CN1099801A - 甲状旁腺素类似物，它们的生产方法和含有它们的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甲状旁腺素(PTH)的变异体、其生 产方法、含有他们的药制剂以及药物用途。术语 “PTH”指任何一种遗传编码形式的甲状旁腺激素。
更具体地说，本发明提供一种具有PTH样活性 的并含至少一种修饰的以游离形式或盐形式或配合 物形式的PTH化合物，所说的修饰如说明书中所 述。
以游离形式的或以盐形式的PTH化合物具有 药理学活性，例如用于预防或治疗所有与增加钙排空 或吸收或者与骨中钙的固着有关的骨病有理想的效 果。

Description

本发明涉及甲状旁腺素（PTH）的变异体、其生产方法、含有他们的药物制剂以及药物用途。
本文所使用的术语“PTH”指任何一种遗传编码形式的甲状旁腺激素，包括含有84个氨基酸的成熟形式脊椎动物，如，人、猪、鼠、牛、鸡的PTH，及其片断以及其具有PTH样活性的类似物和衍生物。按国际上认可的方法给包含在该PTH序列中的每一氨基酸位置编号。为了一致并按惯例，在以下描述中，将同样的编号体系用于PTH序列的氨基酸。而不随分子中取代模式而变化。
更具体地说，本发明提供一种具有PTH样活性并含至少一种修饰的以游离形式或盐形式或配合物形式的PTH化合物，所说的修饰是：或者为
1.至少一个选自L-或D-α-氨基酸、C2-6烷氧基羰基和可能被取代或不取代的C1-8烷基、C2-8链烯基、C2-8炔基、芳烷基、芳烯基（aralkenyl）或C3-6环烷基-C1-4烷基的基团并与PTH化合物末端氨基相连，和/或至少一个基团选自C2-6烷氧基羰基和可能被取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基、C2-8炔基、芳烷基、芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物的一个或多个侧链氨基相连，
或者为
2.在天然存在的PTH序列的1到38位中至少一个α-氨基酸单位可以被天然的或非天然的氨基酸以保护的形式置换或不置换，借此，在PTH序列氨基末端的1和2位中的氨基酸单位一起可被一种假肽所置换，
或者是这些修饰的组合
先决条件是
当该PTH化合物从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸或从C2-6烷氧基羰基或可能被取代或不取代的C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳烷基、C2-8炔基、芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它就不是一种具有天然来源的α-氨基酸序列的PTH化合物;或者该PTH化合物不为这样的PTH（1-34），其中
ⅰ.在1位的α-氨基酸为Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr;或
ⅱ.在2位的α-氨基酸为Ala，D-Val，Lys，Arg或Cit且在34位的α-氨基酸为Tyr;或在2位的α-氨基酸为D-Val且34位的α-氨基酸为D-Tyr;或在2位的α-氨基酸为D-Val，且34位的α-氨基酸为D-Tyl和可选择地8位和18位α-氨基酸各自可以为Nle;或
ⅲ.在3位和/或6位和/或9位的α-氨基酸被一个天然或非天然氨基酸置换;或
ⅳ.在23位的α-氨基酸被Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置换;或
ⅴ.在25位和/或26位和/或27位的α-氨基酸被Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置换;或
ⅵ.在8和18位的α-氨基酸各自为Nle或各自为Met（O）且34位α-氨基酸可以是Tyr;或8和18位α-氨基酸各自为Nle且34位的α-氨基酸为Tyr和或者12位的α-氨基酸为L-或D-Pro，L-或D-Ala，Aib或Nme Gly或者23位的α-氨基酸为Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或B-Nal;或
ⅶ.在28位的α-氨基酸为Lys且30位的α-氨基酸为Leu;或
ⅷ.在1位的α-氨基酸为Aib;和/或在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp;和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Llys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr;和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁酯），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn;和/或在13位的α-氨基酸为Leu;和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His;和/或在23位的α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp;和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His;和/或在27位的α-氨基酸为Gln或Leu;或
ⅸ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala或Ser;或在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp且在34位的α-氨基酸为Tyr;或者
该PTH化合物不为这样的PTH（1-84）：其中
ⅰ.在1位的α-氨基酸为Tyr，Val，Pro，Asp或Cys;或
ⅱ.2位的α-氨基酸为Ala，Glu，Leu，Ser或Arg;或
ⅲ.3位的和/或6位和/或9位α-氨基酸被一种天然或非天然氨基酸置换，或
ⅳ.在23位的氨基酸由Ala，Arg，Asn，Asp，CLys，.Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置换;或
ⅴ.在25位和/或26位和/或27位的氨基酸由Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置换;或
ⅵ.在8位的α-氨基酸为Met，Met（O），Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly且18位的α-氨基酸为Leu;或8位和/或18位α-氨基酸为Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp，且34位α-氨基酸可以是Tyr;
或8位和18位的α氨基酸各自为Met（O）;
或8位的α-氨基酸为Leu且18位的α-氨基酸为Met（O）;或
ⅶ.26位的α-氨基酸为Gln;
该化合物不是Pro°PTH（1-84）或[Met°，Leu8，Leu18]PTH（1-84）;或
该PTH化合物不是，在36位的α-氨基酸是Leu的hPTH（1-36），
当PTH序列是从一个PTH片断得到时，它是一种具有PTH样活性的片断并含有PTH的N-末端的至少27个氨基酸单位（优选高达PTH N-末端前38个氨基酸单位，如，1-34到1-38，如1-34，1-36，1-37或1-38PTH）、该α-氨基酸中至少一个按本发明被取代的PTH片断。一般存在于天然产生的PTH序列中的一个或几个α-氨基酸单位也可被删去。hPTH片断，尤其是hPTH（1-34）和hPTH（1-36），是优选的。
PTH化合物的C-末端可以是-COOH，酯化的-COOH（如-COORa其中Ra为低级烷基，例如C1-4烷基），-CONH2或一种单或双取代的酰胺，如-CONRbRc其中Rb和Rc之一为H而另一个为脂族残基，如C1-6烷基或两个均为脂族残基，或Rb和Rc与连结它们的氮原子一起形成一个杂环残基，如吡咯烷基或哌啶子基（piperidinyl）。
在下文中，把这些化合物均归为本发明的化合物。
“天然氨基酸”指本领域中公知的那些。在U.S.P.T.O发行的Tradmark Official Gazette（出版于May 15，1990，p.33at 46）中已被列出并提供了标准缩写。这些氨基酸和缩写特收入本文中作参考。
以下列出了天然氨基酸：
A  Ala  丙氨酸
D  Asp  天门冬氨酸
E  Glu  谷氨酸
F  Phe  苯丙氨酸
G  Gly  甘氨酸
H  His  组氨酸
I  Ile  异亮氨酸
K  Lys  赖氨酸
L  Leu  亮氨酸
M  Met  蛋氨酸
N  Asn  天门冬酰胺
Q  Gln  谷氨酰胺
R  Arg  精氨酸
S  Ser  丝氨酸
T  Thr  苏氨酸
V  Val  缬氨酸
W  Trp  色氨酸
Y  Tyr  酪氨酸
“非天然氨基酸”单位一词意指不是遗传学上编码的氨基酸单位。非天然氨基酸单位的例子包括如按以上表明的天然α-氨基酸的D异构体，Aib（氨基-异丁酸），bAib（3-氨基异丁酸），NVa（正缬氨酸），β-Ala，Aad（2-氨基-己二酸），bAad（3-氨基己二酸），Abu（2-氨基丁酸），Gaba（γ-氨基丁酸），Acp（6-氨基己酸），Dbu（2，4-二氨基丁酸），TMSA（三甲基硅烷基-Ala），aIle（别异亮氨酸），Nle（正亮氨酸），ten、Leu，（特亮氨酸），Cit（瓜氨酸），Orn，Dpm（2，2′-二氨基庚二酸），Dpr（2，3-二氨基丙酸），α-或β-Nal，Cha（环己基-Ala），羟基-脯氨酸，Sar（肌氨酸）等，环氨基酸单位和Nα-烷基化的氨基酸单位，如MeGly（Nα-甲基-甘氨酸），EtGly（Nα-乙基-甘氨酸），EtAsn（Nα-乙基-天门冬酰胺）。
就保护形式的氨基酸来说，意思是指一种天然的或非天然的氨基酸，它具有如一种含有一个象O，S或N杂原子并能用一种O-，S-或N-保护基保护的侧链。本发明的PTH化合物的N-末端也可以是保护的形式。
作为可存在于氨基酸单位的N-末端或侧链氨基的N-保护基团包括如，在“Protective Groups in Orgamic Synthesis”，T.W.Greene，J.Wiley & Sons NY（1981），219-287中公开的基团，例如酰基如甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、甲氧琥珀酰基、羟基琥珀酰基或在苯环上可以被如对-甲氧羰基、对-甲氧基、对-硝基或对-苯基亚磺酰氨基羰基随需取代或不取代的苯甲酰基;烷氧羰基如叔-丁氧羰基，异丁氧羰基或甲氧羰基;烯丙氧基羰基;三苯甲游基;2，2，5，7，8-戊甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基;芳基甲氧羰基如9-氟芴基甲氧羰基或在苯环上可以被对-甲氧基，对硝基，邻-或对-氯，间-苯基或3，4-二甲基随需取代或不取代的苯甲氧基羰基;芳基甲基如在环上可以被对一甲氧基，对-硝基或对氯随需取代或不取代的苯甲基;或芳基磺酰基如在环上可以被对-甲基或对-甲氧基随需取代的苯基磺酰基，或在环上可以被如氨基或二（C1-4烷基）氨基随需取代或不取代的萘基磺酰在。
含氧侧链的氧保护基为如在“The Peptides”，3，（1981），E.Gross and J.Meienhofer（Ed.）中描述的。至于脂族羟基官能度，合适的氧保护基为如在上述文献“Protection of the Hydroxy Group”，J.M.Stewart，169-201中描述的，并包括苯甲基，叔-丁基和甲基。至于芳族羟基官能度，合适的氧保护基包括苯甲基，叔-丁基，甲基，甲苯磺酰基和苯甲氧基羰基。氨基酸侧链上羧基官能度的氧保护基为公知的酯基和如在“The Peptides”，3，101-135（“Carboxyl Protecting Groups”by R.W.Roeske）描述的并包括甲基，乙基，叔-丁基和苯甲基。氨基酸侧链上硫羟官能度的硫保护基是已知的和如在“The Peptides”，3，137-167（“Sulfhydryl Group Protection”by R.G.Hiskey）中描述的。例子包括甲基，叔-丁基，苯甲基，对-甲氧基苯基-甲基，乙基氨基-羰基和苯甲氧基羰基。
按本发明，PTH化合物的末端氨基上可以有基团至少一个基团选自L-或D-α-氨基酸，C2-6烷氧基羰基和随需取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基的基团，和/或一个或几个侧链氨基上有至少一个基团选自C2-6烷氧基羰基和可以随需取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基。当如此的一个基团与侧链氨基相连时，优选地在Lys单位的∑-氨基上。对烷基，烯基，芳烷基，芳烯基或环烷烷基烷基优选的取代基为羟基，氨基而对于芳基部分的取代基也可为卤素和/或C1-4烷氧基。烷基基团或烷基部分可为线状或枝状并可以随需被O，S或N间断。优选地，在PTH化合物的氨基上，任何一个C1-8烷基，C2-8烯基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基为非取代的。C1-8烷基的例子是C1-6烷基，优选甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔-丁基;C2-8烯基的例子为C2-4烯基，优选烯丙基;C2-8炔基的例子为C2-4炔基，优选丙-2-炔基;芳烷基的例子为苯基或苯甲基;芳烯基的例子为苯乙烯基;C3-6环烷基-C1-4烷基的例子为环己基-甲基。优选地，C2-6烷氧基羰基为甲酰基或乙酰基。与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸合适的例子包括如D-或-LPro，Ala。当存在时，优选的取代基的烷基、烯基，烷氧基羰基或与PTH化合物N-末端相连的D-或L-α-氨基酸和/或与一个或多个侧链氨基相连的至少一个烷基或烷氧基羰基。
本发明优选的PTH化合物为含有在PTH序列下列位置之一至少一个氨基酸单位被置换的那些化合物1，2，3，8-11，13到19，21，22，29到34，尤其是8-11，16-19，33和/或34。此外本发明优选的PTH化合物是含有一个以上氨基酸单位被置换的那些，尤其是两个以上的氨基酸单位，更好的是三个以上氨基酸单位，特别是5到7个取代的氨基酸单位被置换，优选地为上述所提及PTH序列位置的任意组合。
在一系列特定的或可选择的具体方案中，本发明提供了一种如上所描述的PTH化合物，其中尤其是在PTH序列的氨基末端的，和2位中的α-氨基酸被假二肽所置换。
文中所使用的“假＝肽”一词指一种二肽等排物，其中在该2个氨基酸残基间的肽键（是天然的或是非天然的）被一个等排基团如，-CH2-NH-，-C（卤素）＝CH-或-C（烷基）＝CH-置换。
其中1位和2位的α-氨基酸被假二肽置换的本发明化合物的例子包括如式Ⅰ的游离形式或盐形式或配合物形式的化合物，
其中
X为一种式（a）或（b）残基
其中Z和Z′各自独立地为H;可随需取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基;或一种保护基，至多Z和Z′的最多之一为一种保护基，
Z″为H，C1-8烷基或一种保护基
Y和Y′各自独立地为一种天然或非天然α-氨基酸可随需被保护的侧链，
Ya和Yb之一为氢而另一个为一种天然或非天然α-氨基酸的可随需被保护的侧链或Ya和Yb和与他们相连的碳原子一起形成一个C3-6环烷基基团，
和
w为卤素或C1-4烷基
或w和Y′与他们相连的
Figure 931164834_IMG7
部分一起，形成一个可以随需取代或不取代的芳族环或杂环残基，和
P1为一个PTH序列，其中N-末端的1和2位的氨基酸单位被删去。
式Ⅰ化合物中，P1可为PTH一个的片断（3-Z），其中Z为84或从27到38的整数，优选从34到38，尤其34，36，37或38，特别是34或36。P1代表的PTH序列或者可与天然产生的PTH序列相对应，或者可与天然产生的PTH序列中至少一个α-氨基酸单位已被天然的或非然的氨基酸以保护的形式置换和/或一个或多个α-氨基酸单位也被删去的PTH序列相对应。P1也可以包含至少一个侧链氨基按以上描述来取代的。
卤素优选的为氟或氯。
在式（a）残基中，双键最好具有反式构型（E）。
作为与天然α-氨基酸的α-碳原子相连的残基，Y，Y′，Ya或Yb可以是存在了以上所列的天然α-氨基酸中的侧链，如存在于Gly（即H），Ala，Val，Ser，Leu，Ile，Phe，Trp中的。Y，Y′，Ya或Yb也可以是与按以上指出的非天然α-氨基酸的α-碳原子相连的残基，如，在Nva，Orn，Abu，Aib，Nle中的。如果作为Y，Y′，Ya或Yb的天然或非天然氨基酸侧链包括杂原子如O，S或N，侧链上的杂原子可以随需用O-，S-或N-保护基来保护，如，以上所指出的。
保护基团如Z或Z′或Z″可为以上所描述的。C1-8烷基如Z或Z′或Z″可以是如上述表示的。
优选地，Z或Z′为氢或C1-4烷基，尤其是氢或甲基。
优选地Y为H或CH3
当W是C1-4烷基时，它最好是CH3
当W和Y′与其相连的部分一起形成可以随需取代或不取代的芳族环或杂环残基时，它为一种可以含有或不含有选自N，S和O的1或2个杂原子的芳族5-或6元环残基，如，苯基，咪唑基，吡啶基，噁唑基或噻唑基。优选的取代基为闳基或甲氧基，尤其对于苯基环。
Y′优选地为H，CH3，异丙基或苯甲基。
当Z″为C1-8烷基时，优选CH3，C2H5或异丙基。
如果Ya和Yb一起是C3-6环烷基优选为环丙基或环戊基。
当Z″为保护基团时，优选酰基，尤其乙酰基。
在一系列特定的和可选择的实施例中，本发明提供一种如上所描述的PTH化合物，其中PTH序列N-末端的1位α-氨基酸单位和/或2位α-氨基酸单位被一种保护或未保护的天然或非天然氨基酸残基所置换，先决条件是：
当PTH化合物是从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸游离或从C2-6烷氧基羰基或取代或末取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它不是一种具有天然产生的α-氨基酸序列的PTH化合物;
或该PTH化合物不为这样的PTH（1-34）：其中
ⅰ.在1位的α-氨基酸为Aib，Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr;或
ⅱ.在2位的α-氨基酸为Ala，D-Val，Lys，Git或Arg且在34位的α-氨基酸为Tyr;或在2位的α-氨基酸为D-Val且在34位的α-氨基酸为D-Tyr和可有可无地8位和18位α-氨基酸各自可以为Nle;或
ⅲ.在1位的α-氨基酸为Aib且至少一个另外的α-氨基酸单位已被按如下置换：在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁酯），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在25位和/或26的位α-氨基酸为His，和/或在27位的α-氨基酸为Gln或Leu，
或该PTH化合物不为这样的PTH（1-84）：其中
ⅰ.在1位的α-氨基酸为Tyr，Val，Pro，Asp或Cys;或
ⅱ.在2位的α-氨基酸为Ala，Glu，Leu，Ser或Arg。
在1位和/或2位的α-氨基酸被按以上所指示的置换的本发明化合物的例子包括如式Ⅱ化合物
X1a-Y2a-P1Ⅱ
其中
X1a为一种被保护或未保护的天然α-氨基酸残基或一种式（Ⅱa）残基
Figure 931164834_IMG8
其中Za和Z′a各自独立地为H，C1-6烷基或一种保护基，Za和Za′至多之一为保护基，和或者n为1且
ⅰ.R1和R2各自独立地为C1-6烷基，或
ⅱ.R1和R2之一为甲基或乙基而另一个为一种保护或未保护的与天然α-氨基酸（Ala，Leu，Ile或Val除外）的α-碳原子相连的残基，或
ⅲ.R1和R2之一为氢、甲基或乙基而另一个为一种保护的或未保护的与天然α-氨基酸的α-碳原子相连的残基，或
ⅳ.R1和R2和与他们相连的碳原子一起形成C3-6环烷基基团，或
ⅴ.
Figure 931164834_IMG9
残基代表一个随需可以与苯环缩合或不缩合的杂环残基，
或n为2，3，4或5且R1和R2各自为H或CH3，Yza为一种保护或未保护的天然α-氨基酸残基或一种式（Ⅱb）残基
Zb为H或C1-6烷基且或者m为1而
ⅰ.R3和R4各自独立地为C1-6烷基，或
ⅱ.R3和R4之一为甲基或乙基而另一个为一个保护的或未保护的与天然α-氨基酸（Ala，Leu，Ile或Val除外）的α碳原子相连的残基，或
ⅲ.R3和R4之一为H，甲基或乙基而另一个为一个保护的或未保护的与非天然α-氨基酸的α碳原子相连的残基，
或者m为2，3，4，或5而R3和R4各自为H或CH3，和P1定义同上。
当
Figure 931164834_IMG11
残基为一个可以随需与苯环缩合的杂环残基时，它可为一个由饱和或不饱和的含有一个或多个选自N，O和S杂原子的5-或6-元素环衍生的残基。此类杂环残基的例子包括如，2-吡啶基，3-吗啉基，六氢化哒嗪基，2-或3-吲哚基。
当n或m大于1时，CR1R2或CR3R4部分可为-CH（CH3）-CH2-，丙基，丁基或戊基。
C3-6环烷基如R1和R2优选地为环丙基或环戊基。
作为与天然α-氨基酸的α-碳原子相连的残基，R1，R2，R3或R4可以是存在于以上所列天然α-氨基酸中的侧链，如，存在在Gly，Ser或Thr中的。R1和R2之一或R3和R4之一可为甲基或乙基而另一个可为CH3，异丙基，异丁基或CH3-CH2-CH（CH3）-。R1，R2，R3或R4也可为与以上表示的非天然α-氨基酸的α-碳原子相连的残基，如，存在于Abu，Gaba，Nva，Aib，TMSA或Nle中的。如果天然或非天然氨基酸的侧链如R1，R2，R3或R4包括杂原子如O，S或N时，在侧链上的该杂原子可以随需用O-，S-或N-保护基团来保护或不保护，如按以上所表示的。保护基团如Za或Za′可为以上所描述的。C1-6烷基如Za或Za′优选地为直链或支链C1-4烷基。优选地，Za和Za′之一为H而另一个为H，C1-4烷基或一个保护基团，尤其是H。
在另一个实施例中，本发明也提供一种以上所描述的PTH化合物，其中在8位上的α-氨基酸单位和/或18位的α-氨基酸单位被一个保护的或未保护的天然或非天然氨基酸残基所置换，先决条件是：
当该PTH化合物是从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸游离或从C2-6烷氧基羰基或随需取代的或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它不是具有天然产生的α-氨基酸序列的PTH化合物;
或该PTH化合物不是这样的PTH（1-34）：其中
ⅰ.在8位和18位的α-氨基酸各为Nle或各为Met（o）而34位α-氨基酸可随需选择Tyr;或在8位和18位的α-氨基酸各为Nle而在34位和α-氨基酸为Tyr且或者在12位的α-氨基酸为L-或D-Pro，L-ak  D-Ala，Aib或NMeGly或者在23位的α-氨基酸为Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或β-Nal;或在8位和18位的α-氨基酸各为Nle而在2位的α-氨基酸为D-Val且在34位的α-氨基酸为D-Tyr;或
ⅱ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp且选择地至少一个另外的α-氨基酸单位已被按如下置换：在1位的α-氨基酸为Aib和/或在11的位α-氨基酸为Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁酯），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位的和/或在21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His，和/或在27位的α-氨基酸为Glu或Leu;或
ⅲ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala或Ser;或在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，且在34位的α-氨基酸为Tyr;或
该PTH化合物不为这样的PTH（1-84）：其中
在8位的α-氨基酸为Met，Met（o），Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly而在18位的α-氨基酸为Leu;或在8位和18位的α-氨基酸各自为Met（o）;或在8位的α-氨基酸为Leu且在18位的α-氨基酸为Met（o）;或
该PTH化合物不是[Leu18，Tyr34]hPTH（1-84），[Leu8，Tyr34]hPTH（1-84），[Ile8，Leu18，Tyr34]hPTH（1-84）或[Leu8，Leu18，Tyr34]hPTH（1-84）。
当在8位的α-氨基酸单位被一个非天然氨基酸置换时，它可为以上描述的非天然氨基酸，如Nva，Nle或Cha、优选地为一个非天然亲水氨基酸，此氨基酸含有直链烷基残基是优选的，尤其优选的是Nva（正缬氨酸）和它的类似物。PTH序列第8位非天然氨基酸也可为一个C2-甲基化的或C2-乙基化的天然α-氨基酸。
其中第18位α-氨基酸单位被置换的本发明PTH化合物的例子，如其中第18位α-氨基酸残基被天然氨基酸残基如Gln，Tyr或Lys置换的PTH化合物，例如[Gln18]-PTH，[Lys18]-PTH和[Tyr18]-PTH，尤其是[Gln18或Lys18或Tyr18]-hPTH-（1-x），其中x为84或27到38的整数，尤其是34到38的整数。当PTH序列为一个（1-36）PTH片断时，第18位是Ala也是特别优选的。在这些化合物中，在8位的氨基酸可为Met或可由选自Leu，Ile，Val，Phe，Gln，Trp，Ser和Ala的氨基酸置换或可以是一个非天然亲水氨基酸残基，如，Nva或Nle。
本发明这样的PTH化合物的另一组包括如，其中在8位的氨基酸残基由一个非天然亲水氨基酸残基（如Nle或更优选Nva）取代的PTH化合物。在这些化合物中，第18位氨基酸可为Met或可由选自Leu，Ile，Val，Phe，Trp，Ser，Ala，Gln，Lys或Tyr的氨基酸置换，优选Leu，Gln，Ala或Tyr。
本发明此类PTH化合物的另一组为在保留位置如1到7，9到17和/或19到38中的一个或多个氨基酸单位或者被删去或者除了在8和/或18位中的α-氨基酸取代之外再被置换的那些化合物。在该情况下，8位α-氨基酸优选地被Leu置换而18位α-氨基酸被Gln，Leu，Ala或Tyr置换。
在另外的或可选择的具体实例中，本发明还提供了一种如上描述的PTH化合物，其中至少一个PTH序列的α-氨基酸序列被存在于PTHrp中相应位置上的α-氨基酸单位置换，先决条件是：
当该PTH化合物从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸或从C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它不为一种具有天然产生的α-氨基酸序列的PTH化合物;
或该PTH化合物不为PTH（1-34），其中
ⅰ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu;和/或在H位的α-氨基酸为Lys;和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg;和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His;和/或在27位的α-氨基酸为Leu;或
ⅱ.在25位的α-氨基酸为Gln和/或在26位的α-氨基酸为Asn，在27位的α-氨基酸可以是Leu;或
该PTH化合物不为[Leu8，Leu18]PTH（1-84）。
“PTHrp”一词指任何一种遗传编码形式的PTHrp，如，人、鸡、小鼠或鼠的PTHrp。为了一致并按惯例，在以下描述中，将同样的编码体系用于在1位以Ala起始并含有如，38位Ala的PTHrp序列的氨基酸。
本发明的该组化合物为PTH和类似的PTHrp序列之间的杂化物（文中指PTH-rp杂化物）。按本发明取代的氨基酸序列是发生在从1位直到38位，尤其1到36位，特别是1到34位。
本发明优选的PTH化合物是PTH-rp杂化物，其中该PTH序列的一个以上α-氨基酸单位（如，至少2个，优选为3到5个α-氨基酸单位）按本发明被取代。
本发明优选的一组PTH-rp杂化物包括在PTHα-氨基酸序列中8到11位的至少一个α-氨基酸单位（即，Met8，His9，Asn10或Leu11）被相应的PTHrp序列相应的α-氨基酸单位（即，Leu8，His9，Asp10或Lys11）取代的PTH化合物。在8位和/或10位的取代是优选的，尤其是第8位和10位。更优选地，所说PTH序列的8，10和11位α-氨基酸分别被Leu8，Asp10和Lys11取代。
本发明优选的另一组PTH-rp杂化物包括PTHα-氨基酸序列16位到19位中至少一个α-氨基酸单位被相应的PTHrp序列相应的α-氨基酸单位（即，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19）取代的PTH化合物。优选地，所说序列的3个或所有4个α-氨基酸被取代。尤其优选的是在16位的α-氨基酸为Gln，在18位的α-氨基酸为Leu且在19位α-氨基酸为Arg的本发明PTH化合物。
本发明另一个优选的一组PTH-rp杂化物包括PTHα-氨基酸序列33和34位的至少一个α-氨基酸单位由相应的PTHrp序列的相应的α-氨基酸单位（即，Thr33，Ala34）取代的PTH化合物。优选地，两个α-氨基酸均被取代。
本发明再进一步优选的PTH-rp杂化物组为包含上述α-氨基酸取代物（8-11，16-19，33-34）的任何组合的PTH化合物，更优选地，选自以上指出的8-11和33-34序列取代物的组合物。
正如可预知的那样，在本发明的PTH-rp杂化物中，在1到38位的一个或多个α-氨基酸可进一步被以上所指出的天然或非天然氨基酸取代或被删去。在10位中可以有一个α-氨基酸选自Gly，Gln，Glu，His，Ser，Thr或Tyr。在13位中可有一个除Arg外的D-或L-α-氨基酸，如，Ala，Cys，Gln，Ile，Asn，Trp，Asp，Val，Ser，Thr，Tyr，Met，Leu或Gly;在16位中可有一个D-或L-α-氨基酸，如，Lys，Ser，Leu，Ala，Gln或Gly;在17位中的Ala或Ser或优选地为一个具有比Ala或Ser大的侧链的氨基酸，如，Glu，Gln，Phe，His，Ile或Lys;在18位中是Gln或Tyr;19位为Ala，Arg，Val，Tyr，Ser，Lys，Met，His，Gly，Pro，Asn或Ile;Gln或Arg在26位中，和/或33位为一个D-或L-α-氨基酸如，Ser，Thr，Leu，Gly，Gln，Arg，Pro，Asp，Ile，Lys，或Thr。他们也可按以上指出的在N-末端或在侧链氨基上被取代。如果需要，本发明的PTH-rp杂化物的含S-或O-侧链也可按以上所描述的方法来保护。
本发明优选的PTH-rp杂化物的例子为[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]PTH和[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]PTH。
本发明优选的PTH-rp杂化物为PTH（1-x′）化合物，其中x′为一个从34到38的整数，尤其是34，36，37或38，特别是hPTH（1-x′），其中一个或多个α-氨基酸被存在在PTHrp相应位置上的α-氨基酸置换，优选地按以上所描述的。当33位和34位被相应的PTHrp的α-氨基酸序列置换时，该PTH化合物优选地为一个含有34个α-氨基酸单位的hPTH片断。具有羧基末端的PTH-rp杂化物是较好的。
优选地，PTHrp为hPTHrp。
本发明的化合物可以如游离形式，盐的形式或以其复合物的形式存在。酸加成的盐可用如有机酸，聚合物的酸和无机酸来形成。此类酸加成盐的形式包括如盐酸盐和乙酸盐。复合物如由本发明的化合物加成无机物（如，无机盐或氢氧化物象Ca-和Zn-盐）和/或加成聚合的无机物来形成。
本发明还提供一种生产本发明化合物的方法。他们可以分步的方式或者在溶液中或者使用固相合成法或基因工程法来制备。
例如，本发明的化合物可如下来制备：
a）除去以保护方式存在于本发明化合物中的至少一个保护基团;或
b）通过酰胺键，将两个肽片断连结在一起，获得所需化合物的所需氨基酸的肽片断，然后可选择地实施阶段a）的过程。
c）为了产生一种在氨基末端的1和2位的α-氨基酸被一种假二肽置换的PTH化合物，将一种保护的或未保护形式的假二肽与一种1和2位氨基酸残基被删去的保护或未保护形式的PTH肽进行反应并且如需要再进行步骤a）的过程;或
d）为了产生一种含有至少一个选自如下基团的PTH化合物：与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸和与末端氨基相连的和/或与侧链氨基相连的C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基，将如此的一个基团引入到以保护或非保护的形式的PTH化合物中并从此基团游离，且如果需要进行步骤a）的过程;
并且回收所获得的游离形式，盐的形式或复合物形式的该化合物。
步骤a），b）和c）的过程可以与已知方法类似的方式，如按本领域已知的肽化学或按下列实施例所描述的方式来实施。需要时，在这些反应中，适用于肽类的保护基团可用功能基不参于反应。保护基团一词也可包括一种具有功能基团的聚合物树脂。
在步骤b）过程中，为产生氨基末端1和2位α-氨基酸单位被假二肽置换的PTH化合物，一个用作起始材料的肽片断有含有N-末端的假二肽。该起始材料可按步骤c）的过程来制备。
在步骤c）的过程中，用作起始材料的假二肽可为一种或Ⅱaa或Ⅱbb的化合物
ZZ′N-CHY-CW＝CH-CHY′-COOH（Ⅱaa）
ZZ′N-CYaYb-CH2-NZ″-CHY′-COOH（Ⅱbb）
其中Y，Y′，Ya，Yb，Z，Z′，Z″和W如上定义，或某一种功能衍生物，如酯，酰基卤或一种对称的或不对称的酐。W和Y′和与他们相连的 部分一起形成一种取代或未取代的芳族环或杂环残基的式Ⅱaa化合物和Z″为烷基或保护基团（如，乙酰基）或其中-CYaYb为C3-6环烷基且Z″为H的式Ⅱbb化合物为新的并构成本发明的一部分。
步骤d）的过程可按类似于已知的方法来进行，如，烷基化方法。在本发明优选的实施例中，烷基化反应是在还原条件下进行的，如使用相应的醛或酮。它可在如NaBH3CN存在下进行，优选地在酸性pH，如从5到7。反应温度可为如从-20℃到100℃。在惰性溶剂中进行反应是有利的，如，水，一种醇，二噁烷或DMF或它们的一种混合物。D-或L-α-氨基酸也可按已知的方法与N-末端相连。
在步骤b）过程中用作起始材料的肽片断可包括一种或多种非天然氨基酸单位;也可在N-末端和/或侧链氨基上被选自C2-6烷氧基羰基，取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基的基团所取代或它也可载于一个N-末端的D-或L-α-氨基酸上。
含有天然α-氨基酸单位的本发明化合物或其片断也可采用重组技术来制备。
按本发明的一个优选的实施例，还提供一种生产中等大小的多肽的方法，其中一种融合蛋白被细菌细胞表达，该蛋白含N-末端噬菌体T4基因的55多肽，并且所需要的多肽链接在它的C-末端。
基因55多肽可包含噬菌体T4的完整的gp55蛋白（188氨基酸残基），该蛋白已被描述在Gram，H.和Rüger，R;1985;The EMBO Journal，4，（1），pp 257-264中。另外一个片断，一个gp55蛋白的N-末端片断可被优选使用。例如，可使用包含该蛋白N-末端前112个氨基酸残基的gp55蛋白片段。然而，一般，该基因55多肽包含该gp55蛋白的N-末端至少前25个残基。
该中等大小的多肽在氨基酸长度上可从约20直到100，如，150，优选从约20到约50。中等大小多肽的例子包括降钙素，内啡肽，肠胃抑肽（gastric inhibitory peptide（s）），胰高血糖素，神经肽Y（neuropeptidey），生长激素释放因子（GHRF），淀粉样β蛋白片断（amyloid β protein fragments），水蛭素，胰岛素，生长激素抑制素，表皮生长因子，神经生长因子和PTH或其片断。可按本发明方法制备的尤其优选的中等大小多肽为具有天然氨基酸取代基的本发明化合物或其片断。
该基因55-PTH融合蛋白容易包含一种在基因55多肽与所需的多肽之间的可裂解的链，优选地，该可裂解的链为化学可裂解的而更优选地是包含Asp-Pro-Pro或Asn-Gly-Pro氨基酸序列。
本发明的另一个方面，是提供一种编码融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白含有一种N-末端噬菌体T4基因55多肽和一种与其C-末端相连的所需的中等大小的多肽。
该核苷酸序列优选地为一种适于在细菌中表达的DNA序列。典型地，该序列包含编码一种在基因55与所需多肽的编码序列这间的裂解链的核苷酸。
本发明也提供一种包含一种编码该融合蛋白的DNA序列的细菌表达载体。
该表达载体一般除含有融合蛋白编码序列外，还含有适当的包括一种合适的启动子，一种操纵子和一种核糖体结合位点的表达控制序列和其它适当的调节序列。通常，表达载体也包含一种或多种可选择的标记物。
任何合适的启动子均可使用，如TrpE，λP1，λpr，Lac或Tac启动子。优选的启动子为噬菌体T7启动子和表达载体为一种质粒。为了大肠杆菌表达，一种R1或Col-E1质粒衍生的载体可被使用。例如，可使用从Novagen获得的表达载体pET17B或类似的表达载体。
本发明另一方面提供由融合蛋白编码序列或如上所述的表达载体转化的细菌宿主细胞。尽管优选的宿主为大肠杆菌，例如，可使用大肠杆菌BL21（DE3）Lys E和类似的菌株。但任何合适的细菌宿主均可使用。
有利地，融合蛋白以不溶性包含体的形式积累在宿主细胞中，并因此便于融合蛋白产物从细胞中的回收。为了从融合蛋白中获得所需多肽产物，溶解包含体蛋白，并将所需多肽产物与融合蛋白裂解。任何合适的变得可溶的处理均可使用，包括酸处理，如在约pH2到4，优选用酸在约pH2.5下处理，或用变性剂处理，如一种弱变性剂如盐酸胍。另外，需要从裂解后保留的产物中除去一种或多种不需要的N-末端氨基酸残基。
因此本发明更进一步的方面提供一种在细菌宿主中生产所需中等大小的多肽的方法，该方法包括：
引起转变的如上定义细菌宿主细胞以表达包含体形式的融合蛋白;
分离包含体;
使包含体变得可溶，并
从融合蛋白中裂解出所需多肽。
在一些中等大小的多肽的情况中，如PTH化合物，一般不需要仔细控制进行变性和复性的过程而获得活性形式的PTH产物，如具有PTH样活性。仅通过中和用于增溶的酸性条件可获得活性形式的中等大小多肽产物。融合蛋白的增溶和裂解可在一个步骤中进行。
本发明也包括一种融合蛋白，它含有N-末端噬菌体T4基因55多肽和与其C-末端相连的所需的中等大小的多肽。
采用本发明的方法和载体，已经发现，产生高水平的中等大小的多肽，尤其是PTH产物是可能的。在大肠杆菌中，我们发现高达表达总蛋白约50%的蛋白为所需的融合蛋白。而且，融合蛋白形成易于从细胞其它成分中分离的包含体。再者，该包含体常由至少约90%的所需融合蛋白组成，从而能够显著减小所需要的纯化工作量。更进一步，以融合蛋白形式的PTH产物的表达基本上减少了细菌细胞内内源多肽的过程，允许获得同源产物。
优选地，可裂解的链包含化学可裂解的与所需多肽相邻的氨基酸，通过简单的化学手段允许所需的多肽从融合蛋白上裂解。优选地，所需的多肽不含有化学可裂解的基团。
优选的化学可裂解的链包含氨基酸Asp-Pro-Pro或Asn-Gly-Pro。Asp-Pro或Asn-Gly键可分别来用酸条件如，甲酸（通常约pH2.5）或闳氨来进行化学裂解。然后将保留在所需多肽的N-末端的二肽Pro-Pro或Gly-Pro采用一种合适的二肽基肽酶来去除。例如，能使用L.Lactis X-Pro二肽基肽酶EO3.4.14.5。此肽酶描述在Nardi等，1991;Applied and Environmental Microbiology，57，p45 to 50。
所需的多肽可在从融合蛋白中裂解后进行纯化。可使用HPLC纯化技术。纯化可在任何不需要的N-末端氨基酸残基除去前进行。
在实施例308到314中进一步说明本发明的方法。图1显示氨基酸序列和相应的克隆到质粒pET17B中的截断的gp55-Asp-Pro-Pro hPTH（1-38）OH融合蛋白的DNA序列，和图2显示氨基酸序列和相应的克隆到质粒pET17B中的全长gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH（1-38）OH融合蛋白的DNA序列。
在下列实施例中，所有温度为℃。采用下列缩写。在本说明书中，没有更进一步指示的PTH一词包括羧基末端以及羧酰胺末端。
BOC＝叔丁氧基羰基
DMF＝二甲基甲酰胺
DCM＝二氯甲烷
Fmoc＝9-芴基甲氧羰基
HoBt＝1-羟基苯并***
TFA＝三氟乙酸
Trt＝三苯甲游基
RP-HPLC＝反相高效液相色谱层析
r.t.＝室温
DNP＝二硝基苯基
Tos＝甲苯磺酰基
DIPC＝二异丙基碳化二亚胺
Pmc＝2，2，5，7，8-戊甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基
Ip＝异丙基
For＝甲酰基
Cpe＝1-氨基-环戊烷-1-羧酸
Cpp＝1-氨基-环丙烷-1-羧酸
Cha＝环己基氨基丙酸
tBu＝叔丁基
实施例1：Nα-异丙基hPTH（1-34）NH2
在聚苯乙烯基质的树脂载体上，采用分段的方法装配此肽。用Boc-基保护α-氨基并且侧链官能基按下述被保护：Lys（2-氯苯甲基氧羰基），Ser（苯甲基），Thr（苯甲基），Glr（苯甲基），Asp（苯甲基），Met（o），His（DNP），Arg（Tos），和Trp（HCO）。其它残基未被保护。
将氨基-4-甲基苯基-甲基-和（聚苯乙烯-联乙烯基苯＝MBHA-树脂）（0.7mmol/g）进行下述（17至（7））步骤的循环：
（1）DCM
（2）三氟乙酸（50%）的DCM溶液
（3）DCM
（4）二异丙基乙基胺（10%）的DMF溶液
（5）DMF
（6）在DMF中预先形成的Boc-氨基酸的对称酐（每g起始树脂1.4mmol）
（7）DMF
洗涤物和试剂的体积为每克起始树脂5至20ml。根据完成树脂反应（步骤2.4.6）或从树脂中完全置换出先前的试剂（步骤1.3.5.7）的需要，每一步骤重复多次。每个循环后除去树脂样品，并用茚三酮进行残留氨基的比色试验以检验偶合反应的完成。
在使用前通过将Boc-氨基酸（每g树脂2.8mmol）和DCCI（每g树脂1.4mmol）在含有完全溶解Boc-氨基酸的足够量的DMF，在DCM中反应制备Boc-氨基酸对称酸酐。过滤混合物，在滤液中加入较多的DMF，在不超过15℃的温度下蒸发挥发成分浓缩滤液，所得溶液用于步骤（6）。
对每个氨基酸残基重复（1）至（7）的反应循环，以提供出标题化合物的序列，Boc-Gln-OH和Boc-Arg（Tos）-OH除外，它们已在步骤（6）中偶合由于在DMF中它们已预先形成了1-羟基苯并-***酯。
在室温下，将充份装配的肽树脂用20ml  5%的苯硫酚的DMF溶液处理二次，每次1小时，并用DMF、甲醇和二氯甲烷洗涤。将肽树脂再次进行步骤（1）至（5），接着按每克树脂加入0.5ml丙酮，在20ml的DMF中的84mg氰基氢硼化钠和0.2ml乙酸。在室温下16小时后，用DMF和二氯甲烷洗涤树脂并干燥。
根据例如在International Journal of Peptide and Protein Research，vol.26，262-273页（1985）中描述的“low-high”方法，用液态HF，甲硫醚，对-甲酚和乙烷-1，2-二硫醇处理肽树脂。除去挥发成分后，用乙酸乙酯洗涤。剩余物用几份1%乙酸提取，过滤并使滤液冻干。在十八烷基硅柱反相色谱上，用在2%磷酸或在20mM磷酸四甲基铵中的梯度乙腈作为洗脱液，反复提纯冻干的产物，合并含有纯化合物的馏分，通过乙酸盐型的弱碱性的离子交换树脂过滤，冻干滤液得到标题化合物。
MS（离子-喷雾）：4160
实施例2 [Lys（NE-异丙基）26.27]hPTH（1-34）NH2
如实施例1装配肽，但用Lys（Fmoc）使13位和Fmoc-Ser（tBu）在末端1位结合。
在室温下，将完全装配的肽树脂用20ml  5%的苯硫酚的DMF溶液处理二次，每次1小时，并用DMF，甲醇和二氯甲烷洗涤。如实施例1中所述将干燥的树脂用液体HF处理。裂解的产物（350mg）悬浮于甲醇（5ml），磷酸缓冲液pH＝5.0（5ml），氰基硼氢化钠（48mg）和丙酮（0.28ml）的混合物中，在RT下反应16小时后，过滤反应混合物并蒸发滤液。将剩余物悬浮在20%-哌啶的DMF溶液中15分钟，用20体积的醚稀释并过滤。将剩余物溶解在100ml水中，并加入乙酸到pH＝3，过滤并冻干滤液，在十八烷基硅柱反相色谱上，用在2%磷酸中的梯度的乙腈作为洗脱液，纯化冻干物。合并含有纯化合物的馏分，通过乙酸盐型的弱碱性的离子交换树脂过滤，冻干滤液得到标题化合物。
MS（离子-喷雾）：4205.6。
实施例3：Nα-异丙基[Lys（NE-异丙基）13.26.27]hPTH-（1-38）-OH
a）固相肽合成
在聚苯乙烯基的树脂载体上，以分段的方法合成肽，用Fmoc保护α-氨基且侧链的官能基团如下述被保护：Asp（OtBu），Glu（OtBu），His（Trt），Lys（Boc），Asn（Trt），Gln（Trt），Arg（Pmc）和Ser（tBu）。其它的氨基酸未被保护。
将酯化到4-羟甲基-苯氧甲基-和（聚苯乙烯-1%-联乙烯基苯）的Fmoc-Gly，0.5mmol/g用作分段固相合成的起始产物，其中包括α-氨基酸去保护，洗涤，偶联（新氨基酸的连接）和洗涤的重复的循环。采用DIPC使三至五倍过量的Fmoc-氨基酸偶联成预制的HoBt-酯。用DIPC使Fmoc-Arg（Pmc），Fmoc-Asn（Trt）和Fmoc-Gln（Trt）偶联成对称的酐。将肽链全部装配后，用20%的哌啶/DMF除去Ser1的Fmoc-保护基。通过在室温下用10%乙二硫醇，苯硫基甲醚，甲苯硫酚和水在90%TFA中的混合物处理肽树脂三小时，从苯乙烯树脂上的裂解出肽并且，除去侧链上所有保护基。过滤树脂颗粒并用一些TFA洗涤。通过加入醚，产物从合并的滤液中沉淀出，过滤并干燥。在C-18硅柱色谱上，用梯度的乙腈的2%H3PO4/水溶液洗脱，纯化产物。收集含有纯化合物的组分，通过离子交换树脂（Biorad，AG 4-X4，100-200目乙酸酯型）过滤，冷冻得到hPTH-（1-38）-OH。
b）烷基化
将40mg（9μmol）hPTH-（1-38）-OH（4458.2g/mol）溶解于1.2ml甲醇，1.2ml磷酸缓冲液（Merck no.9887调节到pH5.0），45mg（716mmol）NaBH3CN（62.84g/mol）和0.8ml（11mmol）丙酮（73.52ml/mol）。中在C-18硅胶上的反应通过RP-HPLC监控，在室温下15小时后完成。用水稀释反应混合物，且在C-18硅柱色谱上用梯度的乙腈的2%H3PO4/水溶液洗脱。收集含有该纯化合物的馏分，用离子交换树脂（乙酸酯型）过滤，冻干得到作为聚乙酸酯，聚水合物的标题化合物。
[α]D＝-5.7°（c＝0.317在95%AcOH中）
MS（离子-喷雾）：4626
实施例4：Nα甲基[Ala1]PTH-（1-38）-OH
如实施例3a中的相同方法装配肽链，在1位代替Fmoc-Ser（tBu）-OH的非天然氨基酸Fmoc-Nα-甲基-Ala-OH与肽树脂偶联。如实施例3a中所述进行裂解，去保护和纯化。
MS（离子喷雾）＝4455，91
实施例5：[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，Phe23，His25，His26Leu27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
采用与实施例3a相似的方法制备此肽。代替Fmoc-Gly酯化成4-羟甲基-苯氧甲基-共（聚苯乙烯-联乙烯苯）所采用的相应的Fmoc-氨基酸，例如，Fmoc-Ala，Fmoc-Phe，Fmoc-D-Ala，Fmoc-D-Phe，等。附加的侧链官能基团如下述被保护：Thr（叔-丁基），Trp（Boc）和Tyr（叔-丁基）。
采用相应的起始物，重复实施例3和5公开的方法，可以获得下述化合物：
实施例6：[Leu8，Asp10，Ala16，Gln18，Thr33]hPTH（1-34）OH
实施例7：[Ile1]hPTH（1-38）OH（IS-MS：4484）
实施例8：[Ala1，Abu2]hPTH（1-38）OH（IS-MS：4428）
实施例9：[Ala1，Nva2]hPTH（1-38）OH（IS-MS：4442）
实施例10：[Ala1，Ile2]hPTH（1-38）OH（IS-MS：4456）
实施例11：[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例12：[N-MeAla1]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4286）
实施例13：[Ala1，Ala3，Leu8，Gln18]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4235）
实施例14：[Thr1]-hPTH-（1-38）OH（IS-MS：4472）
实施例15：[Leu1]-hPTH-（1-38）OH（IS-MS：4484）
实施例16：[Abu1]-hPTH-（1-38）OH（IS-MS：4456）
实施例17：[Gaba1]-hPTH-（1-38）OH（IS-MS：4456）
实施例18：[Leu8，Lys11，Gln18]hPTH（1-36）OH
实施例19：[Leu8，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Arg22]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4347）
实施例20：[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH（1-34）OH（IS-MS：4007）
实施例21：[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：3906）
实施例22：[Leu8，Ala13，Gln18，Gln26，Phe27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例23：Ip-[Leu8，Lys（Ip）13，Gln18，Lys（Ip）26，27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：4175）
实施例24：Ip-[Leu8，Ala13，Gln18，Gln26，Phe27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例25：[Gln16]hPTH（1-38）OH
实施例26：[Ser14]hPTH（1-38）OH
实施例27：[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His25，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例28：[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，Gln26，Phe27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例29：[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：3965）
实施例30：[Leu8，Gln18，Ala29，Glu30，Ile31]hPTH（1-34）OH
实施例31：[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]hPTH（1-36）OH
实施例32：[Leu8，Asp10，Lys11，Ser14，Ile15，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19]hPTH（1-36）OH
实施例33：[Leu8，Asp10，Lys11，Leu18]hPTH（1-36）OH
实施例34：[Leu8，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19]hPTH（1-36）OH
实施例35：[Leu8，Asp10，Lys11，Ala17，Leu18]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4252）
实施例36：[Leu8，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例37：[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：4022）
实施例38：[Leu8，Ala16，Asp17，Leu18，Ala19]hPTH（1-36）OH
实施例39：[Leu8，Asp10，Ala16，Asp17，Leu18，Ala19]hPTH（1-36）OH
实施例40：[Leu8，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例41：[Leu8，Asp10，Lys11，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：4077）
实施例42：[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4181）
实施例43：[Leu8，Ala16，Asp17，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4193）
实施例44：[Leu8，Ala16，Ala17，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4149）
实施例45：[Leu8，Ala17，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH
实施例46：[Leu8，Ala17，Gln18，Ala19，Arg22]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4219）
实施例47：[Leu8，Ala17，Gln18，Ala19，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：3960）
实施例48：[Leu8，Gln18]hPTH（1-36）OH
实施例49：[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：3980）
实施例50：[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4240）
实施例51：[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH（IS-MS：3923）
实施例52：[Leu8，Asp10，Ala16，Gln18]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4225）
实施例53：[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33]hPTH（1-34）OH（IS-MS：3999）
实施例54：[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His26，Leu27，Thr33]hPTH（1-34）OH
实施例55：[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22]hPTH（1-36）OH
实施例56：[Ile15]hPTH（1-38）OH
实施例57：[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例58：[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Arg19，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例59：[Leu8，Ser13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22]hPTH（1-36）OH
实施例60：[Leu8，Ala13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg26，Arg27]hPTH（1-36）OH
实施例61：[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His26，Leu27，Arg33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例62：[Leu8，Ala16，17，18，19]hPTH（1-36）OH
实施例63：[Leu8，Ala13，Ala16，Gln18，Ala19，Gln26，Phe27]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4127）
实施例64：Ip-[Leu8，Ala13，Ala16，Gln18，Ala19，Gln26，Phe27]hPTH（1-36）OH
实施例65：Ip-[Leu8，Lys（Ip）13，Ala16，Gln18，Ala19，Lys（Ip）26，27]hPTH（1-36）OH
实施例66：[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4166）
实施例67：Ip-[Leu8，Lys（Ip）13，Ala16，Ala17，Ala18，Ala19，Lys（Ip）26，27]hPTH（1-36）OH
实施例68：[Aib3，Gln18]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4283）
实施例69：Ip-[Leu8，Asp10，Lys（Ip）11，13，26，27，Gln18]hPTH（1-36）OH
实施例70：Ip-[Leu8，Ser13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22，Lys（Ip）26，27]hPTH（1-36）OH
实施例71：[Leu8，Tyr18]hPTH（1-36）OH
实施例72：[Ser33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例73：[Thr33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例74：[Leu33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例75：[Gly33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例76：[Leu8，His10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例77：[Leu8，Gly10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例78：[Leu8，Glu10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例79：[Leu8，Thr10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例80：[Leu8，Gln10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例81：[Gln33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例82：[Leu8，Tyr10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
实施例83：[1-amino-cyclopentane-1-carboxylicacid1，Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH
实施例84：[1-amino-cyclopentane-1-carboxylic acid1，Leu8，Ala13，16，Gln18，Ala19，Arg26，27]hPTH（1-36）OH
实施例85：[1-amino-cyclopentane-1-carboxylic acid3，Gln18]hPTH（1-36）OH（IS-MS：4309）
实施例86：[Arg12]-hPTH-（1-38）-OH
实施例87：[Ser12]-hPTH-（1-38）-OH
实施例88：[Cys13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例89：[Ile13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例90：[Asn13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例91：[Trp13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例92：[Asp13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例93：[Val13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例94：[Thr13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例95：[Ser13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例96：[Tyr13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例97：[Met13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例98：[Gln13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例99：[Leu13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例100：[Ala13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例101：[Gly13]-hPTH-（1-38）-OH
实施例102：[Val14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例103：[Ala14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例104：[Lys14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例105：[Arg14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例106：[Thr14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例107：[Ile14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例108：[Tyr14]-hPTH-（1-38）-OH
实施例109：[Tyr15]-hPTH-（1-38）-OH
实施例110：[Arg15]-hPTH-（1-38）-OH
实施例111：[Val15]-hPTH-（1-38）-OH
实施例112：[Lys16]-hPTH-（1-38）-OH
实施例113：[Ser16]-hPTH-（1-38）-OH
实施例114：[Leu16]-hPTH-（1-38）-OH
实施例115：[Ala16]-hPTH-（1-38）-OH
实施例116：[Gly16]-hPTH-（1-38）-OH
实施例117：[Ala17]-hPTH-（1-38）-OH
实施例118：[Met17]-hPTH-（1-38）-OH
实施例119：[Ile17]-hPTH-（1-38）-OH
实施例120：[Ser19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例121：[Lys19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例122：[Leu19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例123：[Ala19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例124：[Tyr19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例125：[Met19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例126：[His19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例127：[Val19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例128：[Gly19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例129：[Pro19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例130：[Asp19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例131：[Ile19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例132：[Val19，Gln24]-hPTH-（1-38）-OH
实施例133：[Arg19]-hPTH-（1-38）-OH
实施例134：[Phe20]-hPTH-（1-38）-OH
实施例135：[Ala21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例136：[Gly21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例137：[Phe21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例138：[Leu21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例139：[Asn21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例140：[Gln21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例141：[Ser21]-hPTH-（1-38）-OH
实施例142：[Gly22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例143：[Leu22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例144：[His22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例145：[Ala22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例146：[Ile22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例147：[Val22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例148：[Ser22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例149：[Arg22]-hPTH-（1-38）-OH
实施例150：[Arg26]-hPTH-（1-38）-OH
实施例151：[Val27]-hPTH-（1-38）-OH
实施例152：[Ile27]-hPTH-（1-38）-OH
实施例153：[Leu27]-hPTH-（1-38）-OH
实施例154：[Arg27]-hPTH-（1-38）-OH
实施例155：[Ala27]-hPTH-（1-38）-OH
实施例156：[Val28]-hPTH-（1-38）-OH
实施例157：[Ile28]-hPTH-（1-38）-OH
实施例158：[Pro3，Thr33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例159：[Arg33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例160：[Pro33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例161：[Asp33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例162：[Ile33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例163：[Lys33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例164：[Ile31，Arg33]-hPTH-（1-38）-OH
实施例165：[1-氨基环戊烷-1-羧酸1]hPTH-（1-36）NH2
在聚苯乙烯基质的树脂载体上，以分段的方法装配肽。用Fmoc-基团保护α氨基
侧链的官能基团如下被保护Arg（Pmc），Asn（Trt），Asp（OtBu），Gln（Trt），Glu（OtBu），His（Trt），Lys（Boc），Ser（tBu），Thr（tBu），Trp（Boc）和Tyr（tBu），其它氨基酸未被保护。
可制备的4-（2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨基-甲基）苯氧-共（聚苯乙烯-联乙烯苯），0.4mmol/g，例如，如Tetrah.Letter，28，3787-3790（1980）中所述，进行下述循环步骤（1）至（5）的处理。
（1）DMF
（2）哌啶（20%）的DMF溶液
（3）DMF
（4）HOBT，二异丙基碳化二亚胺，和Fmoc-氨基丙酸的混合物（每克起始树脂各0.8mmol）
（5）DMF
洗涤和试剂的体积是每克起始树脂5至20ml
在下一个处理（1）至（5）的循环中，用Fmoc-缬氨酸代替Fmoc-氨基丙酸，而且如此进行各个循环使得，在树脂上装配标题化合物的正确的氨基酸序列。
按需要的次数重复各步骤使之完成该残基的反应（步骤2，4）或完成从树脂中置换先前的反应物（步骤3，5）。每个循环后除去树脂样品，并用茚三酮进行残留氨基的比色试验检验偶合反应的完成。
在结束合成的最后循环中，仅进行步骤（1）至（3），并用2-丙醇，然后用甲醇和二氯甲烷（1∶1v/v）的混合物洗涤肽树脂，在真空干燥器中充分干燥。
在室温下将肽树脂（1g）悬浮在三氟乙酸，水，和1.2-乙烷二硫醇（90∶5∶5v/v）的混合物（20ml）中2小时，过滤掉树脂颗粒并用少量的TFA洗涤。加入***（20体积）使产物从合并的滤液中沉淀出，过滤，用较高的***洗涤并干燥。将剩余物溶于2%乙酸中，在冻干前，使溶液在室温下静置8小时。冻干物在C-18硅柱色谱上用梯度的乙腈的2%H3PO4溶液洗脱，用HPLS分析检测各组分，收集含有纯化合物的组分，用乙酸酯型阴离子交换树脂过滤上述馏分，并冻干得到如聚乙酸酯，多水合物的标题化合物。
例如，可如G.Valle等人，1988，在Can.J.Chem.66：2575-2582中所述，制备用于制备肽树脂的中间体Fmoc-1-氨基环戊烷-1-羧酸。
MS（离子-喷雾）：4312
实施例166：[1-（1-氨基环丙烷-1-羧酸）]hPTH（1-36）NH2
采用相似于实施例165的方法制备上述肽。例如，可如M.Crisma等人（1989）在Int.J.Biol.Macromol.11：345-352中所述，制备用于制备肽树脂的中间体Fmoc-1-氨基环丙烷-1-羧酸。MS（Ion-Spray）：4283。
采用相应的起始物，重复实施例165描述的方法，可以获得下述化合物：
实施例167：[D-Pro1]hPTH（1-36）NH2
实施例168：[Nva1]hPTH（1-36）NH2
实施例169：[N-Me-Ser1]hPTH（1-36）NH2
实施例170：[Indole-2-carboxylic acid1]hPTH（1-36）NH2
实施例171：[Indole-3-carboxylic acid1]hPTH（1-36）NH2
实施例172：[Pyridine-3-carboxylic acid1]hPTH（1-36）NH2
实施例173：[Pyridine-2-carboxylic acid1]hPTH（1-36）NH2
实施例174：[Hexahydropyridazine-3-carboxylic acid1]hPTH（1-36）NH2
实施例175：[Morpholine-2-carboxylic acid1]hPTH（1-36）NH2
实施例176：[Pro1]hPTH（1-36）NH2
实施例177：[Leu1]hPTH（1-36）NH2
实施例178：[Ile1]hPTH（1-36）NH2
实施例179：[Thr33，Ala34]hPTH（1-34）NH2
实施例180：[Nva8]hPTH（1-36）NH2
实施例181：[Gln18]hPTH（1-36）NH2
实施例182：[Tyr18]hPTH（1-36）NH2
实施例183：[Lys18]hPTH（1-36）NH2
实施例184：[Ala18]hPTH（1-36）NH2
实施例185：[Phe23，His25，His26，Leu27]-hPTH（1-34）NH2
实施例186：[Phe23]-hPTH（1-36）NH2（IS-MS：4247）
实施例187：[Phe23，His25，His26，Leu27，Ile28，Ala29，Glu30，Ile31，Thr33，Ala34]-hPTH（1-34）NH2（IS-MS：3934）
实施例188：[Ala29]-hPTH（1-36）NH2（IS-MS：4248）
实施例189：[Ala34]-hPTH（1-36）NH2（IS-MS：4210）
实施例190：[Gln25]hPTH（1-36）NH2
实施例191：[Leu8，Asp10，Lys11，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）NH2
实施例192：[Ala1，His5，Leu8，Asp10，Lys11，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）NH2
实施例193：[Ser14，Ile15，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）NH2
实施例194：[D-Phe34，D-Ala36]hPTH（1-36）-NH2[MS（IS）：4290]
实施例195：[Ala3]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4271]
实施例196：[D-Ser3]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4290]
实施例197：[D-Glu4]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4290]
实施例198：[D-His9]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4286]
实施例199：[Ala10]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4243]
实施例200：[D-Asn10]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例201：[Ala12]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4299]
实施例202：[Gln13]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4287]
实施例203：[His13]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4296]
实施例204：[Leu13]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4371]
实施例205：[Ala13]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4228]
实施例206：[Ala13，Gln26，Phe27，D-Phe34，D-Ala36]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4249]
实施例207：[Ala14]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4219]
实施例208：[D-His14]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例209：[D-Asn16]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4284]
实施例210：[Ala17]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4270]
实施例211：[D-Ser17]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例212：[Ala19]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4228]
实施例213：[D-Glu19]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例214：[Ala21]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4257]
实施例215：[Ala22]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4227]
实施例216：[Gln26]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4287]
实施例217：[Nle26]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4271]
实施例218：[D-Lys26]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例219：[Nle8，18，27]hPTH（1-36）NH2
实施例220：[His27]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4294]
实施例221：[Phe27]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4304]
实施例222：[Nle27]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4271]
实施例223：[Asn27]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4271]
实施例224：[Ala27]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4228]
实施例225：[D-Gln29]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4289]
实施例226：[D-Asp30]hPTH（1-34）NH2[MS（IS）：4118]
实施例227：[Ala30]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4241]
实施例228：[D-Val31]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4290]
实施例229：[Ala31]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4258]
实施例230：[Lys32]hPTH（1-34）NH2[MS（IS）：3832]
实施例231：[D-His32]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例232：[Ala32]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4219]
实施例233：[D-Asn33]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4288]
实施例234：[Ala33]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4210]
实施例235：[NMePhe34]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4301]
实施例236：[D-Asp30]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4290]
实施例237：Ip-[Nle8，18，Lys（Ip）13，26，27，D-Asn33，D-Phe34]hPTH（1-34）NH2
实施例238：Ip-[Nle8，18，27，Lys（Ip）13，26]hPTH（1-36）NH2
实施例239：[Nle8，18，D-Asn33，D-Phe34]hPTH（1-34）NH2[MS（IS）：4080]
实施例240：[Lys（Ip）13]hPTH（1-36）NH2[MS（IS）：4331]
实施例241：Propargyl-[A1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例242：[Ala0]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例243：[Pro0]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例244：Acetyl-hPTH-（1-36）-NH2
实施例245：[HyPro1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例246：N-Dimethyl-[Ala1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例247：[D-Ser1]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例248：[Lys（For）1]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4356]
实施例249：[D-Glyceric acid1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例250：[Asn1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例251：[4-Aminobenzoic acid1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例252：[4-Aminosalicylic acid1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例253：[TMSA1]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4343]
实施例254：[Phe1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例255：[Propargylglycin1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例256：[Ala1，His5，Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Phe22，Phe23，His25，His26，Leu27，Thr33，Ala34]-hPTH-（1-34）-NH2
实施例257：[Abu2]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例258：[D-Val2]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例259：[tert.Leu2]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例260：[Ala1]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例261：[D-Ile5]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例262：[D-Gln6]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例263：[D-Leu7]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例264：[Nle8]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4268]
实施例265：[Phe8]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4303]
实施例266：[Cha8]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4309]
实施例267：[Leu8]-hPTH-（1-38）-NH2
实施例268：[D-Leu11]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4287]
实施例269：[Ala11]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4244]
实施例270：[D-Lys13]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例271：[D-Leu15]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例272：[Ala15]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4243]
实施例273：[Ala16]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4243]
实施例274：[Met（O2）18]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4320]
实施例275：[Nle18]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4268]
实施例276：[D-Met18]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例277：[Lys20]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4259]
实施例278：[D-Arg20]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例279：[D-Val21]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例280：[Trp（SO2Pmc）23]-hPTH-（1-38）-NH2[MS（IS）：4723]
实施例281：[Trp（Pmc）23]-hPTH-（1-38）-NH2[MS（IS）：4660]
实施例282：[D-Trp23]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例283：[Ala23]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4171]
实施例284：[D-Leu24]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例285：[Phe25]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4277]
实施例286：[Lys25]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4258]
实施例287：[Ala25]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4201]
实施例288：[Ala26]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4229]
实施例289：[Lys26/27（For）]-hPTH-（1-34）-NH2
实施例290：[D-Lys27]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例291：[D-Leu28]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例292：[D-Phe34]-hPTH-（1-36）-NH2[MS（IS）：4288]
实施例293：[D-Val35]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例294：[Ala35]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例295：[Pro35]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例296：[NMeVal35]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例297：[Thr35，Ala36]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例298：[D-Ala36]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例299：[NMeAla36]-hPTH-（1-36）-NH2
实施例300：（5-氨基-4-氟-2-异丙基）-己-3-烯酰-hPTH（3-36）NH2
a）hPTH-（3-36）-NH-树脂的制备
采用相似于实施例165中的方法制备此中间体。
b）[（5-氨基-4-氟-2-异丙基）-己-3-烯酰]hPTH（3-36）-酰胺。
用DMF处理上述a）中得到204.6mg Fmoc-hPTH（3-36）-NH-树脂5分钟。然后用异丙醇和DMF洗涤几次。用DMF/哌啶8∶2处理10分钟，以除去Fmoc-保护基。在0.7ml DMF中，将去保护的PTH-片段，38.1mg的4-氟-2-异丙基-5-叔-丁氧羧基氨基-己-3-烯酸，68.7mg苯并***-1-基氧三（吡咯烷）磷鎓六氟磷酸盐（PyBOP）和26.6mg4-甲基吗啉振荡80分钟。用异丙醇和DMF洗涤几次后，用4.5ml TFA/0.25ml水/0.25乙烷二硫醇处理固体剩余物55分钟。然后过滤混合物，加入二***使标题化合物从所剩溶液中沉淀出。用制备HPLC（Vydac柱，梯度A＝水，B＝7乙腈/3水/0.2磷酸）纯化标题化合物。
MS（离子-喷雾）：质量4272
[α]Hg 365nm＝-66.8°（C＝0.25在95%ACOH中）
实施例301：4-氟-2-异丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸酯
a）（s）-3（1-氧（4-氟-3-羟基-2-异丙基）己-4-烯基）-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮
采用相似于D.A.Evans等人，Org.Synth.68，1990所述的方法，以（s）-3-（1-氧异丙基）-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮和2-氟-丁-2-烯醇起始制备标题化合物。
MS（FAB）：MH+350
b）（s）-3-（1-氧代（4-氟-3-O-（2，2，2-三氯乙烷亚胺）-2-异丙基）己-4-烯基）-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮
将1.5g实施例301a）化合物溶于6ml DCM中。在0°加入0.0958ml 1.8-二氮杂双环（5，4，0）十一-7-烯（DBU）。在0℃向此溶液滴加入0.475ml三氟乙腈的2ml DCM溶液。一小时后蒸发反应混合物，剩余物用硅胶柱色谱（己烷/***2∶1）纯化。MS（FAB）：MH+493
c）（s）-3-（1-氧化（4-氟-5-N-2，2，2-三氟乙酰基氨基-2-异丙基）己-3-烯基）-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮
将2g化合物301（b）溶于150ml邻-二甲苯中，并在160°搅拌3小时，然后除去邻-二甲苯，剩余物在硅胶柱色谱（甲苯/乙酸乙酯98∶2）上纯化。
MS（FAB）：MH+493
d）4-氟-5-N-2，2，2-三氯乙酰基氨基-2-异丙基-己-3-烯酸
采用相似于D.A.Evans等人Org.Synth.68 1990所述的方法，以化合物301c）为起始物制备标题化合物。
MS（FAB）：MH+335
e）5-氨基-4-氟-2-异丙基-己-3-烯酸
将899mg的化合物301d）溶于20ml乙醇中，加入13.5ml 6N的氢氧化钠溶液。在室温下搅拌此混合物20小时。除去乙醇，剩下的液体组分用2N HCl酸化到pH＝2，并用正-丁醇撮。蒸发提取物，剩余物通过硅胶（DCM/甲醇1∶1）过滤，由此获得纯的标题化合物。
MS（FAB）：MH+190
f）4-氟-2-异丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸
将0.56g化合物301e）溶于12ml水中并加入1.5g碳酸钠。对此溶液加入溶于12ml四氢呋喃的0.4g二叔丁基碳酸酯。在室温下搅拌此混合物18小时。然后加入50ml正-丁醇和50ml水，并在剧烈搅拌下加入1N HCl直至pH＝2。蒸发有组分，剩余物用硅胶柱色谱（己烷/丙酮1∶2）提纯。
MS（FAB）：MH+290
[α]D＝-61.3°（1%在甲醇中）
重复上述方法，并用相应的起始物制备下述化合物：
4-氟-2-甲基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸
4-氯-2-甲基-5-叔丁氧羰基氨基己-3-烯酸
4-氟-2-苯甲基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸
4-氯-2-异丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸
4-甲基-2-异丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸
实施例302
采用上述实施例300的方法，但用适当的起始物可制备下述化合物：
-（5-氨基-4-氟-2-甲基）-己-3-烯酰基-hPTH（3-36）酰胺
MS（离子-喷雾）：质量4245
-（5-氨基-4-氯-2-甲基）-己-3-烯酰基-hPTH（3-36）酰胺
MS（离子-喷雾）：质量4260
-（5-氨基-4-氟-2-苯甲基）-己-3-烯酰基-hPTH（3-36）酰胺
MS（离子-喷雾）：质量4320
-（5-氨基-4-氯-2-异丙基）-己-3-烯酰基-hPTH（3-36）酰胺
MS（离子-喷雾）：质量4289
-（5-氨基-4-甲基-2-异丙基）-己-3-烯酰基-hPTH（3-36）酰胺
MS（离子-喷雾）：质量4269
实施例303
采用上述实施例300的方法，但用适当的起始物，可制备下述化合物：
a）（5-氨基-3-氮杂-2-异丙基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4257]使用的起始物：（4-氮杂-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
b）（5-氨基-3-氮杂-3-N-乙酰基-2-异丙基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4299]使用的起始物：（4-氮杂-4-N-乙酰基-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）己酸
c）（5-氨基-3-氮杂-3-N-乙酰基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4257]使用的起始物：（4-氮杂-4-N-乙酰基-2-叔丁氧羰基氨基）-己酸
d）（5-甲基氨基-3-氮杂-2-异丙基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4271]使用的起始物：[4-氮杂-2-（N-叔丁氧羰基，N-甲基氨基）-5-异丙基]-己酸
e）（5-甲基氨基-3-氮杂-3-N-甲基-2-异丙基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4285]使用的起始物：[4-氮杂-4-N-甲基-2-（N-叔丁氧羰基氨基，N-甲基氨基）-5-异丙基]-己酸
f）（5-氨基-3-氮杂-3-N-甲基-2-异丙基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4271]使用的起始物：（4-氮杂-4-N-甲基-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
g）（5-氨基-3-氮杂-3-N-并丙基）-己酰基-hPTH（3-36）-酰胺[MS（离子-喷雾）：4257]使用的起始物：（4-氮杂-4-N-异丙基-2-叔-丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
h）[1-环戊烷-1-氨基-1-羧酸（psi CH2-NH）-Val2]-hPTH（1-36）-酰胺，采用1-环戊烷-1-叔丁氧羰基氨基-1-羧酸（psi CH2-NH）-Val-OH作为起始物
实施例304：
采用上述实施例3a）的方法，但用相应的起始物，可制备下述化合物：
（5-氨基-3-氮杂-2-异丙基）-己酰基-[Leu8，Ala6，Gln18，Ala19）hPTH（3-36）OH[MS（离子-喷雾）：4135]使用的起始物：（4-氮杂-2-叔-丁氧羰基氨基）-己酸
实施例305：（4-氮杂-4-N-乙酰基-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
a）甲基（4-氮杂-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基7-己酸用Lawesson-试剂（S.-O.Lawesson，等人，Tetrahedron1981，37，3635）处理Boc-Ala-Val-OMe.然后根据F.S.Guziec等人THL，1991，23-26所述的方法，还原所得的内硫肽。
MS（EI）：MH+289
b）（4-氮杂-4-N-乙酰基-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）己酸甲基酯
将264mg的化合物305a）溶于5ml DCM然后加入0.14ml三乙基胺和0.072ml乙酰氯，在40°搅拌此混合物24小时。加入50ml DCM后，用水洗涤溶液两次。干燥有机组分并蒸发。然后将获得的标题化合物用柱色谱（己烷/乙酸乙酯4∶1）纯化。
MS（EI）：M+330
c）（4-氮杂-4-N-乙酰基-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
将356mg化合物305b）溶于4ml甲醇/水3∶1中，加入53mg氢氧化锂。在60°搅拌此混合物二小时。然后加入25ml DCM并在剧烈搅拌下加入1N HCl直至pH＝2。分离有机组分，干燥并蒸发，由此获得纯化的标题化合物。
MS（FAB）：MH+317
重复此方法，但采用合适的起始物，获得下述化合物：
（4-氮杂-4-N-乙酰基-2-叔丁氧羰基氨基）己酸
（4-氮杂-2-叔丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
[4-氮杂-2-（N-叔-丁氧羰基，N-甲基氨基）-5-异丙基]-己酸
（4-氮杂-4-N-甲基-2-叔-丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
（4-氮杂-4-N-异丙基-2-叔-丁氧羰基氨基-5-异丙基）-己酸
（4-氮杂-2-叔-丁氧羰基氨基）-己酸
实施例1至300和302至304的化合物，在氨基酸定量分析中，显示出正确的氨基酸比例。
下述的实施例说明了本发明的重组方法，如果不另外指明，采用Ausubel等人;在1991;Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York中所描述的常规方法
实施例306：克隆噬菌体T4基因55
两个DNA片段，一个含有噬菌体T4基因55的全部编码序列，另一个编码了它的一部分，用纯化的T4DNA作为模版，通过聚合酰链反应（PCR）使它们扩展。用含有NdeI或BamHI核内切酶识别序列的寡核苷酸作引物。用模版和100pM的上游引物（GAGGTGCATACC TGTCAGAAAC TAAGCCT27,NdeI识别位点由它的核苷酸7-12提供）和100pM的下游引物（GGYCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC 40,BamHI的识别位点由核苷酸5-10提供）在100μl反应缓冲液中，该缓冲液含有10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2分别0.2mM的dATP，dCTP，dGTP，dTTP，和0.1%Triton×100，pH为9.0进行PCR反应（25次循环，各为30″94℃，30″50°，30″72℃）获得0.6kb的段。基因55的平头形式是通过正如制备全部基因所描述的PCR法制备的，除了采用不同的寡核苷酸作为下游引物（GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT 28,BamHI识别位点由它的核苷酸5-10提供）。获得0.35kb的片段。0.6kb和0.35kb DNA片段用限制性核酸内切酶NdeI/BamHI消化，并克隆到NdeI/BamHI，消化的表达载体pET17B（从Novagen获得）中。0.6kb DNA片段编码了全部的gp55蛋白质（188氨基酸残基-见图1），而0.35kb片段编码了gp55的12kD氨基酸末端片段（112氨基酸残基-见图2）。
实施例307：编码PTH（1-38）DNA的制备的克隆
通过PCR，采用克隆合成的PTH（1-38）编码序列作模版，生成了编码了a）相应于图1的氨基酸残基110-115和PTH（1-38）的连接子肽，或b）相应于图2的氨基酸186-191和PTH（1-38）的连接子肽的DNA片段。把编码连接子a）寡核苷酸（GAGTGGATCC ATCGATCCACCATCCGTATC AGAAATACAA CT 42），或编码连接子b）的寡核苷酸（GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT42作为上游引物。下游引物TCTACTCGAG TTAACCCAGA GCTACAAAAT TATG34。每个上游引物与一个BamHI克隆位点结合且下游引物含有XhoI识别位点（每个序列的核苷酸5-10）。如实施例306所述的相同条件下进行PCR反应。用BamHI和XhoI裂解后，将0.14kb PCR产生***到BamHI-XhoI消化的gp55-pET17B质粒中，获得实施例306。
为了表达该融合蛋白质，所得质粒构建体转化到大肠杆菌E.ColiBL21（DE3）LysE中且单独的细菌克隆进一步繁殖。在37℃在一个旋转振荡器上，在周期生长介质（Bio 101）中培养一种预培养物过夜，获得该融合蛋白的表达。用主培养体积的1-5%产生的预培养物来接种主培养物。然后在37℃温度，和pH6.9至7.1下，同时以101/min充气并在200-400rpm搅拌下发酵主培养物。当培养物OD550达到大约1.0至5.0时，加入1mM IPTG诱发表达。诱发后发酵作用继续大约五小时，且然后不杀死大肠杆菌E.cdi细胞，收获发酵肉汤。用管离心使收获的细胞族转沉下，再悬浮在样品缓冲液中，用SDS PAGE测定表达。然后冷冻细胞沉淀物，直到纯化。此方法和采用的宿主细胞全部在Studier等人;1990;“应用T7RNA聚合酶使克隆的基因直接表达”，Methods in Enzymology，Academic Press，60至89页中描述。
实施例308：内含体的制备
将从实施例307获得的冷冻的大肠杆菌E.coli沉淀再次悬浮到25% w/v缓冲液A（50mM Tris pH8.0;含有2mM DTT，5mM苯甲脒-HCl，1.5mM MgCl2，1.0mM MnCl2，10μg/ml DNA酶和2mg/ml溶菌酶）中并在室温下伴随搅拌混合1小时。该再次悬浮的细胞通过Manton-Gaulin均浆器（在1200bar通过2次）溶解并将所得的溶胞产物保持在冰中。用冰-冷却的缓冲液B（50mM Tris pH8.0;含有2mM DTT，5mM苯甲脒-HCl和4mM EDTA）使溶胞产物稀释2倍，并在27，500g离心30min。
细心除去离心的上清液并丢弃。沉淀物再次悬浮在25%w/v的缓冲液B中，如前述再次通过Manton-Gaulin并离心。用缓冲液B重复此过程一次并用水重复一次。称重所得内含体沉淀物并冷冻到-20℃待用。
实施例309：gp55-Asp-Pro-Pro-（1-38）hPTH内含
体的溶解和裂解
在实施例308获得的含有gp55-Asp-Pro-Pro-（1-38）hPTH的冷冻内含体悬浮于10mM HCl酸性溶液（分析纯）中，直至最后浓度为6%w/v。在50℃温育溶液24小时，加入1体积100mM NaOAc水溶液使反应终止。在27，500g离心30分钟使稀释的上清液澄清并通过玻璃纤维滤器过滤。
实施例310：gp55-Asn-Gly-Pro-（1-38）hPTH内含体的溶解和裂解
如实施例308获得的含有gp55-Asn-Gly-Pro-（1-38）hPTH冷冻内含体溶于6M胍-HCl（含有2M羟胺-HCl并通过加入4.5M LiOH使pH升至9.0）中，得到大约5mg/ml蛋白质。通过进一步加入LiOH使pH再调整至pH9，并在45℃保温溶液4小时。加入甲酸至pH4使反应中止，如实施例309所述使溶液离心并过滤。
实施例311：Gly-Pro和Pro-Pro（1-38）hPTH的制备HPLC
在分析反相HPLC（Orpogen HD-胶-RP-7s-300;4×150mm柱）上分析过滤的裂解物的上清液，并与已知（1-38）hPTH标准（Ba chem）比较以确定PTH浓度。柱用85%HPLC缓冲液A（90%水，10%乙腈;含0.1%v/v TFA）和15% HPLC缓冲液B（10%水，90%乙腈，含0.1%TFA）平衡并用15%HPLC缓冲液B至100%HPLC缓冲液的梯度，以流速为0.75ml/min，用超过15分钟的时间进行洗脱。
根据制剂的标准，上清液既可装入1.0×25cm C4Vydac或装入2.2×25cm C4Vydac。分别在流速4ml/min和10ml/min，用85%HPLC缓冲液A和15%HPLC缓冲液B平衡柱。分别用超过80ml的15%B至85%B和超过300ml的15%B至55%B对柱进行梯度洗脱。
手工收集Gly-Pro-hPTH（1-38）或Pro-Pro-hPTH（1-38）峰，然后在真空下除去乙腈，用分析HPLC确定裂解后和在收集组分中的肽浓度。
将除去溶剂的肽溶液用等体积的100mM乙酸钠稀释并调节pH，如果需要，调节至pH5.4，接着过滤（0.2μm），将溶液装入阴离子交换柱（或单s或sp-琼脂糖高效，分别装入HR10/10或XK16/10柱）用50mM乙酸钠pH5.4（缓冲液C）平衡。用超过7.5柱体积的0至500mM NaCl梯度的缓冲液C进行柱洗脱。收集10ml组分并集中X-X-（1-38）hPTH峰，（如前述用HPLC确定肽浓度。
此柱适用于将肽交换到多种生理缓冲液中，且适用于除去融合蛋白质本身化学裂解生成的附加肽。
实施例312：从X-X-（1-38）hPTH上酶脱除去XX
将实施例311中获得的集中的肽馏分（浓度范围1.5-2.5mg/ml）通过加入固体Tris使pH为8。加入纯化的脯氨酰基二肽酶（在PBSpH7.2中0.5mg/ml）（Nardi等人（1991）App.Env.Microbiol，57，No.1，40-50）至1∶1000，并把溶液在37℃温育24h。加入TFA（pH＝5.0）至0.2%使反应终止，且所得产物（1-38）hPTH用制备HPLC分离（采用如实施例311所述的相同条件）。且除去等分的N-末端序列后除去溶剂冻干，光谱分析质量。
采用相似如上所述方法，采用两个融合蛋白质所获得的产量实施例如下：
Gen55-Asp-Pro-Pro-（1-38）PTH（用平截形的Gen55）
在部分最适发酵条件下，从10升发酵物中获得215g湿细胞沉淀物。融合蛋白质的百分表达水平为大约37%，从此沉淀物中，分离出31g的内含体。这些内含体蛋白质纯度（着眼于融合蛋白体）为61%。溶解，裂解和离心/过滤后，检测得大约620mg的Pro-Pro-PTH。继C4-Vydac HPLC之后，该物质产生580mg Pro-Pro-PTH，将其稀释，在Monos上离子交换，用X-脯氨酰基二肽酶（在Pro-Pro-PTH的浓度为2mg/ml）消化，HPLC和冻干后，获得440mg具有全部生理活性的冻干纯产物，停止裂解步骤和最终产物之间的产率为71%。
Gen55-Asn-Gly-Oro-（1-38）PTH（用“长”型的Gen55）
从20升非最优的发酵物中，收获得具有50%融合蛋白质表达的78g湿细胞沉淀物，随后溶胞并离心，获得18g“90%纯”的内含体。接着用酸终此步骤并离心/过滤，测得大约470mg Gly-Pro-PTH.在C4-Vydac上HPLC后，测得355mg肽，sp-琼酯糖离子-交换后，减少到321mg。在2mg/ml进行酶促除去Gly和Pro残基。最后的HPLC步骤和冻干后，获得244mg纯的，具有全部生理活性的（1-38）PTH，从停止裂解反应步骤表示的产率为52%。
采用实施例306至312的方法，还可制备实施例25，26，56和86至164的化合物。
以游离形式或以适于药用的盐形式的本发明化合物和络合物，正如动物实验显示的具有有价值的药物学活性，且因之表现出疗效。
根据Marcus和Aurbach在Endocrinology，85，801-810（1969）的方法，通过在离体测定本发明化合物在UMR106-06小鼠和SaOS-2人体骨肉瘤细胞中刺激环AMP合成的能力，来评价它们的生物活性。在12孔盘的Eagle′s最少量必需介质-10%FCS中使小鼠骨肉瘤UMR106细胞生长至融合。使人体SaOS-2骨肉瘤细胞在McCoy′s5A介质-10%FCS中生长。然后将此介质转换成2%FCS的介质，并加入1-5μCi/孔[3H]-腺嘌呤，两小时后，细胞用无血清介质洗涤二次，并在含有1mM-3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的DMEM-1%BSA中保温。以排除在磷酸二酶中的作用，20分钟后加入供试底物，15分钟后通过加入冰冷却的5%三氟乙酸使反应停止，并提取cAMP。加入含有5mM的未示踪腺嘌呤，腺苷，AMP，ADP，ATP，和cAMP以及0.4μCi[14c]-腺苷的载体溶液（0.5ml/孔）以测定回收率。用系列的Dowex 50W-X4（200-400目）和氧化铝色谱分离[3H]-cAMP并计数。以对照溶剂的%计算结果，并从DRC曲线上确定EC50值。在10-11至10-6M的浓度本发明化合物能够刺激UMR106-06小鼠和SaOS-2人骨肉瘤细胞中产生cAMP。
本发明化合物还具有对PTH受体结合亲合力，例如，如下述：
用乳过氧化物酶方法（Anawa Lab，AG，Wangen）将鸡[Tyr36]PTHrP（1-36）酰胺磺化成2，200Ci/mmol的特异性。用含有1%BSA的200μl DMEM和HAM′sF12（1∶1）冲洗单层的肾细胞，并在16℃与存在或不存在1μM[Tyr1]chPTHrP（1-36）酰胺的每孔50.000cpm的[125I-Tyr36]chPTHrP（1-36）酰胺培育。培育后，用0.5ml介质（4℃）冲洗细胞，用0.5ml 1N NaOH使细胞溶解并测定放射性。特异结合被定义为总结合减非特性结合。采用SCTFIT，一种非线性回归计算机程序（Feyen等人，1992，Biochem，Biophys，Res，Commun.197：8-13）分析竞争内线且数据用平均pKD值（n＝2至3）表示，在本试验中本发明化合物结合亲合性的平均pKD值为7至10。
进一步的，连续皮下注入后，本发明化合物可提高血浆钙水平，例如，测定甲状腺甲状旁腺切除的140至170g雄性威斯特鼠在甲状腺甲状旁腺切除5天后，用Alzet小泵植入鼠颈，以0.3至30μg/天/鼠的量输入供试化合物。在此后1，2，3和6天后的早晨后眶刺孔引出血液，且通过光度计测定血浆钙浓度，在本实验中本发明化合物提高了血钙浓度。
因此本发明化合物表现出预防或治疗与钙增加衰竭或吸收作用有关的，或需要钙固定在骨骼中的骨骼疾病，例如多种发生性（例如，由老龄或由皮质类固醇治疗或失活引起的少年性，绝经，绝经后，创伤后。）骨质疏松症，骨皙，包括与骨骼去矿质作用有关的急性和慢性骨病，骨软化，由关节炎或骨关节炎引起的牙周骨丧失，或用于治疗甲状旁腺机能减退。
本发明化合物特别适应于预防或治疗多种发生性骨质疏构症。
在上述所有用途中，本发明化合物适用的每日剂量范围在大约0.003至大约10mg，优选0.003至3，更优选0.01至1mg。本发明化合物每天一次或一周内二次给药。
本发明化合物可以游离形式或以药用可接受的盐形式或配合物给药。上述盐和配合物可以按常规方法制备且具有如游离化合物相同等级的活性。本发明还提供了含有以游离碱形式或药用可接受的盐形式或配合物形式的本发明化合物，以及有关的药用可接受的稀释剂或载体的药用组合物。上述组合物可以常规方法配制。本发明化合物可以任何常规途径给药，例如以注射溶液或悬浮液形式肠胃外的途径，胃肠途径，例如口服，例如以片或胶囊形式或以透皮吸收的，鼻的或栓剂的形式给药。
根据如前面所述，本发明进一步提供了：
a）用作药物的本发明化合物或药用的盐或它们的配合物。
b）促进骨形成的方法，例如预防或治疗与钙增加衰竭或吸收作用有关的，或需要钙固定在骨骼中的所有的骨骼疾病，例如多发性（例如，由老龄或由皮质类固醇治疗或失活引起的少年性，绝经，绝经后，齿具备后）骨位疏松症，骨折，包括与骨骼去矿质作用有关的急性和慢性骨病，骨软化，由关节炎或骨关节炎引起的牙周骨丧失或骨丧失，或用于治疗甲状旁腺机能减退，该方法包括对所述的患者施用有效量的本发明化合物或药用的盐或它们的配合物;
c）用于制备上述方法b）中的药用组合物的本发明化合物或其药用的盐或配合物。
本发明进一步的实施例，本发明的化合物可以作为其它治疗的附加物或助剂，例如使用骨吸收抑制剂的治疗，例如骨质疏松症的治疗，特别是使用例如鲑，鳗类或人体降钙素的降钙素或它的类似衍生物的治疗，例如***，部分***激动剂或***-孕激素结合物的类固醇激素、磷酸氢盐、维生素D或它的类似物，或它们的任何组合。
与本发明化合物结合给药时，例如作为骨吸收抑制治疗助剂，联合给药的抑制剂的药剂当然地取决于使用的抑制剂药物的类型，例如是否是类固醇或降钙素，治疗的条件，是否作为医疗或预防性的治疗，食物疗法等等而变化。
根据前述的本发明进一步提供的方法为：
d）促进骨形成的方法，例如预防或治疗钙缺失，例如预防和治疗本文前述的任何具体症状或疾病，在需要上述治疗的患者中，该方法包括对所述患者给药有效量的a）本发明化合物和b）第二种药物，所述第二种药物是例如如前述指示的骨吸收抑制剂。
实施例20，29，37，49和50的化合物是优选的。
Figure 931164834_IMG14
Figure 931164834_IMG16

Claims (27)

1、一种具有PTH样活性的并含有至少一种修饰的以游离形式或盐的形式或配合物形式的PTH化合物，所说修饰或者为
(1).至少一个选自L-或D-α-氨基酸、C2-6烷氧基羰基和取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与该PTH化合物末端氨基相连的基团，和/或至少一个选自C2-6烷氧基羰基和取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与一个或多个PTH化合物侧链氨基相连的基团，
或者为
(2).在天然产生的PTH序列的1到38位中的至少一个α-氨基酸单位以保护的形式随意地被天然或非天然的氨基酸单位置换或未置换，借此，存在于PTH序列氨基末端的1和2位中的氨基酸单位一起可被一种假肽所置换，
或者为一种这些修饰的组合，
先决条件：
当该PTH化合物从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸或从C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，C2-8炔基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，不为一种具有天然存在的α-氨基酸序列的PTH化合物；或者该PTH化合物不为这样的PTH(1-34)：其中
i.在1位的α-氨基酸为Gly，D-Ser，D-Ala或
Tyr；或
ii.在2位的α-氨基酸为Ala，D-Val，Lys，Arg或Cit且在34位的α-氨基酸为Tyr；或在2位的α-氨基酸为D-Val且在34位的α-氨基酸为D-Tyr和可选择地8位和18位α-氨基酸可以各自为Nle；或
iii.在3位和/或6位和或9位的α-氨基酸被天然或非天然氨基酸置换；或
iv.在23位的α-氨基酸被Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置换；或
v.在25位和/或26位和/或27位的α-氨基酸被Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置换；或
vi.在8位和18位的α-氨基酸各自为Nle或各自为Met(o)且在34位的α-氨基酸可以为Nle且在34位的α-氨基酸为Tyr和或有12位α-氨基酸为L或D-Pro，L-或D-Ala，Aib或NMeGly或者23位的α-氨基酸为Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或β-Nal；或
vii.在28位的α-氨基酸为Lys且在30位的α-氨基酸为Leu；或
viii.在1位的α氨基酸为Aib；和/或在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp；和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr；和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Nal，D-Ser，D-ser(丁基)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys  (Fmoc)，D-Phe或D-Asn；和/或在13位的α-氨基酸为Leu；和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His；种或在23位的α-氨基酸为2-(1，3-二硫羟烷-2-基)Trp；和/或在25位的和/或在26位的α-氨基酸为His；和/或在27位的α-氨基酸为Gln或Leu；或
ix.在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala或Ser，或在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp且在34位的α-氨基酸为Tyr；或
该PTH化合物不为PTH(1-84)，其中
i.在1位的α-氨基酸为Tyr，Val，Pro，Asp或Cys；或
ii.在2位的α-氨基酸为Ala，Glu，Leu，Ser或Arg；或
iii.在3位和/或6位和或9位的α-氨基酸被一种天然或非天然氨基酸置换；或
iv.在23位的α-氨基酸被Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置换；或
v.在25和或26和/或27位的α-氨基酸被Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置换；或
vi.在8位的α-氨基酸为Met，Met(o)，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly且在18位的α-氨基酸为Leu；或在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp，且在34位的α-氨基酸可以为Tyr；或在8位和18位的α-
氨基酸各自为Met(o)；或在8位的α-氨基酸为Leu且在18位的α-氨基酸为Met(o)；或
vii.在26位的α-氨基酸为Gln；
该化合物不为ProoPTH(1-84)或[Meto，Leu8，Leu18]PTH(1-84)；或
该化合物不为hPTH(1-36)，其中36位α-氨基酸为Leu。
2、一种如权利要求1的PTH化合物，含有至少一个在PTH序列下列位置之一中置换的氨基酸单位：1，2，3，8-11，13到19，21，22，29到34。
3、一种如权利要求1或2的PTH化合物，其中PTH序列氨基末端的1位和2位α-氨基酸单位被一种假二肽置换。
4、一种如权利要求3的式Ⅰ的PTH化合物
X-P1Ⅰ
其中
X为一种式（a）或（b）残基
Figure 931164834_IMG1
其中Z和Z′各自独立地为H;取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基;或一种保护基，Z和Z′的最多之一为一种保护基，
Z″为H，C1-8烷基或一种保护基
Y和Y″各自独立地为一种天然或非天然α-氨基酸保护或未保护的侧链，
Ya和Yb之一为氢而另一个为一种天然或非天然α-氨基酸保护或未保护的侧链或Ya和Yb和与他们相连的碳原子一起形成一个C3-6环烷基基团，
和
w为卤素或C1-4烷基
或w和Y′和与他们相连的
Figure 931164834_IMG2
部分一起，形成一个取代或未取代的芳族环或杂环残基，和
P1为一个PTH序列，其中N-末端的1和2位的氨基酸单位被删去。
5、一种如权利要求1或2的PTH化合物，其中PTH序列的N-末端的1位α-氨基酸单位和/或2位α-氨基酸单位被一个保护或未保护的天然或非天然氨基酸残基置换，
先决条件是：
当该PTH化合物从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸或从C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它不为一种具有天然存在的α-氨基酸序列的PTH化合物;
或该PTH化合物不为PTH（1-34），其中
ⅰ.在1位的α-氨基酸为Aib，Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr;或
ⅱ.在2位的α-氨基酸为Ala，D-Val，Lys，Git或Arg且在34位的α-氨基酸为Tyr;或在2位的α-氨基酸为D-Val且在34位的α-氨基酸为D-Tyr和第8位和18位α-氨基酸各自可以为Nle;或
ⅲ.在1位的α-氨基酸为Aib且至少一个另外的α-氨基酸单位已被按如下置换：在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁基），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在25位和/或26的位α-氨基酸为His，和/或在27位的α-氨基酸为Gln或Leu，
或该PTH化合物不为这样的PTH（1-84）：其中
ⅰ.在1位的α-氨基酸为Tyr，Val，Pro，Asp或Cys;或
ⅱ.在2位的α-氨基酸为Ala，Glu，Leu，Ser或Arg。
6、一种如权利要求5的式Ⅱ的PTH化合物
5- X1a-Y2a-P1Ⅱ
其中
Xla为一种被保护或未保护的天然α-氨基酸残基或一种式（Ⅱa）残基
Figure 931164834_IMG3
其中Za和Z′a各自独立地为H，C1-6烷基或一种保护基，Za和Za′至多之一为保护基，和或者n为1且
ⅰ.R1和R2各自独立地为C1-5烷基，或
ⅱ.R1和R2之一为甲基或乙基而另一个为一种保护或未保护的与天然α-氨基酸（Ala，Leu，Ile或Val除外）的α-碳原子相连的残基，或
ⅲ.R1和R2之一为氢、甲基或乙基而另一个为一种保护的或未保护的与非天然α-氨基酸的α-碳原子相连的残基，或
ⅳ.R1和R2和与他们相连的碳原子一起形成C3-6环烷基基团，或
ⅴ.
Figure 931164834_IMG4
残基代表一个随需可以与苯环缩合或不缩合的杂环残基，
或n为2，3，4或5且R1和R2各自为H或CH3，Yza为一种保护或未保护的天然α-氨基酸残基或一种式（Ⅱb）残基
Figure 931164834_IMG5
Zb为H或C1-6烷基且或者m为1而
ⅰ.R3和R4各自独立地为C1-6烷基，或
ⅱ.R3和R4之一为甲基或乙基而另一个为一个保护的或未保护的与天然α-氨基酸（Ala，Leu，Ile或Val除外）的α碳原子相连的残基，或
ⅲ.R3和R4之一为H，甲基或乙基而另一个为一个保护的或未保护的与非天然α-氨基酸的α碳原子相连的残基，或m为2，3，4，或5而R3和R4各自为H或CH3，和P1定义同权利要求4。
7、一种如前面任一权利要求的PTH化合物其中在8位的α-氨基酸单位和/或在18位的α-氨基酸单位被一种保护或未保护的天然或非天然氨基酸残基置换，先决条件是：
当该PTH化合物从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸或从C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它不为具有天然存在的α-氨基酸序列的PTH化合物;
或该PTH化合物不为这样的PTH（1-34）：其中
ⅰ.在8位和18位的α-氨基酸各为Nle或各自为Met（o）且随需地34位α-氨基酸可以是Tyr;或在8位和18位的α-氨基酸各为Nle且在34位的α-氨基酸为Tyr和或者在12位的α-氨基酸为L-或D-Pro，L-ak或D-Ala，Aib或NMeGly或者在23位的α-氨基酸为Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或β-Nal;或在8位和18位的α-氨基酸各为Nle且在2位的α-氨基酸为D-Val和在34位的α-氨基酸为D-Tyr;或
ⅱ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp且至少一个另一个α-氨基酸单位已被按如下置换或未置换：在1位的α-氨基酸为Aib和/或在11的位α-氨基酸为Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁酯），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位的和/或在21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His，和/或在27位的α-氨基酸为Glu或Leu;或
ⅲ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Ala或Ser;或在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu，且在34位的α-氨基酸为Tyr;或
该PTH化合物不为这样的PTH（1-84）：其中
在8位的α-氨基酸为Met，Met（o），Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly而在18位的α-氨基酸为Leu;或在8位和18位的α-氨基酸各自为Met（o）;或在8位的α-氨基酸为Leu且在18位的α-氨基酸为Met（o）;或
该PTH化合物不是[Leu18，Tyr34]hPTH（1-84），[Leu8，Tyr34]hPTH（1-84），[Ile8，Leu18，Tyr34]hPTH（1-84）或[Leu8，Leu18，Tyr34]hPTH（1-84）。
8、一种具有PTH活性的游离形式或盐的形式或配合物形式的PTH化合物其中PTH序列的1到38位中至少一个α-氨基酸单位被存在于PTHrp相应位中的α-氨基酸置换，该PTH化合物可以含有或不含有至少一个选自L-或D-α-氨基酸，C2-5烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物末端氨基相连的基团，和/或至少一个选自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与一个或多个PTH化合物的侧链相连的基团，
先决条件是：
当该PHT化合物从与N-末端相连的D-或L-α-氨基酸或从C2-6烷氧基羰基或取代或示取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基游离时，它不为一种具有天然存在的α-氨基酸列的PTH化合物;
或该PTH化合物不为这样的PTH（1-34）;其中
ⅰ.在8位和/或18位的α-氨基酸为Leu;和/或在H位的α-氨基酸为Lys;和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg;和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His;和/或在27位的α-氨基酸为Leu;且可以有或没有至少一个另外一个α-氨基酸单位已被如下置换：在1位的α-氨基酸为Aib和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁基），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Lys，Asn或His，和/或在23位的α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在27位的α-氨基酸为Gln;ak
ⅱ.在25位的α-氨基酸为Gln和/或在26位的α-氨基酸为Asn，在27位的α-氨基酸可能是或不是Leu;或该PTH化合物不为[Leu8，Leu18]PTH（1-84）。
9、一种具有PTH样活性的，以游离形式或盐形式或配合物形式的PTH化合物，其中PTH序列的8到11位中至少一个α-氨基酸单位被存在于PTHrp相应位置中的α-氨基酸置换，该PTH化合物可以含有或不含至少一个选自L-或D-α-氨基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物末端氨基相连的基团，和/或至少一个选自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与一个或多个PTH化合物侧链氨基相连的基团，条件是该PTH化合物不为这样的[Leu8，Leu18]-PTH（1-84）或PTH（1-34）：其中8位α-氨基酸为Leu和/或11位α-氨基酸为Lys且可随需至少一个进一步的α-氨基酸单位被如下置换或未置换：在1位的α-氨基酸单位为Aib，和/或在18位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁基），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Mer，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe，或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位和/或21位的α-氨基酸为Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His，和/或在27位的α-氨基酸为Gln或Leu。
10、一种具有PTH样活性的，以游离形式或盐的形式或配合物形式的PTH化合物，其中PTH序列的16到19位中至少一个α-氨基酸单位被存在于PTHrp相应位置中的α-氨基酸单位置换，该PTH化合物含有或不含至少一个选自L-或D-α-氨基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物末端氨基相连的基团，和/或至少一个选自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物的一个或多个侧链氨基相连的基团，先决条件是该PTH化合物不为这样的[Leu8，Leu18]-PTH（1-84）或PTH（1-34）：其中在18位的α-氨基酸为Leu和/或在19位的α-氨基酸为Arg且随需要至少一个另外一个α-氨基酸单位被如下置换或不置换：在1位的α-氨基酸单位为Ais，和/或在8位的α-氨基酸为Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-氨基酸为Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-氨基酸为D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser（丁基），D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys（Fmoc），D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-氨基酸为Leu，和/或在19位的α-氨基酸为Lys，Asn或Mis和/或在21位的α-氨基酸Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-氨基酸为2-（1，3-二硫羟烷-2-基）Trp，和/或在25位和/或26位的α-氨基酸为His，和/或在27位的α-氨基酸为Gln或Leu。
11、一种具有PTH样活性的，以游离形式或盐的形式或复合物形式的PTH化合物，其中PTH序列的33和34位中的至少一个α-氨基酸单位被存在在PTHrp相应位置中的α-氨基酸单位置换，该PTH化合物含有或不邻至少一个选自L-或D-α-氨基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物末端氨基相连的基团，和/或至少一个选自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物的一个或多个侧链氨基相连的基团。
12、一种如权利要求8到11的任一PTH化合物，其中在保留的1到38位中的一个或多个α-氨基酸进一步被一种天然或非天然氨基酸单位置换。
13、一种如权利要求12的PTH化合物，其中在10位的α-氨基酸选自Gly，Gln，Glu，His，Ser，Thr，Lys和Tyr，和/或在13位的α-氨基酸为一种除Arg外的D-或L-α-氨基酸，和/或在16位的α-氨基酸为一种D-或L-α-氨基酸，和/或在18位的α-氨基酸为Gln或Tyr，和/或在19位的α-氨基酸选自Ala，Arg，Val，Tyr，Ser，Lys，Met，His，Gly，Pro，Asn和Ile，和/或在33位的α-氨基酸为一种除Thr，Phe或Ala外的D-或L-α-氨基酸。
14、一种以游离形式或盐形式或配合物形式的，该化合物选自[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]PTH和[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，该PTH化合物随需可含有或不含有至少一个选自L-或D-α-氨基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物末端氨基相连的基团，和/或至少一个选自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6环烷基-C1-4烷基并与PTH化合物的一个或多个侧链氨基相连的基团。
15、一种如前任一权利要求的PTH化合物，该化合物为一种含有1-34到1-38个氨基酸单位的N-末端PTH片断。
16、一种如权利要求15的PTH化合物，该化合物为一种N-末端hPTH片断。
17、一种如前任一权利要求的PTH化合物，其中C末端为-COOH，酯化的-COOH，-CONH2，单或双取代的-CONH2
18、一种以游离形式或盐的形式或复合形式的PTH化合物，该PTH化合物选自
[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH（1-34）OH
[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]hPTH（1-36）OH
[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
[Len8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH
[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH（1-34）OH
[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]hPTH（1-36）OH，和
[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH（1-36）OH
19、一种生产所需中等大小多肽的方法，该方法包括将一种融合蛋白表达在细菌细胞中，该融合蛋白含有N-末端噬菌体T4基因的55多肽，并且具有与其C-末端相连的所需多肽。
20、一种如权利要求19的方法，其中融合蛋白含有一种在基因55与所需多肽之间的化学可裂解的链。
21、一种如权利要求20的方法，其中可裂解的链包括氨基酸序列Asp-Pro-Pro或Asn-Gly-Pro。
22、一种核苷酸序列，它编码一种融合蛋白，该蛋白含有N-末端噬菌体T4基因55多肽和与其C-末端相连的所需中等大小的多肽。
23、一种细菌表达载体，该载体含有一种如权利要求22的DNA序列。
24、用一种如权利要求22的DNA序列或一种如权利要求23细菌载体转化的细菌宿主细胞。
25、一种融合蛋白，它含有一种N-末端噬菌体T4基因55多肽和一种与其C-末端相连的所需的中等大小的多肽。
26、一种如权利要求20或21的方法，其中所需的中等大小的多肽含有一种PTH多肽。
27、一种药用组合物，它含有一种按权利要求1到18位一定义以游离形式或生理可接受的盐的形式的PTH化合物，与其一起的一种药用可接受的稀释剂或载体。
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