CN109999046A - 一种茯苓寡糖及其制备方法和应用 - Google Patents
一种茯苓寡糖及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种茯苓寡糖及其制备方法和应用。该茯苓寡糖的聚合度为2‑10，分子量范围为200‑2000。该方法包括以下步骤：(1)取1倍茯苓固体粉末，加入15‑30倍体积水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至20℃至40℃后，加入1‑4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应12‑48h；(3)将步骤(2)所得混合液加热至85‑98℃，维持20‑50min使酶灭活；(4)步骤(3)所得溶液冷却后进行过滤，将所得滤液形成茯苓寡糖干粉。本发明所述的茯苓寡糖能够显著改善急性肺损伤的肺部炎症水平和肺水肿发生等肺功能损伤。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种茯苓寡糖及其制备方法和应用。
背景技术
急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是由感染、休克、创伤、弥漫性血管内凝血、误吸等多种心源性以外的严重肺内外致病因素引起的、临床主要表现为急性进行性加重的呼吸困难和难治性低氧血症的临床综合征，进一步发展可演变为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI的发病机制尚未完全阐明，普遍认为其本质为机体不可控的炎症反应，引发全身***性的炎症反应损伤，其主要病理表现为肺泡毛细血管屏障功能破坏，肺泡上皮弥漫性损伤，肺泡间质性水肿形成以及急性发展的双肺泡玻璃样改变。重要的是肺水肿的发生，会对气体交换维持以及患者氧合改善产生严重影响。目前，临床上仍缺乏防治ALI的有效手段。
茯苓，多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，味甘、淡，性平；归心、肺、脾、肾经；具有利水渗湿的功效。目前尚未有茯苓寡糖在防治ALI中的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种茯苓寡糖及其制备方法和应用。
本发明提供了一种茯苓寡糖，该茯苓寡糖的聚合度为2-10，分子量范围为200-2000。
本发明还提供了一种茯苓寡糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)取1倍茯苓固体粉末，加入15-30倍体积水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至20℃至40℃后，加入1-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应12-48h；
(3)将步骤(2)所得混合液加热至85-98℃，维持20-50min使酶灭活；
(4)步骤(3)所得溶液冷却后进行过滤，将所得滤液形成茯苓寡糖干粉。
优选地，在步骤(1)中，加入20-28倍体积水，更优选加入22-26倍体积水。
优选地，在步骤(2)中，将步骤(1)得到的混合液冷却至30℃至40℃后，加入2-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24-48h；进一步优选地，将步骤(1)得到的混合液冷却至35℃至40℃后，加入3-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24-36h。
优选地，在步骤(3)中，将步骤(2)所得混合液加热至90-98℃，维持20-40min使酶灭活；进一步优选地，将步骤(2)所得混合液加热至90-95℃，维持20-30min使酶灭活。
优选地，在步骤(4)中，将所得滤液形成茯苓寡糖干粉的方式为喷雾干燥或冷冻干燥。
优选地，所述多糖水解酶为葡聚糖水解酶和/或甘露聚糖水解酶。
本发明还提供了上述茯苓寡糖或者由上述方法制备的茯苓寡糖在制备用于防治急性肺损伤的药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有上述茯苓寡糖或者由上述方法制备的茯苓寡糖，以及药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物组合物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂或液体剂。
本发明还提供了一种功能食品，该功能食品含有上述茯苓寡糖或者由上述方法制备的茯苓寡糖，以及食品辅料。
本发明通过动物实验研究了茯苓寡糖对ALI的治疗效果，实验结果显示，茯苓寡糖能够有效改善脂多糖诱导的ALI小鼠肺部炎性细胞的浸润，并能抑制多种炎症因子的释放，缓解肺水肿的发生，首次证明茯苓寡糖能够显著改善急性肺损伤的肺部炎症水平和肺水肿发生等肺功能损伤，为制备治疗ALI药物提供了一种新途径。
附图说明
图1是酶水解法制备的茯苓寡糖的高效液相色谱图。
图2是表示茯苓寡糖对脂多糖诱导ALI小鼠肺组织炎性细胞浸润的影响的图片。
图3是表示茯苓寡糖对脂多糖诱导ALI小鼠肺部炎症因子的抑制的图表，其中，MCP-1、TNFα、IL-1β、IL-6等炎症因子表达越高代表炎症越明显。
图4是表示茯苓寡糖对脂多糖诱导ALI小鼠肺水肿的改善的图表，其中，W/D值越高，肺水肿越严重。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明所述的茯苓寡糖是由茯苓作为原料，通过溶解后用多糖水解酶进行酶解后制得。所述茯苓寡糖的聚合度为2-10(优选为3-8，进一步优选为4-6)，分子量范围为200-2000(优选为300-1500，进一步优选为500-1000)。
本发明所述的茯苓寡糖的制备方法包括以下步骤：
(1)取1倍茯苓固体粉末，加入15-30倍体积水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至20℃至40℃后，加入1-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应12-48h；
(3)将步骤(2)所得混合液加热至85-98℃，维持20-50min使酶灭活；
(4)步骤(3)所得溶液冷却后进行过滤，将所得滤液形成茯苓寡糖干粉。
在一种优选实施方式中，所述茯苓寡糖的制备方法包括以下步骤：
(1)取1倍茯苓固体粉末，加入20-28倍体积水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至30℃至40℃后，加入2-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24-48h；
(3)将步骤(2)所得混合液加热至90-98℃，维持20-40min使酶灭活；
(4)步骤(3)所得溶液冷却后进行过滤，将所得滤液在50-70℃下进行喷雾干燥，得到茯苓寡糖干粉，或者将所得滤液置于冻干机中冻干成茯苓寡糖干粉。
在进一步优选的实施方式中，所述茯苓寡糖的制备方法包括以下步骤：
(1)取1倍茯苓固体粉末，加入22-26倍体积水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至35℃至40℃后，加入3-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24-36h；
(3)将步骤(2)所得混合液加热至90-95℃，维持20-30min使酶灭活；
(4)步骤(3)所得溶液冷却后进行过滤，将所得滤液在60℃下进行喷雾干燥，得到茯苓寡糖干粉，或者将所得滤液置于冻干机中冻干成茯苓寡糖干粉。
在本发明所述的方法中，所述多糖水解酶优选为葡聚糖水解酶和/或甘露聚糖水解酶。
本发明还提供了上述茯苓寡糖或者由上述方法制备的茯苓寡糖在制备用于防治急性肺损伤的药物中的应用。在服用过程中，所述茯苓寡糖的用药有效浓度优选为0.5-3mg/mL口服给药，给药剂量为2-50mg/kg/d。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有上述茯苓寡糖或者由上述方法制备的茯苓寡糖，以及药学上可接受的辅料。所述药物组合物的剂型可以为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂或液体剂。
本发明还提供了一种功能食品，该功能食品含有上述茯苓寡糖或者由上述方法制备的茯苓寡糖，以及食品辅料。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
本实施例用于说明茯苓寡糖的制备方法。
(1)取4g茯苓多糖，加入100ml去离子水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至40℃后，加入0.2g葡聚糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24h；
(3)将步骤(2)所述的混合液加热至90℃，维持30min使酶灭活；
(4)步骤(3)所述溶液冷却后进行过滤，得到滤液，置于冻干机冻干成茯苓寡糖干粉。
所得茯苓寡糖的高效液相色谱图如图1所示。
实施例2
本实施例用于说明茯苓寡糖的制备方法。
(1)取4g茯苓多糖，加入90ml去离子水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至35℃后，加入0.3g葡聚糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应48h；
(3)将步骤(2)所述的混合液加热至95℃，维持20min使酶灭活；
(4)步骤(3)所述溶液冷却后进行过滤，得到滤液，置于冻干机冻干成茯苓寡糖干粉。
实施例3
本实施例用于说明茯苓寡糖的制备方法。
(1)取4g茯苓多糖，加入95ml去离子水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至38℃后，加入0.35g葡聚糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24h；
(3)将步骤(2)所述的混合液加热至92℃，维持25min使酶灭活；
(4)步骤(3)所述溶液冷却后进行过滤，得到滤液，置于60℃喷雾干燥，得到茯苓寡糖干粉。
实验例1
本实施例用于说明茯苓寡糖(实施例1制备的茯苓寡糖)在治疗ALI中的应用。
建立小鼠ALI模型及给药处理，研究茯苓寡糖对急性肺损伤的保护作用及其机制，具体包括以下步骤：
(1)雌性BALB/C小鼠，6-8周龄，体重20-22g，饲养条件保持适宜的温度和湿度，昼夜节律，喂食正常标准饲料和无菌饮水。将小鼠随机分成四组，分别为：对照组(Control)，模型组(LPS)，对照+茯苓寡糖组(PCO)，以及模型+茯苓寡糖组(LPS+PCO)。适应性饲养一周后，对照+茯苓寡糖组(PCO)和模型+茯苓寡糖组(LPS+PCO)连续口服茯苓寡糖水溶液1mg/ml，持续给药2周。对照组和模型组(PCO)自由饮水。口服茯苓寡糖2周后造模。模型组(LPS)采用脂多糖雾化吸入构建小鼠ALI模型。雾化吸入5mg/ml脂多糖30min(共计10ml)。对照组(Control)雾化生理盐水替代。
(2)雾化完成后24h麻醉处死小鼠，收取肺组织样本，随后进行H&E染色、RT-PCR以及肺水肿评估实验。
H&E染色结果见图2，在光学显微镜下观察，发现对照组(Control)肺泡结构完整清晰，肺泡壁完整并未见增厚，肺泡腔内干净无渗出物，肺泡及间质无炎性细胞浸润。模型组(LPS)肺泡萎陷，肺泡壁明显增厚，肺泡毛细血管充血明显，肺泡腔内含有大量红细胞及渗出物，肺间质有大量中性粒细胞浸润。对照+茯苓寡糖组(PCO)肺泡结构清晰，肺泡腔内无明显渗出，肺泡壁无明显增厚，肺内各级气管管壁结构完好，内皮完整。模型+茯苓寡糖组(LPS+PCO)肺泡结构尚清晰，仅有少量肺泡腔有渗出物，少量肺泡壁增厚，肺间质少量炎性细胞的浸润及轻微充血，病变程度较模型组明显减轻。
RT-PCR实验检测肺部组织炎症因子的结果见图3。结果显示，模型组(LPS)的炎症因子显著升高，明显高于对照组，茯苓寡糖处理后，ALI小鼠的肺部组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1的表达显著下调，而茯苓寡糖本身对正常对照组小鼠的肺组织炎症因子无明显的影响。
肺水肿的检测结果见图4。对各组小鼠的双肺组织进行称重，并计为湿重；而后置于68℃烘箱干燥48h后再次对肺组织进行称重，计为干重，依据肺组织的湿重与干重的比率来评估小鼠肺水肿程度。
由此可见，按照本发明所述的方法制备的茯苓寡糖能够显著改善急性肺损伤的肺部炎症水平和肺水肿发生等肺功能损伤。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种茯苓寡糖，该茯苓寡糖的聚合度为2-10，分子量范围为200-2000。
2.一种茯苓寡糖的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)取1倍茯苓固体粉末，加入15-30倍体积水，加热混匀至沸腾，使其充分溶解；
(2)将步骤(1)得到的混合液冷却至20℃至40℃后，加入1-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应12-48h；
(3)将步骤(2)所得混合液加热至85-98℃，维持20-50min使酶灭活；
(4)步骤(3)所得溶液冷却后进行过滤，将所得滤液形成茯苓寡糖干粉。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，加入20-28倍体积水，优选加入22-26倍体积水。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将步骤(1)得到的混合液冷却至30℃至40℃后，加入2-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24-48h；
优选地，将步骤(1)得到的混合液冷却至35℃至40℃后，加入3-4g/L多糖水解酶，搅拌混合液使其充分反应24-36h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，将步骤(2)所得混合液加热至90-98℃，维持20-40min使酶灭活；
优选地，将步骤(2)所得混合液加热至90-95℃，维持20-30min使酶灭活。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将所得滤液形成茯苓寡糖干粉的方式为喷雾干燥或冷冻干燥。
7.根据权利要求2-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述多糖水解酶为葡聚糖水解酶和/或甘露聚糖水解酶。
8.权利要求1所述的茯苓寡糖或者权利要求2-7中任意一项所述的方法制备的茯苓寡糖在制备用于防治急性肺损伤的药物中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1所述的茯苓寡糖或者权利要求2-7中任意一项所述的方法制备的茯苓寡糖，以及药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物组合物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂或液体剂。
10.一种功能食品，其特征在于，该功能食品含有权利要求1所述的茯苓寡糖或者权利要求2-7中任意一项所述的方法制备的茯苓寡糖，以及食品辅料。
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