0.36-1mmol，化合物A与无水二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:3-9mL，其中，冰浴反应时间为50-120s。
优选的是，步骤二中，化合物A与丙二腈的用量比为1mmol:1mmol，化合物A与三乙胺的用量比为1mmol:0.36mmol，化合物A与无水二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:3mL，其中，冰浴反应时间为60s。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明的荧光探针与生物硫醇作用后发蓝光，与多硫化氢(H2Sn)作用后发黄光，能够特异性识别多硫化氢和生物硫醇。
第二、原料易得，且中间产物制备无须进行分离纯化，即可直接进行下步荧光探针制备，制备方法简单。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的所述荧光探针MCP1的核磁氢谱图；
图2为本发明的所述荧光探针MCP1的核磁碳谱图；
图3为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇Cys相互作用的紫外-吸收图；
图4为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇GSH相互作用的紫外-吸收图；
图5为本发明的所述荧光探针MCP1与多硫化氢相互作用的紫外-吸收图；
图6为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇Cys相互作用的荧光发射图；
图7为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇Cys相互作用的荧光发射图；
图8为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇GSH相互作用的荧光发射图；
图9为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇GSH相互作用的荧光发射图；
图10为本发明的所述荧光探针MCP1与多硫化氢相互作用的荧光发射图；
图11为本发明的所述荧光探针MCP1与多硫化氢相互作用的荧光发射图；
图12为本发明的所述荧光探针MCP1在386nm激发条件下选择性测试的荧光发射图；
图13为本发明的所述荧光探针MCP1在511nm激发条件下选择性测试的荧光发射图；
图14为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇Cys的动力学检测示意图；
图15为本发明的所述荧光探针MCP1与生物硫醇GSH的动力学检测示意图；
图16为本发明的所述荧光探针MCP1与多硫化氢的动力学检测示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，荧光探针的结构式如下：
Figure BDA0002034038420000041
特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，将3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素(标号为1，1mmol，279mg)溶于5mL无水乙腈(acetonitrile)中，再加入4-二甲氨基苯酚盐酸盐(1mmol，173mg)，最后加入三乙胺(NEt3)(1mmol，139μL)作为碱，氩气保护，80℃回流反应4h后，旋干溶剂，得到混合物，混合物提纯得到化合物A，其中，混合物为红棕色固体，提纯得深棕色化合物A，共计304mg，产率为80％；
混合物中的主产物为化合物A；
反应方程式为：
Figure BDA0002034038420000051
步骤二，将化合物A(304mg，0.8mmol)和丙二腈(标号为3，0.8mmol，52.8μL)，溶于2.4mL无水二氯甲烷(DCM)中，再加入三乙胺(0.288mmol，40μL)作碱，在冰浴(Ice Bath)，氩气保护下，反应1min，分离，得到荧光探针(标号为MCP1)，其中，荧光探针为红色固体，共计171.2mg，产率50％；
反应方程式为：
Figure BDA0002034038420000052
依据点板可以看出步骤一中原料基本反应完全，混合物不进行提纯，可以直接进行步骤二反应，对步骤二的提纯影响基本可忽略，当混合物不进行提纯直接进行步骤二反应时，按照产率为80％进行换算混合物用量。
<实施例2>
特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，荧光探针的结构式如下：
Figure BDA0002034038420000053
特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，将3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素(标号为1，1mmol，279mg)溶于10mL无水乙腈(acetonitrile)中，再加入4-二甲氨基苯酚盐酸盐(2mmol，346mg)，最后加入三乙胺(NEt3)(2mmol，278μL)作为碱，氩气保护，100℃回流反应4.5h后，旋干溶剂，得到混合物，混合物提纯得到化合物A，其中，混合物为红棕色固体，提纯得深棕色化合物A，共计291.8mg，产率为76.8％；
混合物中的主产物为化合物A；
反应方程式为：
Figure BDA0002034038420000061
步骤二，将化合物A(291.8mg，0.77mmol)和丙二腈(标号为3，1.54mmol，101.6μL)，溶于4.62mL无水二氯甲烷(DCM)中，再加入三乙胺(0.55mmol，76.4μL)作碱，在冰浴(IceBath)，氩气保护下，反应50min，分离，得到荧光探针(标号为MCP1)，其中，荧光探针为红色固体，共计161mg，产率49％；
反应方程式为：
Figure BDA0002034038420000062
<实施例3>
特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，荧光探针的结构式如下：
Figure BDA0002034038420000071
特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，将3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素(标号为1，1mmol，279mg)溶于15mL无水乙腈(acetonitrile)中，再加入4-二甲氨基苯酚盐酸盐(3mmol，519mg)，最后加入三乙胺(NEt3)(3mmol，417μL)作为碱，氩气保护，90℃回流反应5h后，旋干溶剂，得到混合物，混合物提纯得到化合物A，其中，混合物为红棕色固体，提纯得深棕色化合物A，共计297.2mg，产率为78.2％；
混合物中的主产物为化合物A；
反应方程式为：
Figure BDA0002034038420000072
步骤二，将化合物A(297.2304mg，0.78mmol)和丙二腈(标号为3，2.350.8mmol，155.1μL)，溶于7.02mL无水二氯甲烷(DCM)中，再加入三乙胺(0.78288mmol，108.3μL)作碱，在冰浴(Ice Bath)，氩气保护下，反应120s，分离，得到荧光探针(标号为MCP1)，其中，荧光探针为红色固体，共计160.7mg，产率48％；
反应方程式为：
Figure BDA0002034038420000081
1、探针氢谱测定
如图1所示，荧光探针MCP1的核磁氢谱图，1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),7.35(d,J＝9.9Hz,1H),6.93(d,J＝9.3Hz,2H),6.71(d,J＝9.0Hz,2H),6.50(d,J＝2.1Hz,1H),6.47(s,1H),3.46(q,J＝7.2Hz,4H),1.32–1.17(m,6H)。
2、探针碳谱测定
如图2所示，荧光探针MCP1的核磁氢谱图，13C NMR(75MHz,CDCl3)δ166.8,159.9,157.6,153.3,150.2,127.7,117.9,115.2,113.7,112.8,109.9,103.3,101.9,97.1,83.3,45.2,41.0,12.5。
3、探针MCP1与H2Sn和RSH相互作用的紫外-吸收检测
3.1溶液配制
空白溶液：向PBS溶液中加入DMSO，混匀即可，其中，DMSO与PBS溶液的体积比为2:8；
含待检测物的探针-PBS溶液：向PBS溶液中依次加入DMSO、荧光探针MCP1、待检测物混匀，其中，DMSO与PBS溶液的体积比为2:8，荧光探针MCP1的浓度为10μM，待检测物与荧光探针MCP1的质量比为100:1，待检测物为生物硫醇Cys、生物硫醇GSH、多硫化氢中的一种。
3.2测试
使用空白溶液调整紫外-吸收可见分光光度计的基线；
分别测得含待检测物的探针-PBS溶液各自随时间变化的紫外-吸收曲线，其中，含生物硫醇Cys的探针-PBS溶液随时间变化的紫外-吸收曲线如图3所示，含生物硫醇GSH的探针-PBS溶液随时间变化的紫外-吸收曲线如图4所示，含多硫化氢的探针-PBS溶液随时间变化的紫外-吸收曲线如图5所示。
3.3结果
由图3-4可知，生物硫醇的荧光激发波长为386nm。
由图4可知，多硫化氢的荧光激发波长为511nm。
4、探针MCP1与H2Sn和RSH相互作用的荧光发射检测
4.1溶液配制
空白溶液，同“3.1溶液配制”中空白溶液的配制；
含待检测物的探针-PBS溶液：同“3.1溶液配制”中含待检测物的探针-PBS溶液的配置；
4.2测试
使用空白溶液调整紫外-吸收可见分光光度计的基线；
分别测含待检测物的探针-PBS溶液在386nm、及511nm激发条件下各自随时间变化的荧光发射曲线，其中，
图6：含Cys的探针-PBS溶液在386nm激发波长激发下随时间变化的荧光发射曲线；
图7：含Cys的探针-PBS溶液在511nm激发波长激发下随时间变化的荧光发射曲线；
图8：含GSH的探针-PBS溶液在386nm激发波长激发下随时间变化的荧光发射曲线；
图9：含GSH的探针-PBS溶液在511nm激发波长激发下随时间变化的荧光发射曲线；
图10：含H2Sn的探针-PBS溶液在386nm激发波长激发下随时间变化的荧光发射曲线；
图11：含H2Sn的探针-PBS溶液在511nm激发波长激发下随时间变化的荧光发射曲线；
4.3结果
由图6-9可知生物硫醇Cys和生物硫醇GSH的荧光发射波长为486nm。
由图10-11可知H2Sn的荧光发射波长为576nm。
5、探针MCP1的选择性测试
5.1、溶液配置
母液：向PBS溶液中依次加入DMSO、荧光探针MCP1，其中，DMSO与PBS溶液的体积比为2:8，荧光探针MCP1的浓度为10μM；
含待检测物的探针-PBS溶液：向PBS溶液中依次加入DMSO、荧光探针MCP1、相关待检测物混匀，其中，DMSO与PBS溶液的体积比为2:8，荧光探针MCP1的浓度为10μM，待检测物与荧光探针MCP1的质量比为100:1，待检测物包括：各种常见阴阳离子，氨基酸，活性氧氮类物质，即H2Sn、H2O2、S2O3 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、ClO-、O2-、NO、NO2 -、NO3 -、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH、丙氨酸Ala、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、赖氨酸Lys、甲硫氨酸Met、络氨酸Tyl、甘氨酸Gly、谷氨酸Glu、组氨酸His、异亮氨酸Iso、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、缬氨酸Val。
5.2、测试
在386nm、及511nm激发条件下侧，由荧光光谱仪测试各含待检测物的探针-PBS溶液随时间变化的荧光发射曲线，其中，图12表示在激发波长386nm激发条件下侧各含待检测物的探针-PBS溶液的荧光发射光谱；图13表示在511nm激发条件下侧各含待检测物的探针-PBS溶液的荧光发射光谱；
5.3、结果
如图12所示，在386nm激发条件下，当待检测物为H2O2、S2O3 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、ClO-、O2-、NO、NO2 -、NO3 -、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、丙氨酸Ala、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、赖氨酸Lys、甲硫氨酸Met、络氨酸Tyl、甘氨酸Gly、谷氨酸Glu、组氨酸His、异亮氨酸Iso、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、缬氨酸Val时，体系荧光均无明显变化，具体见图12中0thers表示，生物硫醇半胱氨酸Cys、生物硫醇谷胱甘肽GSH在486nm(蓝光区)处引起荧光强度不同程度的变化，而H2Sn在576nm(黄光区)处引起荧光强度变化；
如图13所示，在386nm激发条件下，当待检测物为H2O2、S2O3 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、ClO-、O2-、NO、NO2 -、NO3 -、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、丙氨酸Ala、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、赖氨酸Lys、甲硫氨酸Met、络氨酸Tyl、甘氨酸Gly、谷氨酸Glu、组氨酸His、异亮氨酸Iso、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、缬氨酸Val、生物硫醇半胱氨酸Cys、生物硫醇谷胱甘肽GSH时，体系荧光均无明显变化，具体见图12中0thers表示，只有H2Sn在576nm(黄光区)处引起荧光强度变化；
即，探针MCP1能够特异性识别多硫化氢(H2Sn)和生物硫醇。
6、探针MCP1与H2Sn和RSH作用的动力学检测
探针MCP1本身没有荧光，根据图6、图8、及图11可知，在加入生物硫醇半胱氨酸Cys、生物硫醇谷胱甘肽GSH、H2Sn后体系的荧光强度随时间的增长而逐渐增强，其中，依据图14-16可知，生物硫醇半胱氨酸Cys、生物硫醇谷胱甘肽GSH的平衡时间为15min，H2Sn的平衡时间为10min，表明探针MCP1对H2Sn和RSH具有较快的响应。
7、探针机理研究
研究表明探针对生物硫醇(biothiols)、多硫化氢的响应机理如下：
Figure BDA0002034038420000111
利用多硫化氢、生物硫醇在结构和化学性质方面存在的一些差异，与探针作用后生成不同结构的化合物，发出不同荧光，达到特异性识别多硫化氢和生物硫醇。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针，其特征在于，荧光探针的结构式如下：
Figure FDA0002034038410000011
2.如权利要求1所述的特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素溶于无水乙腈中，再依次加入4-二甲氨基苯酚盐酸盐、三乙胺，惰性气体保护，回流反应后旋干溶剂，提纯得化合物A，化合物A的结构式为：
Figure FDA0002034038410000012
步骤二，将化合物A和丙二腈溶于无水二氯甲烷中，再加入三乙胺作碱，惰性气体保护，冰浴反应后分离，得到荧光探针。
3.如权利要求2所述的特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤一及步骤二中的惰性气体均为氩气。
4.如权利要求2所述的特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤一中，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与4-二甲氨基苯酚盐酸盐的摩尔比为1:1-3，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与三乙胺的摩尔比为1:1-3，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与无水乙腈的摩尔体积比为1mmol:5-15mL，其中，进行回流反应的 具体条件为80-100℃回流反应4-5h。
5.如权利要求4所述的特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤一中，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与4-二甲氨基苯酚盐酸盐的摩尔比为1:1，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与三乙胺的摩尔比为1:1，3-醛基-4-氯-7-二乙氨基香豆素与无水乙腈的摩尔体积比为1mmol:5mL，其中，进行回流反应的 具体条件 为80℃回流反应4h。
6.如权利要求2所述的特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤二中，化合物A与丙二腈的用量比为1mmol:1-3mmol，化合物A与三乙胺的用量比为1mmol:0.36-1mmol，化合物A与无水二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:3-9mL，其中，冰浴反应时间为50-120s。
7.如权利要求6所述的特异性识别多硫化氢和生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤二中，化合物A与丙二腈的用量比为1mmol:1mmol，化合物A与三乙胺的用量比为1mmol:0.36mmol，化合物A与无水二氯甲烷的摩尔体积比为1mmol:3mL，其中，冰浴反应时间为60s。
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