CN109971670A - 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用 - Google Patents

粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109971670A
CN109971670A CN201910104501.7A CN201910104501A CN109971670A CN 109971670 A CN109971670 A CN 109971670A CN 201910104501 A CN201910104501 A CN 201910104501A CN 109971670 A CN109971670 A CN 109971670A
Authority
CN
China
Prior art keywords
milk
erythromycin
tetracycline
working solution
standard
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910104501.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109971670B (zh
Inventor
杜季梅
刘佳明
楼永良
叶盛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN201910104501.7A priority Critical patent/CN109971670B/zh
Publication of CN109971670A publication Critical patent/CN109971670A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109971670B publication Critical patent/CN109971670B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2415/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving penicillins or cephalosporins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12088。并公开了其在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素的所用的培养基，并公开了具体的检测方法。本发明方法的筛检方法操作简单，可直接通过观察培养基凝固或指示剂变色判读结果，不需特殊精密仪器，可同时检测多种抗生素残留，适合食品中抗生素残留筛查，实用性强。

Description

粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用
技术领域
本发明属于于生命科学和食品安全领域，更具体的涉及一种粪肠球菌及利用该菌株快速检测牛奶中残留抗生素的方法。
背景技术
牛奶中抗生素残留是牛奶安全的一个重要问题。随着畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高。为预防和治疗***炎等疾病，抗生素类兽药在畜牧业的应用日益广泛，在应用抗生素治疗奶牛疾病在取得效果的同时，不规范使用抗生素，如加大使用剂量、延长治疗期，甚至给泌乳期奶牛长期应用抗生素预防疾病的行为，使得牛奶中往往残留有较高含量的抗生素。
我国许多乳制品不符合需进口国家和地区的要求，其中抗生素残留超标是重要限制因素。牛奶中抗生素残留不仅给牛奶生产及相关产业带来损失，同时也对消费者的身体健康带来诸多潜在的危害。随着人民生活水平的提高和对生物安全和食品安全的重视，抗生素残留已成为牛奶食品安全关注的重点。为适应国内外日益严格的食品质量要求，满足市场和进出口快速通关的需要，建立一种简单、快速、有效检测牛奶中多种抗生素残留的方法具有重要意义。
有关文献或方法中多种抗生素药物残留的检测方法基本上是对每一类药物进行分别检测，分析方法包括色谱法、色/质联用法、薄层色谱、免疫测定法和微生物抑制法等。我国常用磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共5大类33种兽药的药物，其化学分子结构和化学性质差异较大，不易同时检测。同时对牛奶中多种抗生素残留进行检测有一定困难，目前我国食品卫生标准(GB/T4789.27-2008)中规定的利用微生物学方法筛检牛奶中抗生素残留的检测方法有TTC法和嗜热脂肪杆菌芽孢抑制法。其中TTC法设备简单、费用低，适合大样本的筛选和基层实验室操作而被广泛使用，该法主要检测β内酰胺类的青霉素G，以及链霉素、庆大霉素和卡那霉素。另外，国标法的检测原理和结果判断根据嗜热链球菌的生长是否被残留抗生素抑制而得，由于加入样品后在37℃培养2小时，此条件下大部分环境中的细菌(如大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等触酶阳性的细菌)均可快速生长并引起TTC的颜色发生改变，操作过程中如出现污染则会导致出现假阴性结果。在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片法大致相等，但对链霉素不太敏感，对新霉素不敏感，消毒剂可干扰试验。
此外，目前我国采用的国标方法不包括对四环素、红霉素、万古霉素等的检测。四环素类抗生素可以预防和治疗传染病、提高饲料效率、加快动物的生长速度，在畜牧业中得到广泛应用。在奶牛的饲养过程中，四环素常用作饲料添加剂及防治奶牛的乳腺炎，从而导致牛奶中可能有四环素残留。红霉素属于大环内酯类抗生素，也被广泛用于畜、禽、水产养殖中，食品安全领域主要采用仪器法来分析动物源性食品中红霉素的残留量。万古霉素属于糖肽类抗生素，其分子中含有糖及肽链结构，可有效治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)引起的感染，特别是对牛乳腺炎等疾病有较好的疗效。目前日本规定牛奶中万古霉素的限量为10ug/kg,美国禁止在进口动物源性食品中使用糖肽类抗生素,我国农业部第560号公告规定万古霉素为禁用兽药。随着MRSA和MRSE的感染越来越常见，其他药物疗效甚微的情况下，万古霉素等糖肽类药物在奶牛疾病治疗上的的非法使用将不可避免。
微生物抑制法操作简便，仪器设备和人员要求均不高，样品前处理简单，检测时间短等特点，一直被用于大批量样品的过筛。本发明主要应用对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类敏感的益生菌，建立一种快速筛检和定量检测四环素、青霉素、庆大霉素、红霉素、万古霉素、氯霉素的微生物抑制法。
发明内容
1、发明目的。
本发明筛选出一株对抗生素敏感的粪肠球菌，并由此建立一种简单、快速、灵敏的以该菌株为工作菌株进行牛奶中抗生素残留检测的筛检方法。
2、本发明所采用的技术方案。
本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，于2016年2月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，保藏编号为12088。
本发明的粪肠球菌菌株具有以下微生物学特征：
(1)菌落形态：粪肠球菌CGMCC No.12088在TPY固体平板上的菌落直径1.2-1.5mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻；在LB固体培养基上的菌落直径5.0-12mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色或灰白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻，易乳化；
(2)菌体形态：革兰染色阳性球菌，菌体圆形或椭圆形，大多呈双或散在排列，无荚膜，无芽胞。
(3)生理生化特征：触酶阴性，发酵半乳糖、蔗糖、L-***糖，不发酵果糖、麦芽糖、木糖，不还原尿素，硝酸盐还原实验、靛基质实验阴性。
(4)培养特征：有氧、厌氧均生长良好。最适生长温度37℃-42℃，最低生长温度15℃，最高生长温度45℃；最适pH7.0-7.5，pH低于6.0或高于9.0生长不佳。
并公开了上述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的应用。
上述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素的培养基配方，其配方和配制步骤为：
配制配方1：蛋白胨30g，酵母提取物30g，牛肉浸膏10g，可溶性淀粉1.0g，葡萄糖40g，氯化钠10g，K2HPO4 6g，KH2PO4 6g，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至7.0-7.5，包装后121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用；
配制配方2：称取优质黄豆粉200g，溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮沸30分钟后，用多层纱布及定性滤纸过滤；
配制配方3：取150mL按配方2配制的滤液，加入50mL按配方1配制的液体，调节pH至7.0-7.2，121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用。
本发明还公开了一种牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素的检测方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将上述的粪肠球菌菌株接种于LB固体培养基，40℃-42℃培养18-24h；
(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的粪肠球菌单个菌落，用无菌生理盐水，调节OD600nm为0.10-0.12的菌悬液；吸取0.1ml菌悬液加入到按配方3配制的9.9ml培养基中，42℃培养过夜。过夜培养物可4℃保存。
(3)取过夜培养物，用无菌生理盐水配制成1:10的工作用菌悬液，临用新配；
(4)无抗奶制备：称取10g-12g无抗奶粉，用无菌蒸馏水配制成10％-12％的溶液；或用蒸馏水溶解后121℃高压灭菌15-30分钟，4℃保存，备用。
(5)标准管制备：取四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素标准储备液，用无抗奶稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；四环素300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的标准工作液；红霉素160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L；氨苄青霉素20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；庆大霉素800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；万古霉素400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的标准工作液；氯霉素400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用；
(5)样品准备：取样品10mL于无菌试管中，80℃水浴5-10分钟，5000rpm离心5分钟，弃沉淀；
(6)检测限的确定：分别取300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L四环素标准品的牛奶样品，160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的红霉素标准品的牛奶样品，400μL加有20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的青霉素标准品的牛奶样品，800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L庆大霉素标准品的牛奶样品，400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L万古霉素标准品的牛奶样品；400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L氯霉素标准品的牛奶样品；及0μg/L抗生素的牛奶样品为阴性生长对照，加入600uL配方3所得的培养基中，加入步骤3配制的菌液30μL，混匀后放入42℃培养3小时，取出直接观察凝固现象或加入0.02％甲基红指示剂观察颜色变化情况；
(7)样品检测：分别取400μL步骤(5)制备的待测样品和400μL无抗奶，同时取400μL含有100μg/L四环素标准品的牛奶样品，40μg/L的红霉素标准品的牛奶样品，4μg/L的青霉素标准品的牛奶样品，200μg/L庆大霉素标准品的牛奶样品,100μg/L万古霉素标准品的牛奶样品，80μg/L氯霉素标准品的牛奶样品；加入600uL配方3所得的培养基中；加入步骤(3)配制的菌液30μL；混匀后放入42℃培养3小时；取出以0μg/L为阴性(生长)对照，直接观察凝固现象或加入0.02％甲基红指示剂观察颜色变化情况；
本发明所述的牛奶样品包括：生乳、液态乳、复原乳。
本方法为筛选方法，与国标法的检测结果相符。
3、本发明所产生的技术效果。
(1)本发明粪肠球菌菌株具有以下特点：对四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素等多种抗生素敏感；42℃培养生长良好，具有较好的产酸能力，不易受杂菌污染；细菌生长可使所用自配液体培养基发生凝固，结果易于观察；菌株稳定性好，易于保存和操作；为益生菌，对人体和环境友好，不会造成实验室和环境污染。
(2)本发明方法的原理是基于抗生素对所用粪肠球菌具有抑制作用，利用此特性，将粪肠球菌菌株对样品进行发酵处理，跟踪发酵过程并根据发酵特点来判断样品中是否存在抗生素残留。
(3)本发明方法的筛检方法操作简单，可直接通过观察培养基凝固或指示剂变色判读结果，判断方法简便、准确，适合食品质量安全检查，实用性强。
附图说明
图1为粪肠球菌对四环素加标样品检测结果图。
图2为粪肠球菌对红霉素加标样品检测结果图。
图3为粪肠球菌对青霉素加标样品检测结果图。
图4为粪肠球菌对庆大霉素加标样品检测结果图。
图5为粪肠球菌对万古霉素加标样品检测结果图。
图6为粪肠球菌对氯霉素加标样品检测结果图。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是示例性性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1粪肠球菌菌株的分离与鉴定
以浙江省健康男青年的粪便作为分离样品，1g粪便用10mL PBS混悬稀释后，接种于TPY固体培养基，37℃、厌氧培养48小时，获得本发明所述的粪肠球菌，鉴定为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，已于2016年2月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12088。
TPY琼脂培养基、TPY液体培养基为青岛高科园海博生物技术有限公司产品。
本发明的粪肠球菌菌株具有以下微生物学特征：
(1)菌落形态：粪肠球菌在TPY固体平板上的菌落直径1.2-1.5mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻；
(2)菌体形态：革兰染色阳性球菌，菌体圆形或椭圆形，大多呈双或短链排列，无荚膜，无芽胞；菌落白色突起、边缘光滑整齐。
(3)生理生化特征：发酵半乳糖、蔗糖、L-***糖，不发酵果糖、麦芽糖、木糖，不还原尿素，硝酸盐还原实验、靛基质实验阴性。
(4)培养特征：有氧、厌氧均生长良好。最适生长温度37℃-42℃，最低生长温度20℃，最高生长温度45℃；最适pH7.0-7.5，pH低于5.5或高于8.5生长不良。
本发明的粪肠球菌对抗生素的敏感性试验
采用纸片琼脂扩散(K-B)法，选取不同的抗生素纸片，以本发明粪肠球菌为测试菌，用MH琼脂平板培养基，置37℃、厌氧培养24小时观察，测定不同抗生素对粪肠球菌菌株的抑菌性能。
上述试验做3次重复，参照CLSI标准判定。
表1菌株对不同抗生素的敏感性试验结果
说明本发明粪肠球菌四环素、红霉素、对β内酰胺类(氨苄青霉素、青霉素G、哌拉西林、头孢吡肟)、万古霉素、氯霉素敏感，可作为筛检牛奶中抗生素残留的工作菌株。
实施例2：牛奶样品中抗生素残留的检测
(1)菌株活化：将上述的粪肠球菌接种于LB固体培养基，40℃-42℃培养18-24h；
(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的粪肠球菌单个菌落，用无菌生理盐水，调节OD600为0.10-0.12的菌悬液；吸取0.1ml菌悬液加入到按配方3配制的9.9ml培养基中，42℃培养过夜。过夜培养物可4℃保存。
(3)取过夜培养物，用无菌生理盐水配制成1:10的工作用菌悬液，临用新配；
(4)标准管制备：取四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素和氯霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；四环素300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的标准工作液；红霉素160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；青霉素20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；庆大霉素800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；万古霉素400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的标准工作液；氯霉素400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用；
(5)样品准备：取样品10mL于无菌试管中，65℃水浴半小时；
(6)样品检测：选择300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的四环素标准品溶液，160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的红霉素标准品溶液，20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的青霉素标准品溶液，800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L庆大霉素标准品溶液，400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的万古霉素标准工作液；400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的氯霉素标准工作液；为快速筛检阳性对照管指示管，以0μg/L为阴性生长对照指示管，取步骤(5)所得的样品，按配方3所得的培养基中，混匀后加入42℃培养3小时，取出直接观察或加入0.02％甲基红指示剂后，对照阳性指示管和阴性指示管观察凝固结果。
试验1：检测限的确定
分别用不同浓度的抗生素(300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的四环素，160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的红霉素，20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的青霉素，800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L庆大霉素，400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L万古霉素；400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L氯霉素)标准品溶液和阴性对照(0μg/L)作为待测样品，进行样品检测，如图1-6所示。分析检测结果，确定本发明检测方法的定量检测的最低检测限为青霉素4μg/L，四环素5μg/L，红霉素90μg/L，庆大霉素400μg/L，万古霉素100μg/L，氯霉素80μg/L。
试验2：牛奶样品抗生素残留筛检试验
将含不同浓度的抗生素(300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的四环素，160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的红霉素，20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的青霉素，800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L庆大霉素，400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L万古霉素；400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L氯霉素)标准品溶液的牛奶作为待测样品(以0μg/L为阴性对照)，等体积加入到步骤(4)所得的筛检检测管中，加入步骤(2)所得的菌液，40℃、厌氧培养6小时；牛奶出现凝固或出现红色为抗生素残留低于国家标准，不凝固、呈黄色为抗生素残留超标。筛检法开始出现凝固和红色的最低浓度为四环素5μg/L、红霉素90μg/L、氨苄青霉素4μg/L、庆大霉素400μg/L、万古霉素100μg/L，氯霉素80μg/L。筛检试验结果与我国批准的动物性食品中最高残留限量(牛奶：氨苄青霉素4μg/L，红霉素40μg/L，四环素100μg/L)符合或相当，可满足大量样品的筛检，并可提示庆大霉素、万古霉素及氯霉素的存在。

Claims (4)

1.一种粪肠球菌，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12088。
2.权利要求1所述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的应用。
3.权利要求1所述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的培养基配方，其配制步骤为：
配制配方1：蛋白胨30g，酵母提取物30g，牛肉浸膏10g，可溶性淀粉1.0g，葡萄糖40g，氯化钠10g，K2HPO4 6g，KH2PO4 6g，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至7.0-7.5，包装后121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用；
配制配方2：称取优质黄豆粉200g，溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮沸30分钟后，用多层纱布及定性滤纸过滤；
配制配方3：取150mL按配方2配制的滤液，加入50mL按配方1配制的液体，调节pH至7.0-7.2，121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用。
4.一种牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的检测方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将权利要求1所述的粪肠球菌菌株接种于LB固体培养基，40℃-42℃培养18-24h；
(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的粪肠球菌单个菌落，用无菌生理盐水，调节OD600nm为0.10-0.12的菌悬液；吸取0.1ml菌悬液加入到按配方3配制的9.9ml培养基中，42℃培养过夜，过夜培养物置于4℃保存；
(3)取过夜培养物，用无菌生理盐水配制成1:10的工作用菌悬液，临用新配；
(4)标准管制备：取四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；四环素300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的标准工作液；红霉素160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；氨苄青霉素20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；庆大霉素800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；万古霉素400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的标准工作液；氯霉素400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用；
(5)样品准备：取样品原料乳10mL于无菌试管中，85℃水浴15-20分钟，5000rpm离心5分钟，弃上清；
(6)样品检测：选择300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的四环素，160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的红霉素，20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的青霉素标准品溶液，800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L庆大霉素标准品，400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的万古霉素标准工作液；400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的氯霉素标准工作液，溶液为快速筛检阳性对照管指示管，以0μg/L为阴性生长对照指示管，取步骤(5)所得的样品，按配方3所得的培养基中，混匀后放入42℃培养3小时，取出直接观察凝固现象，或加入0.02％甲基红指示剂观察颜色变化。
CN201910104501.7A 2019-02-01 2019-02-01 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用 Active CN109971670B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910104501.7A CN109971670B (zh) 2019-02-01 2019-02-01 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910104501.7A CN109971670B (zh) 2019-02-01 2019-02-01 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109971670A true CN109971670A (zh) 2019-07-05
CN109971670B CN109971670B (zh) 2023-01-24

Family

ID=67076878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910104501.7A Active CN109971670B (zh) 2019-02-01 2019-02-01 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109971670B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143671A (zh) * 2020-09-14 2020-12-29 温州医科大学 微小杆菌whx-1及其在处理生活污水的应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101275158A (zh) * 2007-11-05 2008-10-01 孙卫 优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用
CN101701203A (zh) * 2009-11-27 2010-05-05 南京农业大学 一株植物乳杆菌及其应用
CN102181513A (zh) * 2010-12-29 2011-09-14 国家海洋环境监测中心 利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法
CN102277325A (zh) * 2011-08-12 2011-12-14 北京金泰得生物科技股份有限公司 一株饲用粪肠球菌及其应用
CN102288586A (zh) * 2011-05-17 2011-12-21 首都医科大学附属北京友谊医院 测定药物最低抑菌浓度的方法
CN102286604A (zh) * 2011-06-25 2011-12-21 温州医学院 一种用于筛检食品中乐果残留的微生物方法
AU2013201247A1 (en) * 2005-11-30 2013-03-21 Massachusetts Institute Of Technology Pathogen detection biosensor
CN105713859A (zh) * 2016-03-02 2016-06-29 温州医科大学 短双歧杆菌及牛奶中多种抗生素残留的检测方法及应用
CN107260704A (zh) * 2017-06-08 2017-10-20 中国农业科学院饲料研究所 一种粪肠球菌微胶囊及其制备方法
CN107736379A (zh) * 2017-11-01 2018-02-27 广州市林业和园林科学研究院 解淀粉芽孢杆菌在防治植物真菌病害中的应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013201247A1 (en) * 2005-11-30 2013-03-21 Massachusetts Institute Of Technology Pathogen detection biosensor
CN101275158A (zh) * 2007-11-05 2008-10-01 孙卫 优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用
CN101701203A (zh) * 2009-11-27 2010-05-05 南京农业大学 一株植物乳杆菌及其应用
CN102181513A (zh) * 2010-12-29 2011-09-14 国家海洋环境监测中心 利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法
CN102288586A (zh) * 2011-05-17 2011-12-21 首都医科大学附属北京友谊医院 测定药物最低抑菌浓度的方法
CN102286604A (zh) * 2011-06-25 2011-12-21 温州医学院 一种用于筛检食品中乐果残留的微生物方法
CN102277325A (zh) * 2011-08-12 2011-12-14 北京金泰得生物科技股份有限公司 一株饲用粪肠球菌及其应用
CN105713859A (zh) * 2016-03-02 2016-06-29 温州医科大学 短双歧杆菌及牛奶中多种抗生素残留的检测方法及应用
CN107260704A (zh) * 2017-06-08 2017-10-20 中国农业科学院饲料研究所 一种粪肠球菌微胶囊及其制备方法
CN107736379A (zh) * 2017-11-01 2018-02-27 广州市林业和园林科学研究院 解淀粉芽孢杆菌在防治植物真菌病害中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143671A (zh) * 2020-09-14 2020-12-29 温州医科大学 微小杆菌whx-1及其在处理生活污水的应用
CN112143671B (zh) * 2020-09-14 2022-02-22 温州医科大学 微小杆菌whx-1及其在处理生活污水的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109971670B (zh) 2023-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105176874B (zh) 凝结芽孢杆菌fm603及其应用
CN109161498B (zh) 枯草芽孢杆菌m406及其在制备细菌素和纤维素酶中的应用
CN108541805A (zh) 一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法及发酵物及其应用
CN114085789B (zh) 戊糖片球菌ma.wtpqj01及其应用
CN113293118B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用
CN116024114B (zh) 一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用
CN101153316B (zh) 一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法
CN111019858A (zh) 一种抑制细菌生物膜形成的饲用地衣芽孢杆菌及其应用
CN114107137A (zh) 一种丁酸梭菌及其应用和产品
CN102286606A (zh) 克罗诺杆菌肉汤培养基及检测方法
CN109971670A (zh) 粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用
CN116410897A (zh) 一种弗格森埃希菌及其抑菌应用
CN115927040B (zh) 一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用
CN115181690B (zh) 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109988811A (zh) 一种微生物快速检测培养基及其制备方法和应用
CN109439725A (zh) 用于大肠杆菌鉴定的显色培养基及其应用
CN114874949A (zh) 一种丁酸梭菌、其发酵物、包含其的菌剂及动物饲料添加剂
CN110669693A (zh) 一种提高尼罗罗非鱼耐盐性能的嗜盐芽孢杆菌及其应用
KR20210076221A (ko) 페디오코커스 펜토사세우스 kcc-45 및 이를 포함하는 조성물
CN117070413B (zh) 一株副干酪乳杆菌by5及其应用
CN116496929B (zh) 一种猪源芽孢杆菌及其应用
JP5476054B2 (ja) セレウス菌グループ検出用培地
CN118240713A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在防治乳腺炎方面的应用
CN115678808A (zh) 地衣芽孢杆菌、菌剂及其应用
Heriyati et al. Susceptibility of Vibrio spp. from Gill of Barramundi (Lates calcarifer) Towards Antibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant