CN111718319A - 用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的中文名称为10‑(二乙胺基)‑3‑((7‑(二乙胺基)‑3‑甲酰基‑2‑氧代‑2H‑色烯‑4‑基)氧基)‑5，6‑二氢苯并[c]呫吨‑12‑高氯酸鎓，英文名称为10‑(diethylamino)‑3‑((7‑(diethylamino)‑3‑formyl‑2‑oxo‑2H‑chromen‑4‑yl)oxy)‑5,6‑dihydrobenzo[c]xanthen‑12‑ium perchlorate，命名为CM‑O‑AC。本发明提供了一种多结合位点，水溶性良好，具有大斯托克斯位移的红色荧光探针。探针显示出三个不同的发射通道用于区分检测Cys/Hcy和GSH，并成功应用于HeLa细胞和活体成像。此外，探针可以实现对Cys/GSH代谢产物SO2的识别在细胞水平，并在H2O2作用下实现荧光信号可逆。探针可以作为可视化生物代谢的工具应用在生理和病理过程中。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针及其制备 方法
技术领域
本发明涉及荧光探针，具体属于一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
含有巯基的小分子硫醇半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，在许多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。Hcy是蛋氨酸代谢产生Cys过程中的中间产物。Hcy在细胞内主要通过转硫作用经胱硫醚转化为半胱氨酸。在有氧条件下Cys由半胱氨酸过氧化酶(CDO)催化生成半胱氨酸亚磺酸，进一步分别在半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(CSD)和天冬氨酸氨基转移酶(AAT)催化下分别生成神经递质牛磺酸和气体信号分子二氧化硫。GSH是细胞内主要的抗氧化物质之一，在细胞中由Cys通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)和GSH合成酶(GCS)经两步酶促反应合成。体内半胱氨酸浓度异常将会引起儿童生长缓慢，心血管疾病及肝损害。然而Hcy的作用目前尚未研究清楚，浓度异常可能会引起老年痴呆。浓度异常的谷胱甘肽将直接导致癌症。因此，实时区分检测细胞内Cys/Hcy和GSH及可视化监测Cys/GSH内源稳态的代谢至关重要。
荧光探针由于具有操作简单，反应时间快等特点，成为生物医学和材料科学不可缺少的工具之一。近年来已经报道了许多用于生物硫醇检测的荧光探针。由于三种硫醇具有相似的结构，因此在这些荧光探针中只有少数可以同时区分Cys，Hcy和GSH。而对于Cys/GSH的代谢产物的研究几乎很少。H2O2作为一种常见的活性氧，其与SO2在体内存在着氧化还原循环过程。但是，据我们熟知只有少数的荧光探针可以实现H2O2和SO2的可逆传感。开发不同荧光信号的方法来检测H2O2和SO2在临床诊断至关重要。
针对以上存在的问题，设计多结合位点，水溶性良好，具有大斯托克斯位移的红色荧光探针用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH的代谢，已成为当前生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针及其制备方法，该制备方法操作方便，原料易得。
本发明的另一目的是将该荧光探针用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢，该探针除了细胞内硫醇的区分检测，还可以用于动物体内Cys/Hcy和GSH的区分检测。此外，该探针可以实现对Cys/GSH代谢产物SO2的识别在细胞水平，并在H2O2作用下实现荧光信号可逆。
本发明提供的一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针，中文名称为10-(二乙胺基)-3-((7-(二乙胺基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-色烯-4-基)氧基)-5，6-二氢苯并[c]呫吨-12-高氯酸鎓，英文名称为10-(diethylamino)-3-((7-(diethylamino)-3-formyl-2-oxo-2H-chromen-4-yl)oxy)-5,6-dihydrobenzo[c]xanthen-12-iumperchlorate，命名为CM-O-AC，结构式为：
Figure BDA0002603204790000021
本发明提供的一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针的合成方法，步骤为：
(1)将等摩尔量的4-二乙氨基水杨醛和6-羟基-1-四氢萘酮加入圆底烧瓶中，然后加入冰醋酸和高氯酸，加热回流1.5小时，冷却，倒入乙酸乙酯：石油醚＝1:1的溶液中，静置过滤得10-(二乙基氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]呫吨12-高氯酸鎓(化合物1)；
(2)将步骤(1)制得的化合物1溶于二氯甲烷中，搅拌下加入等摩尔量的4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛，随后加入催化剂量的三乙胺，室温搅拌过夜，然后减压去除溶剂，残留物柱色谱分离得目标产物10-(二乙胺基)-3-((7-(二乙胺基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-色烯-4-基)氧基)-5，6-二氢苯并[c]呫吨-12-高氯酸鎓。
所述柱色谱的洗脱剂为体积比20：1的二氯甲烷和甲醇的混合物。
本发明提供的用于区分检测硫醇的方法，步骤为：
(1)用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys、Hcy和GSH溶液；
(2)将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱，然后逐渐加入不同体积的Cys、Hcy和GSH溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys、Hcy后探针在480nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰(激发为380nm)，随着Cys/Hcy加入荧光强度逐渐增强直到基本不发生变化为止；而加入GSH后探针仅在625nm处出现新的荧光发射峰(激发为380nm)。当激发为450nm时，探针加入Cys/Hcy基本没有变化，而GSH在545nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰，因此可以实现区分检测；
(3)对于Cys/Hcy来说，以Cys/Hcy浓度为横坐标，探针在480nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的回归方程为：y＝11.659x+41.367(y＝11.008x+68.748)，线性相关系数R2＝0.9950(R2＝0.9969)，检出限为0.10μM(0.02μM)。而GSH则以探针在545nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的回归方程为：y＝5.785x+19.507，线性相关系数R2＝0.9964，检出限为0.04μM。
本发明提供的用于监测Cys/GSH代谢的方法，步骤为：
(1)用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys和GSH溶液；用蒸馏水配制2mM的Na2SO3溶液(SO2的供体)；
(2)将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱；然后加入最大体积的Cys溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys后探针在480nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰；随后加入SO2在荧光分光光度仪上测定发现625nm处得荧光猝灭，而480nm处得荧光强度有所上升；最后，在测试体系的基础上继续加入H2O2在625nm处的荧光信号得以恢复；
(3)将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱；然后加入最大体积的GSH溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入GSH后探针在545nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰；随后加入SO2在荧光分光光度仪上测定发现545nm和625nm处得荧光均猝灭；最后，在测试体系的基础上继续加入H2O2在545nm和625nm处的荧光信号得以恢复。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针的合成方法简单，操作方便；
2、本发明的检测方法可以实现Cys/Hcy和GSH的区分检测，而且不受常见氨基酸的干扰；同时还可用于细胞和动物皮下Cys/Hcy和GSH的区分检测；
3、本发明还可以实现监测Cys/GSH的代谢，检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
4、本发明检测信号明显，为多通道荧光变化。
附图说明
图1实施例1制备的荧光探针CM-O-AC的核磁氢谱图
图2实施例1制备的荧光探针CM-O-AC的核磁碳谱图
图3实施例1制备的荧光探针CM-O-AC的质谱图
图4荧光探针CM-O-AC与Cys/Hcy和GSH作用的荧光滴定图
图5荧光探针CM-O-AC与Cys/Hcy和GSH作用的工作曲线
图6荧光探针CM-O-AC与各种分析物的荧光柱状图
图7荧光探针CM-O-AC与Cys和SO2-H2O2作用的荧光滴定图
图8荧光探针CM-O-AC与GSH和SO2-H2O2作用的荧光滴定图
图9荧光探针CM-O-AC检测内源Cys/Hcy和GSH的细胞成像图
图10荧光探针CM-O-AC检测外源Cys/Hcy和GSH的细胞成像图
图11荧光探针CM-O-AC检测Cys/Hcy和GSH的活体成像图
图12荧光探针CM-O-AC监测Cys代谢的细胞成像图
图13荧光探针CM-O-AC监测GSH代谢的细胞成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不受下述实施例的限制。
实施例1
CM-O-AC的制备和表征：
(1)化合物1的制备：在100ml圆底烧瓶中，将4-二乙基氨基水杨醛(1.93g，10mmol)，6-羟基-1-四氢萘酮(1.62g，10mmol)和高氯酸(3ml)溶解在20mL乙酸中,将混合物回流1.5小时。冷却至室温后，将溶液倒入乙酸乙酯(15ml)和石油醚(15ml)的混合物中。过滤沉淀物并用乙醇洗涤，然后真空干燥，得到纯的深紫色固体化合物1(2.88g，收率：90％)。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.11(s,1H),8.63(s,1H),8.16(d,J＝8.6Hz,1H),7.91(d,J＝9.3Hz,1H),7.41(d,J＝9.3Hz,1H),7.27(s,1H),6.95(d,J＝8.6Hz,1H),6.87(s,1H),3.67(q,J＝6.9Hz,4H),3.01(s,4H),1.24(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ164.73,164.31,158.24,155.23,148.36,146.21,132.03,129.40,120.70,117.99,117.67,117.66,116.16,96.14,45.71,40.52,26.98,25.11,12.89.ESI-MS m/z:[M]+calcd for 320.1645；Found 320.1645.
(2)CM-O-AC的制备：将化合物1(0.42g，1mmol)，4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛(0.28g，1mmol)和三乙胺(208μL，1.5mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中，并将混合物在室温下搅拌过夜。浓缩溶液，并通过柱色谱法纯化，得到深紫色固体CM-O-AC(0.42g，收率：63％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.70(s,1H),8.24(d,J＝8.7Hz,1H),7.96(d,J＝9.4Hz,1H),7.49(d,J＝9.4Hz,1H),7.43(d,J＝9.2Hz,1H),7.39-7.32(m,2H),7.28-7.23(m,1H),6.81(d,J＝10.8Hz,1H),6.72(s,1H),3.74-3.66(m,4H),3.52(q,J＝6.8Hz,4H),3.03(s,4H),1.25(t,J＝7.0Hz,6H),1.15(t,J＝7.0Hz,6H).(图1)13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ185.79,164.47,162.51,162.48,162.27,158.74,158.52,155.86,154.17,148.99,145.56,132.39,128.65,127.38,121.19,119.00,118.65,116.12,115.75,111.31,105.61,103.71,97.27,96.12,55.40,45.92,45.07,40.49,26.63,24.82,12.83.(图2)ESI-MS m/z:[M]+calcd for563.2540；Found 563.2546.(图3)
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys/Hcy和GSH溶液。将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱，然后逐渐加入不同体积的Cys/Hcy和GSH溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys、Hcy后探针在480nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰(激发为380nm)，随着Cys/Hcy加入荧光强度逐渐增强直到基本不发生变化为止(图4a,b)；而加入GSH后探针仅在625nm处出现新的荧光发射峰(激发为380nm)(图4c)。当激发为450nm时，探针加入Cys/Hcy基本没有变化(图4d,e)，而GSH在545nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰(图4f)，因此可以实现区分检测。
实施例3
对于Cys/Hcy来说，以Cys/Hcy浓度为横坐标，探针在480nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的回归方程为：y＝11.659x+41.367(y＝11.008x+68.748)，线性相关系数R2＝0.9950(R2＝0.9969)，检出限为0.10μM(0.02μM)。而GSH则以探针在545nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的回归方程为：y＝5.785x+19.507，线性相关系数R2＝0.9964，检出限为0.04μM。(见图5)
实施例4
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys/Hcy和GSH溶液。将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，再分别加入Cys/Hcy和GSH(1-探针，21-Cys,22-Hcy,23-GSH)溶液，以及10当量的其他氨基酸水溶液(2-Ala,3-Asp,4-Asn,5-Arg,6-Gly,7-Glu,8-Gln,9-His,10-IIe,11-Leu,12-Lys,13-Met,14-Phe,15-Pro,16-Ser,17-Tyr,18-Thr,19-Trp and 20-Val)，然后在荧光分光光度仪上测定荧光光谱，测定结果见图6。实验证明，这些氨基酸不干扰探针对Cys/Hcy和GSH的区分检测。
实施例5
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys和GSH溶液。用蒸馏水配制2mM的Na2SO3溶液(SO2的供体)。将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱；然后加入最大体积的Cys溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys后探针在480nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰；随后加入SO2在荧光分光光度仪上测定发现625nm处得荧光猝灭，而480nm处得荧光强度有所上升(图7a)；最后，在测试体系的基础上继续加入H2O2在625nm处的荧光信号得以恢复(图7b)。
实施例6
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys和GSH溶液。用蒸馏水配制2mM的Na2SO3溶液(SO2的供体)。将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱；然后加入最大体积的GSH溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入GSH后探针在545nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰；随后加入SO2在荧光分光光度仪上测定发现545nm和625nm处得荧光均猝灭(图8a)；最后，在测试体系的基础上继续加入H2O2在545nm和625nm处的荧光信号得以恢复(图8b)。
实施例7
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys/Hcy和GSH溶液。探针CM-O-AC在HeLa细胞中区分检测Cys/Hcy和GSH。首先，将细胞与探针CM-O-AC(10μM)一起孵育15分钟，通过细胞成像观察到蓝色、绿色通道和红色通道显示弱的荧光响应(图9B，C，D)。其次，将细胞与NEM(N-乙基马来酰亚胺，0.5mM)一起孵育30分钟，然后与CM-O-AC(10μM)和Cys/Hcy/GSH(20μM)一起孵育15分钟。由成像实验可以观察到对于Cys/Hcy，蓝色通道(图10B，F)和红色通道(图10C，G)荧光显着增强。然而，对于GSH(图10J，K)绿色、红色通道有荧光响应。由此说明探针可以区分检测内外源Cys/Hcy和GSH在细胞水平。
实施例8
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys/Hcy和GSH溶液。把10μL CM-O-AC的DMSO溶液加入到2mL的PBS中；我们将探针溶液注射到小鼠皮下，并在活体成像仪观察荧光信号；随后，在相同部位注射Cys/Hcy和GSH溶液，随着时间变化(0-40min)，观察到荧光信号明显的增强，见图11(1-Hcy，2-Cys，3-GSH)。
实施例9
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM CM-O-AC的荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys和Na2S2O3溶液。探针CM-O-AC在HeLa细胞中检测Cys/GSH的代谢过程。首先，将细胞与Cys(100μM)和探针CM-O-AC(10μM)一起孵育，通过细胞成像观察到蓝色和红色通道中的荧光发射逐渐增加。蓝色荧光在60-120分钟内持续增加，这反映了细胞中Cys的消耗。相应地，红色通道的荧光逐渐熄灭，这意味着生成了SO2(图12)。其次，先前的文献报道，动物体内的Na2S2O3与GSH结合在TST(硫代硫酸盐硫转移酶)作用下可以产生内源性二氧化硫。将细胞与Na2S2O3(500μM)和探针CM-O-AC(10μM)一起孵育，通过细胞成像观察到绿色和红色通道中的荧光发射逐渐增加。这反映了细胞中GSH的消耗。随后，在24分钟内，绿色荧光逐渐减弱，红色通道荧光逐渐淬灭，这意味着产生了内源性SO2(图13)。由此说明探针可以实现检测Cys/GSH的代谢过程在细胞水平。

Claims (8)

1.一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针，其特征在于，结构式为：
Figure FDA0002603204780000011
2.如权利要求1所述的一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将等摩尔量的4-二乙氨基水杨醛和6-羟基-1-四氢萘酮加入圆底烧瓶中，然后加入冰醋酸和高氯酸，加热回流1.5小时，冷却，倒入乙酸乙酯：石油醚＝1:1的溶液中，静置过滤得10-(二乙基氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]呫吨12-高氯酸鎓(化合物1)；
(2)将步骤(1)制得的化合物1溶于二氯甲烷中，搅拌下加入等摩尔量的4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛，随后加入催化剂量的三乙胺，室温搅拌过夜，然后减压去除溶剂，残留物柱色谱分离得目标产物10-(二乙胺基)-3-((7-(二乙胺基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-色烯-4-基)氧基)-5，6-二氢苯并[c]呫吨-12-高氯酸鎓。
3.如权利要求2所述的一种用于区分检测硫醇及监测Cys/GSH代谢的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述柱色谱的洗脱剂为体积比20：1的二氯甲烷和甲醇的混合物。
4.一种区分检测硫醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM的如权利要求1所述荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys、Hcy和GSH溶液。
(2)将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱，然后逐渐加入不同体积的Cys、Hcy和GSH溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys、Hcy后探针在480nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰(激发为380nm)，随着Cys/Hcy加入荧光强度逐渐增强直到基本不发生变化为止；而加入GSH后探针仅在625nm处出现新的荧光发射峰(激发为380nm)；当激发为450nm时，探针加入Cys/Hcy基本没有变化，而GSH在545nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰，因此可以实现区分检测；
(3)对于Cys/Hcy来说，以Cys/Hcy浓度为横坐标，探针在480nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的回归方程为：y＝11.659x+41.367(y＝11.008x+68.748)，线性相关系数R2＝0.9950(R2＝0.9969)，检出限为0.10μM(0.02μM)；而GSH则以探针在545nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的回归方程为：y＝5.785x+19.507，线性相关系数R2＝0.9964，检出限为0.04μM。
5.一种监测Cys/GSH代谢的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用二甲基亚砜(DMSO)配制2mM的如权利要求1所述荧光探针储备液；用蒸馏水分别配制2mM的Cys和GSH溶液；用蒸馏水配制2mM的Na2SO3溶液；
(2)将2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱；然后加入最大体积的Cys溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入Cys后探针在480nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰；随后加入SO2在荧光分光光度仪上测定发现625nm处得荧光猝灭，而480nm处得荧光强度有所上升；最后，在测试体系的基础上继续加入H2O2在625nm处的荧光信号得以恢复；
(3)将2mLPBS缓冲液(pH＝7.4)和10μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上测定探针的荧光光谱；然后加入最大体积的GSH溶液，在荧光分光光度仪上测定其荧光光谱，加入GSH后探针在545nm和625nm处出现两个新的荧光发射峰；随后加入SO2在荧光分光光度仪上测定发现545nm和625nm处得荧光均猝灭；最后，在测试体系的基础上继续加入H2O2在545nm和625nm处的荧光信号得以恢复。
6.如权利要求1所述的荧光探针在制备用于细胞和动物体内Cys/Hcy和GSH的区分检测试剂中的应用。
7.如权利要求1所述的荧光探针在制备用于监测细胞中Cys/GSH的代谢试剂中的应用。
8.如权利要求1所述的荧光探针在制备动物活体和细胞成像试剂中的应用。
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