CN117624366A - 5t4纳米抗体及其应用 - Google Patents
5t4纳米抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117624366A CN117624366A CN202311368927.6A CN202311368927A CN117624366A CN 117624366 A CN117624366 A CN 117624366A CN 202311368927 A CN202311368927 A CN 202311368927A CN 117624366 A CN117624366 A CN 117624366A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nanobody
- antibody
- seq
- another preferred
- drug
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 70
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims abstract description 36
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 18
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 16
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 7
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 15
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 102100033579 Trophoblast glycoprotein Human genes 0.000 description 66
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- -1 cc1065 Chemical compound 0.000 description 10
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 9
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 8
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 6
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 5
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 208000032383 Soft tissue cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229940049706 benzodiazepine Drugs 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 4
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 4
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-(methylamino)butanoyl]amino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N 0.000 description 3
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000009849 Female Genital Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 3
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 208000021668 chronic eosinophilic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000022769 mixed phenotype acute leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 108010093470 monomethyl auristatin E Proteins 0.000 description 3
- 108010059074 monomethylauristatin F Proteins 0.000 description 3
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 208000031223 plasma cell leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- SVUOLADPCWQTTE-UHFFFAOYSA-N 1h-1,2-benzodiazepine Chemical compound N1N=CC=CC2=CC=CC=C12 SVUOLADPCWQTTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VVMAJDPAVPIJGJ-JZGIKJSDSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VVMAJDPAVPIJGJ-JZGIKJSDSA-N 0.000 description 2
- FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CCOC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 2
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930126263 Maytansine Natural products 0.000 description 2
- 102000004960 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Human genes 0.000 description 2
- 108020000284 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- 101710130607 Valacyclovir hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102100025139 Valacyclovir hydrolase Human genes 0.000 description 2
- 230000031712 Wnt receptor signaling pathway, planar cell polarity pathway Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 150000001557 benzodiazepines Chemical class 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000003034 chemosensitisation Effects 0.000 description 2
- 239000006114 chemosensitizer Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- UFNVPOGXISZXJD-XJPMSQCNSA-N eribulin Chemical compound C([C@H]1CC[C@@H]2O[C@@H]3[C@H]4O[C@H]5C[C@](O[C@H]4[C@H]2O1)(O[C@@H]53)CC[C@@H]1O[C@H](C(C1)=C)CC1)C(=O)C[C@@H]2[C@@H](OC)[C@@H](C[C@H](O)CN)O[C@H]2C[C@@H]2C(=C)[C@H](C)C[C@H]1O2 UFNVPOGXISZXJD-XJPMSQCNSA-N 0.000 description 2
- 229960003649 eribulin Drugs 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000004052 folic acid antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N maytansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@](OC(=O)N1)([C@H]([C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(C)=O)CC(=O)N1C)C)[H])\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007524 negative regulation of DNA replication Effects 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- LGNCNVVZCUVPOT-FUVGGWJZSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]-methylamino]-3-methoxy-5-methylheptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-3-methoxy-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LGNCNVVZCUVPOT-FUVGGWJZSA-N 0.000 description 1
- WOWDZACBATWTAU-FEFUEGSOSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanoyl]amino]-n-[(3r,4s,5s)-1-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1s,2r)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-n,3-dimethylbutanamide Chemical compound CC(C)[C@H](N(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)C1=CC=CC=C1 WOWDZACBATWTAU-FEFUEGSOSA-N 0.000 description 1
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- SRNFODIJXVPXHO-FSJWMSIRSA-N (4r,4ar,5'r,7r,8r,8as)-5'-(furan-3-yl)-4,7-dimethylspiro[1,3,4,4a,5,6,7,8a-octahydronaphthalene-8,3'-oxolane]-2,2'-dione Chemical compound C=1([C@H]2C[C@@]3(C(O2)=O)[C@H](C)CC[C@H]2[C@@H]3CC(=O)C[C@H]2C)C=COC=1 SRNFODIJXVPXHO-FSJWMSIRSA-N 0.000 description 1
- FSWYUDLVKBSHDX-UHFFFAOYSA-N 1,4,5,8-tetrahydronaphthalene Chemical compound C1C=CCC2=C1CC=CC2 FSWYUDLVKBSHDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSBMEQZETXZGTM-UHFFFAOYSA-N 1H-1,2-benzodiazepine 2,3-dihydro-1H-indole Chemical class N1N=CC=CC2=C1C=CC=C2.N2CCC1=CC=CC=C21 GSBMEQZETXZGTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGZKGOGODCLQHG-CYBMUJFWSA-N 5-[(2r)-2-hydroxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethyl]-2-methoxyphenol Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C[C@@H](O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 LGZKGOGODCLQHG-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- WJQDJDVDXAAXSB-UHFFFAOYSA-N 5-sulfanylidenepyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCC(=S)N1 WJQDJDVDXAAXSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101000669426 Aspergillus restrictus Ribonuclease mitogillin Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- SRNFODIJXVPXHO-UHFFFAOYSA-N Crotonin Natural products CC1CC(=O)CC2C1CCC(C)C2(C(O1)=O)CC1C=1C=COC=1 SRNFODIJXVPXHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012624 DNA alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 238000006736 Huisgen cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000002616 MRI contrast agent Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 101710190034 Trophoblast glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005262 alkoxyamine group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N calicheamicin Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](NCC)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@](C/3=C/CSSSC)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N 0.000 description 1
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 description 1
- 230000008777 canonical pathway Effects 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- LGZKGOGODCLQHG-UHFFFAOYSA-N combretastatin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1CC(O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 LGZKGOGODCLQHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N dolastatin Chemical compound CC(C)C(N(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)N(C)C(C(C)C)C(OC)CC(=O)N1CCCC1C(OC)C(C)C(=O)NC(C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930188854 dolastatin Natural products 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- VQNATVDKACXKTF-XELLLNAOSA-N duocarmycin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=C2NC(C(=O)N3C4=CC(=O)C5=C([C@@]64C[C@@H]6C3)C=C(N5)C(=O)OC)=CC2=C1 VQNATVDKACXKTF-XELLLNAOSA-N 0.000 description 1
- 229960005501 duocarmycin Drugs 0.000 description 1
- 229930184221 duocarmycin Natural products 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010028531 enomycin Proteins 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- ZVYVPGLRVWUPMP-FYSMJZIKSA-N exatecan Chemical compound C1C[C@H](N)C2=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC3=CC(F)=C(C)C1=C32 ZVYVPGLRVWUPMP-FYSMJZIKSA-N 0.000 description 1
- 229950009429 exatecan Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 description 1
- 150000008134 glucuronides Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IFOHPTVCEBWEEQ-UHFFFAOYSA-N pyrrolo[2,3-i][1,4]benzodiazepine Chemical class N1=CC=NC2=C3C=CN=C3C=CC2=C1 IFOHPTVCEBWEEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000003900 secondary neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003744 tubulin modulator Substances 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
本发明提供了靶向5T4的纳米抗体及其应用。具体地，本发明提供了抗5T4纳米抗体，以及所述抗5T4纳米抗体与抗血清白蛋白纳米抗体串联形成的长效抗5T4纳米抗体。进一步地，本发明的抗体可用于制备抗体‑药物偶联物，构建嵌合抗原受体以及表达嵌合抗原受体的工程化的免疫细胞。本发明的抗体、抗体‑药物偶联物以及工程化的免疫细胞可用于制备治疗和/或预防与5T4相关的疾病或病症，例如实体瘤和恶性血液病。
Description
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体地，涉及一种5T4纳米抗体及其应用。
背景技术
5T4是一种细胞外高度糖基化的I型单次跨膜蛋白，包含420个氨基酸。其又称滋养层糖蛋白，是一种快速内化的细胞表面抗原。5T4具有阻断经典Wnt/β-catenin通路和非经典Wnt信号通路的双重作用。Wnt信号通路在正常成熟的细胞中处于关闭状态，但在肿瘤细胞中活性增强，一方面5T4通过与LRP6的相互作用来抑制Wnt/β-catenin经典通路的激活传导；另一方面其又通过激活非经典Wnt信号通路来影响Wnt通路。在正常成人组织中，5T4仅在几种上皮细胞中有表达，如基底层复层鳞状上皮、腺体和导管上皮，以及视网膜次级神经元。然而5T4在多种癌细胞中(如子宫癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、***癌、肺癌或肾癌组织)都高表达。因此，该靶点被认为是理想的治疗靶点。
靶向5T4的药物开发已进入到临床研究阶段，包括治疗性疫苗、双抗、三抗、ADC、CAR-NK等类型。其中由Genmab开发的5T4/CD3双抗用于治疗膀胱癌、食管癌、非小细胞肺癌等正在进行II期临床研究。由Asana Bioscience LLC开发的ADC药物用于治疗多种实体瘤正在进行I期临床研究。此类药物已被报道具有良好的治疗前景。
纳米抗体是一类源自驼科和鲨鱼科动物体内的小分子抗体，其大小仅有常规单抗的十分之一，具有良好的稳定性和成药性。与此同时，纳米抗体结构简单，易于改造成多价或多功能抗体，还可利用各种细胞体系进行表达生产。因此，纳米抗体被认为是新一代抗体的新兴力量，具有广泛的应用前景。
基于现有技术，本发明制备获得了靶向5T4的纳米抗体，具有良好的功能活性和成药性，为后续不同类型药物的开发奠定良好的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向5T4的纳米抗体及其药物偶联物，以及所述抗体和其药物偶联物在疾病诊断和治疗中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗5T4纳米抗体的VHH链，所述VHH链包含选自下组的互补决定区CDR：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3；或
(3)SEQ ID NO:17所示的CDR1、SEQ ID NO:18所示的CDR2和SEQ ID NO:19所示的CDR3。
在另一优选例中，所述VHH链还包含框架区FR。
在另一优选例中，所述框架区FR包括骆驼源FR和人源FR。
在另一优选例中，所述框架区FR选自下组：
(1)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3和SEQ ID NO:7所示的FR4；
(2)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:13所示的FR2、SEQ ID NO:14所示的FR3和SEQ ID NO:7所示的FR4；或
(3)SEQ ID NO:20所示的FR1、SEQ ID NO:21所示的FR2、SEQ ID NO:22所示的FR3和SEQ ID NO:7所示的FR4。
在另一优选例中，所述框架区FR选自下组：
(1)SEQ ID NO:25所示的FR1、SEQ ID NO:26所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3和SEQ ID NO:27所示的FR4；
(2)SEQ ID NO:25所示的FR1、SEQ ID NO:30所示的FR2、SEQ ID NO:14所示的FR3和SEQ ID NO:27所示的FR4；或
(3)SEQ ID NO:33所示的FR1、SEQ ID NO:34所示的FR2、SEQ ID NO:22所示的FR3和SEQ ID NO:27所示的FR4。
在另一优选例中，所述抗5T4纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:8、15、23、28、31或38中任一项所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗5T4纳米抗体，所述纳米抗体具有如本发明第一方面所述的VHH链。
在另一优选例中，所述抗5T4纳米抗体包括骆驼源纳米抗体、嵌合纳米抗体或人源化纳米抗体。
在另一优选例中，所述抗5T4纳米抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
在另一优选例中，所述抗5T4纳米抗体包括一条或多条具有如SEQ ID NO:8、15、23、28、31或38所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明的第三方面，提供了一种抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：
A-L-B(Ia)；
B-L-A(Ib)；
其中，
A为如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体；
B为IgG的Fc片段；和
L为无或柔性接头。
在另一优选例中，所述柔性接头为肽接头。
在另一优选例中，所述肽接头具有1-50个氨基酸，较佳地1-20个氨基酸。
在另一优选例中，所述IgG的Fc片段包括人的IgG的Fc片段。
在另一优选例中，所述肽接头具有(GGGGS)n的结构，其中n为1-5的正整数。
在另一优选例中，所述IgG的Fc片段包括人的IgG的Fc片段。
在另一优选例中，所述IgG的Fc片段选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段、或其组合。
在另一优选例中，所述IgG的Fc片段为IgG4。
本发明的第四方面，提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、和/或如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白。
在另一优选例中，所述多特异抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体等。
本发明的第五方面，提供了一种抗5T4纳米抗体的长效抗体，所述长效抗体包含如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链或如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体，以及抗血清白蛋白纳米抗体部分。
在另一优选例中，所述长效抗体从N端到C端的结构如式IIa或IIb所示：
Ab1-P-Ab2(IIa)；
Ab2-P-Ab1(IIb)；
其中，
Ab1包含如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、或本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体；
Ab2为抗血清白蛋白纳米抗体；和
P为无或柔性接头。
在另一优选例中，所述血清白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)。
在另一优选例中，所述抗血清白蛋白纳米抗体选自：氨基酸序列如SEQ ID NO:55或56所示的抗血清白蛋白纳米抗体。
在另一优选例中，所述Ab1具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且Ab2具有如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Ab1具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且Ab2具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Ab1具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且Ab2具有如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Ab1具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且Ab2具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Ab1具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，且Ab2具有如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述Ab1具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，且Ab2具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述柔性接头为肽接头。
在另一优选例中，所述肽接头具有1-50个氨基酸，较佳地1-20个氨基酸。
在另一优选例中，所述肽接头具有(GGGGS)n的结构，其中n为1-5的正整数。
在另一优选例中，所述肽接头为(GGGGS)4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示。
在另一优选例中，所述长效抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:43、45、47、49、51或53任一项所示。
本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白：如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、或如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸包括DNA或RNA。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体，且具有如SEQ ID NO:9、16、24、29、32或36任一项所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体，且具有如SEQ ID NO:44、46、48、50、52或54任一项所示的核苷酸序列。
本发明的第七方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第六方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***、或其组合。
在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第七方面所述的表达载体，或基因组中整合有如本发明第六方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
在另一优选例中，所述原核细胞选自下组：大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。
在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。
在另一优选例中，所示真核细胞选自下组：草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞或COS细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为毕赤酵母。
本发明的第九方面，提供了一种产生抗5T4纳米抗体、或其Fc融合蛋白、或其长效抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合蛋白表达的条件下，培养如本发明第八方面述宿主细胞，从而获得含所述抗5T4纳米抗体、或其Fc融合蛋白、或其长效抗体的培养物；
(b)从所述培养物中分离或回收所述抗5T4纳米抗体、或其Fc融合蛋白、或其长效抗体；以及
(c)任选地，纯化和/或修饰得步骤(b)中获得的抗5T4纳米抗体、或其Fc融合蛋白、或其长效抗体。
本发明的第十方面，提供了一种抗体-药物偶联物，所述抗体-药物偶联物含有：
(a)选自下组的抗体部分：如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、或如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在另一优选例中，所述放射性核素包括：诊断用同位素和/或治疗用同位素。
在另一优选例中，所述药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
在另一优选例中，特别有用的细胞毒性药物的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物结构如式III所示：
Ab-(J-U)m (III)
式中，
Ab为抗5T4抗体，所述抗体选自下组：如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、或如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体；
U为药物；
J为化学键或连接子；
m为正整数；
“-”为化学键或接头。
在另一优选例中，所述药物连接于所述抗5T4抗体的重链恒定区或重链可变结构域的末端氨基或侧链氨基。
在另一优选例中，所述药物连接于所述抗5T4抗体的C末端氨基。
在另一优选例中，所述药物定点和/或随机地连接于所述抗5T4抗体(即式III中，所述U定点和/或随机地连接于Ab)。
在另一优选例中，所述U定点连接于Ab。
在另一优选例中，所述J为连接子，其包括，CC；(G)nC，其中n为0-4的整数；(A)nC，其中n为1-4的整数；(G)nCG，其中n为0-4的整数；(G)nSC，其中n为0-4的整数；(GGGGS)nC，其中n为0-4的整数；C(GGGGS)n，其中n为0-4的整数；(GGGS)nC，其中n为0-4的整数；C(GGGS)n，其中n为0-4的整数；(GGS)nC，其中n为0-4的整数、C(GGS)n，其中n为0-4的整数；GSCC；CDV；VDC；LPTEG；GGGGCGGGG；(G)nCA，其中n为0-4的整数；(A)nCA，其中n为1-4的整数；(G)nCGA，其中n为0-4的整数；GGGGCGGGGA；MPA-AEEA、Val-Cit-PABC、聚乙二醇PEG、或其组合。
在另一优选例中，所述连接子包括MPA-AEEA、MPA-AEEA-Val-Cit-PABC、或聚乙二醇PEG的衍生化合物，包括但不限于在其各自的基础上进行的一个或多个基团的替换、修饰或删除。
在另一优选例中，所述连接子为GSC与Val-Cit-PABC的组合。
在另一优选例中，所述m为1-10的正整数。
在另一优选例中，所述药物包括细胞毒性药物、免疫调节剂、酶和激素抑制剂。
在另一优选例中，所述药物包括单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、艾瑞布林(Eribulin)、依喜替康(exatecan)、美登素(maytansine)、SN-38等。
本发明的第十一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、或如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体。
本发明的第十二方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述细胞表面表达如本发明第十一方面所述的嵌合抗原受体。
在另一优选例中，所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物。
本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体、如本发明第十方面所述的抗体-药物偶联物、和/或如权利要求12所述的工程化的免疫细胞；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗与5T4相关的疾病或病症的药物。
在另一优选例中，所述与5T4相关的疾病或病症为实体瘤和恶性血液病。
在另一优选例中，所述实体瘤和恶性血液病高表达5T4。
在另一优选例中，所述实体瘤包括但不限于：肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、子宫癌、***癌、乳腺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、口腔癌、胆管癌、膀胱癌、骨及软组织癌、脑肿瘤、食道癌、肝癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、胃腺癌、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌。
在另一优选例中，所述恶性血液病包括但不限于：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、混合表型急性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症、浆细胞白血病。
本发明的第十四方面，提供了如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体、如本发明第十方面所述的抗体-药物偶联物、或如本发明第十二方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备：
(a)用于预防和/或治疗与5T4相关的疾病或病症的药物；
(b)用于检测5T4分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒。
在另一优选例中，所述与5T4相关的疾病或病症为实体瘤和恶性血液病。
在另一优选例中，所述实体瘤和恶性血液病高表达5T4。
在另一优选例中，所述实体瘤包括但不限于：肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、子宫癌、***癌、乳腺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、口腔癌、胆管癌、膀胱癌、骨及软组织癌、脑肿瘤、食道癌、肝癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、胃腺癌、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌。
在另一优选例中，所述恶性血液病包括但不限于：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、混合表型急性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症、浆细胞白血病。
在另一优选例中，所述检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测、ELISA检测。
在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。
本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中5T4蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体、如本发明第三方面所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、或如本发明第十方面所述抗体-药物偶联物接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在5T4蛋白。
在另一优选例中，所述方面为体外方法。
在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的方法。
本发明的第十六方面，提供了一种治疗与5T4相关的疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述VHH链、本发明第二方面所述抗5T4纳米抗体、本发明第三方面所述抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如本发明第四方面所述的多特异性抗体、如本发明第五方面所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体、如本发明第十方面所述的抗体-药物偶联物、或如本发明第十二方面所述的工程化的免疫细胞、或本发明第十三方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述对象包括哺乳动物，如人。
在另一优选例中，所述与5T4相关的疾病或病症为实体瘤和恶性血液病。
在另一优选例中，所述实体瘤和恶性血液病高表达5T4。
在另一优选例中，所述实体瘤包括但不限于：肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、子宫癌、***癌、乳腺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、口腔癌、胆管癌、膀胱癌、骨及软组织癌、脑肿瘤、食道癌、肝癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、胃腺癌、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了候选5T4纳米抗体与5T4蛋白的结合活性。ELISA结果表明，10个抗体的结合活性良好。
图2显示了候选5T4纳米抗体在A431细胞上的内吞活性。流式细胞术检测结果表明，3株5T4纳米抗体的内吞活性良好。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，首次意外地发现一类抗5T4纳米抗体。实验结果表明，本发明的抗5T4纳米抗体能够特异性识别5T4蛋白，具有良好的结合特异性和亲和力。同时，本发明的抗5T4纳米抗体具有良好的抗体内吞活性。使用本发明的抗5T4纳米抗体与抗血清白蛋白纳米抗体串联得到的长效抗5T4纳米抗体，可进一步与药物偶联形成抗体-药物偶联物，在体内外有效杀伤表达5T4的肿瘤细胞。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更好地理解本发明，定义了以下术语。
除非上下文另有明确说明，术语“约”包括在所述值的标准偏差范围内的值。
除非上下文另外清楚要求，否则在整个说明书和权利要求书中，应将词语“包含”、“具有”、“包括”等理解为具有包含意义，而不是排他性或穷举性意义；也即，“包括但不仅限于”的意义。除非另有说明，“包含”包括了“由……组成”。
根据本发明的“受试者”或“患者”是动物，包括需要抗癌治疗的人类患者。在某些方面，本发明还可以在兽医实践中应用于需要此类5T4靶向抗癌治疗的任何哺乳动物或其他动物。这可能包括，例如，非人灵长类动物，犬类，猫科动物，猪，马，以及任何其他针对5T4的抗癌治疗的动物。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的纳米抗体”、“本发明的抗5T4纳米抗体”、“本发明5T4纳米抗体”、“抗5T4纳米抗体”、“5T4纳米抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于5T4蛋白的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体(singledomain antibody,sdAb)”具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区(VHH)组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合5T4蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即抗体-药物偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有5T4结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))等。
抗5T4纳米抗体
本发明提供了多株抗5T4纳米抗体。经过大量的筛选，本发明提供了多株具有高结合亲和力的特异性抗5T4纳米抗体。进一步地，经人源化改造，提供了相应的人源化抗5T4纳米抗体。
在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ IDNO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3。在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3和SEQ ID NO:7所示的FR4；并且其VHH链具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:25所示的FR1、SEQ ID NO:26所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3和SEQ ID NO:27所示的FR4；并且其VHH链具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ IDNO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3。在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:13所示的FR2、SEQ ID NO:14所示的FR3和SEQ IDNO:7所示的FR4；并且其VHH链具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:25所示的FR1、SEQ ID NO:30所示的FR2、SEQ ID NO:14所示的FR3和SEQ ID NO:27所示的FR4；并且其VHH链具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:17所示的CDR1、SEQ IDNO:18所示的CDR2和SEQ ID NO:19所示的CDR3。在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:20所示的FR1、SEQ ID NO:21所示的FR2、SEQ ID NO:22所示的FR3和SEQ IDNO:7所示的FR4；并且其VHH链具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述抗5T4纳米抗体包含SEQ ID NO:33所示的FR1、SEQ ID NO:34所示的FR2、SEQ ID NO:22所示的FR3和SEQ ID NO:27所示的FR4；并且其VHH链具有如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
长效抗体
本发明还提供了一种抗5T4长效纳米抗体。如本文所用，术语“抗5T4长效纳米抗体”、“长效5T4纳米抗体”、“长效抗5T4纳米抗体”、“抗5T4纳米抗体的长效抗体”可以互换使用，均指本发明的抗5T4纳米抗体与抗血清白蛋白纳米抗体串联得到的长效抗体。
在本发明的实施方式中，所述长效抗体从N端到C端的结构如式IIa或IIb所示：
Ab1-P-Ab2(IIa)；
Ab2-P-Ab1(IIb)；
其中，
Ab1包含如本发明第一方面所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、或本发明第二方面所述的抗5T4纳米抗体；
Ab2为抗血清白蛋白纳米抗体；和
P为无或柔性接头。
在本发明的一个优选实施方式中，所述长效抗体从N端到C端的结构如式IIa所示，其中，Ab1为本发明所述的抗5T4纳米抗体，Ab2为抗血清白蛋白纳米抗体；优选地，所述Ab1具有SEQ ID NO:28、31或38任一项所示的氨基酸序列，Ab2具有如SEQ ID NO:55或56所示的氨基酸序列，P为肽接头，具有(GGGGS)n的结构，其中n为1-5的正整数。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体(包括本发明的纳米抗体和长效抗体)的抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)。
术语抗体-药物偶联物(ADC)，指单克隆抗体或者抗体片段通过连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。本公开所描述的抗体或抗体片段可以通过任何方式偶联至效应分子。举例来说，抗体或抗体片段可以通过化学或重组方式附接至毒性药物。制备融合物或偶联物的化学方式在本领域中是已知的。用于偶联抗体或抗体片段和药物的方法必须能够连接抗体与毒性药物而不会干扰抗体或抗体片段结合至标靶分子的能力。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物，如。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。
细胞毒性药物，即抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。细胞毒性药物包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化疗药物，抗生素和核溶酶。
本发明抗体与所述细胞毒性药物可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)可用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头(或称为连接子，linker)。术语“接头单元”或“连接片段”或“连接单元”是指一端与抗体或其抗原结合片段连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸；或三肽，例如甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸；或四肽，例如甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
在本发明中，药物-接头化合物可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物(或药物-连接子化合物(linker-drug，LD)，例如本发明所示的LD-1～LD-17)，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
载药量，也称药物抗体比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每个抗体所偶联的药物的平均数量。其可在例如每个抗体偶联约1至约10个药物的范围内，并且在某些实施例中，在每个抗体偶联约1至约8个药物的范围内，优选自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的范围。示例性的，载药量可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值。本披露的ADC通式包括与前述一定范围内的抗体药物偶联物的集合。在本披露的实施方式中，载药量可表示为n，是小数或整数。可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验和HPLC测定载药量。
本发明的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在抗体上。
可以用以下非限制性方法控制配体药物偶联物的载量，包括：
(1)控制药物连接子片段和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向5T4的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。例如，抗原结合结构域可以与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，单一Fv(scFv)片段，或单域抗体片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。在本发明中，所述抗原结合结构域包含特异性识别5T4的抗体，包括本发明所述的5T4纳米抗体、5T4长效纳米抗体、或靶向5T4的多特异性抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
工程化的免疫细胞
本发明的工程化的免疫细胞表达前述嵌合抗原受体，包括CAR-T细胞和CAR-NK细胞。
CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。
与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段、或其融合蛋白、或其抗体-药物偶联物、或表达抗原结合结构域含有所述抗体或其活性片段的嵌合抗原受体的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合5T42蛋白分子，因而可用于治疗5T42相关疾病，例如实体瘤和恶性血液病等。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
在本发明的一个实施方式中，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抗体或抗体-药物偶联物或工程化的免疫细胞施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测试剂的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测5T4水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别5T4蛋白的抗体(本发明所述的抗体)，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
检测方法
本发明还涉及检测5T4蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中5T4蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
应用
如上所述，本发明的单域抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与5T4相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对5T4的临床诊断和靶向治疗，如针对5T4高表达的实体瘤或恶性血液病(包括但不限于：肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、子宫癌、***癌、乳腺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、口腔癌、胆管癌、膀胱癌、骨及软组织癌、脑肿瘤、食道癌、肝癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、胃腺癌、胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、混合表型急性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症、浆细胞白血病等)的治疗和诊断。
本发明的序列信息：
Nb1-40(SEQ ID NO:8)
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGLTYCDSLMYWYRQGPGKEREFVSFIDRAGRTSYADSVQGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAMYYCKITCYNSGYQQWGQGTQVTVSS
Nb1-40(SEQ ID NO:9)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGTTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGACTTACCTACTGTGACTCCCTCATGTACTGGTATCGACAGGGGCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTCGTCTCATTTATTGATCGCGCTGGTAGGACTAGCTACGCAGACTCCGTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTACAAATGAACAACCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAAAATCACCTGCTACAATAGCGGCTATCAACAGTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
Nb2-26(SEQ ID NO:15)
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGLTYCSSLMSWYRQVPGKEREFVSFIDRLGRTSYDDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTATYYCKITCYDSGFQQWGQGTQVTVSS
Nb2-26(SEQ ID NO:16)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGACTTACCTACTGTAGCTCTCTCATGAGCTGGTATCGACAGGTTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTCGTCTCATTTATTGATCGGCTTGGTCGCACAAGCTACGACGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTACAAATGAACAACCTGAAACCTGAGGACACGGCCACGTATTACTGTAAAATCACGTGCTACGATAGCGGCTTTCAACAGTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
Nb10-59(SEQ ID NO:23)
QVQLQESGGGSVQAGGSLTLSCAASGYRGCKAIKTWYRQAPGKEREFVSFIDDDGRTSYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYRCKVDSTAGGTWCPYGKWGQGTQVTVSS
Nb10-59(SEQ ID NO:24)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGACACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATATCGTGGCTGTAAAGCCATCAAGACCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGCGAGTTCGTCTCATTTATTGATGATGATGGTAGAACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCACGTATCGCTGTAAAGTAGACTCTACCGCGGGTGGTACCTGGTGCCCCTACGGGAAATGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
HuNb1-40(SEQ ID NO:28)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCDSLMYWYRQGPGKGLEFVSFIDRAGRTSYADSVQGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAMYYCKITCYNSGYQQWGQGTLVTVSS
HuNb1-40(SEQ ID NO:29)
GAGGTTCAATTGTTGGAGTCTGGTGGTGGTTTGGTTCAGCCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTGACTTACTGTGACTCTTTGATGTACTGGTACAGACAAGGTCCAGGAAAGGGTTTGGAGTTCGTTTCTTTCATTGATAGAGCTGGTAGAACTTCTTACGCTGATTCTGTTCAAGGTAGATTCACTATCTCTCAAGATAACGCTAAGAACACCGTTTACTTGCAAATGAACAACTTGAAGCCAGAAGATACTGCTATGTACTACTGTAAGATTACTTGTTACAACTCTGGTTACCAACAATGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCT
HuNb2-26(SEQ ID NO:31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCSSLMSWYRQVPGKGLEFVSFIDRLGRTSYDDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTATYYCKITCYDSGFQQWGQGTLVTVSS
HuNb2-26(SEQ ID NO:32)
GAAGTTCAATTGTTGGAATCCGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTGACTTACTGTTCTTCTTTGATGTCTTGGTACAGACAAGTTCCAGGAAAGGGTTTGGAATTTGTTTCTTTTATTGATAGATTGGGTAGAACTTCTTACGATGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCTCAAGATAACGCTAAGAACACTGTTTACTTGCAAATGAACAACTTGAAGCCAGAAGATACTGCTACTTACTACTGTAAGATTACTTGTTACGATTCTGGTTTTCAACAATGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCT
HuNb10-59(SEQ ID NO:35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLTLSCAASGYRGCKAIKTWYRQAPGKGLEFVSFIDDDGRTSYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYRCKVDSTAGGTWCPYGKWGQGTLVTVSS
HuNb10-59(SEQ ID NO:36)
GAGGTTCAATTGTTGGAGTCTGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGACTTTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTTACAGAGGTTGTAAGGCTATTAAGACTTGGTACAGACAAGCTCCAGGTAAAGGTTTGGAGTTCGTTTCTTTCATTGATGATGATGGTAGAACTTCTTACGCTGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCTCAAGACAACGCTAAGAACACTGTTTACCTGCAAATGAACTCTTTGAAGCCTGAAGATACTGCTACTTACAGATGTAAGGTTGATTCTACCGCTGGTGGTACTTGGTGTCCATACGGAAAGTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCT
上述序列中，划线部分依次为抗体的CDR1、CDR2和CDR3；FR1、FR2、FR3和FR4被CDR分隔开。
HuNb1-40-GSC(SEQ ID NO:37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCDSLMYWYRQGPGKGLEFVSFIDRAGRTSYADSVQGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAMYYCKITCYNSGYQQWGQGTLVTVSSGSC
HuNb1-40-GSC(SEQ ID NO:38)
GAGGTTCAATTGTTGGAGTCTGGTGGTGGTTTGGTTCAGCCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTGACTTACTGTGACTCTTTGATGTACTGGTACAGACAAGGTCCAGGAAAGGGTTTGGAGTTCGTTTCTTTCATTGATAGAGCTGGTAGAACTTCTTACGCTGATTCTGTTCAAGGTAGATTCACTATCTCTCAAGATAACGCTAAGAACACCGTTTACTTGCAAATGAACAACTTGAAGCCAGAAGATACTGCTATGTACTACTGTAAGATTACTTGTTACAACTCTGGTTACCAACAATGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCCGGTTCTTGT
HuNb2-26-GSC(SEQ ID NO:39)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCSSLMSWYRQVPGKGLEFVSFIDRLGRTSYDDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTATYYCKITCYDSGFQQWGQGTLVTVSSGSC
HuNb2-26-GSC(SEQ ID NO:40)
GAAGTTCAATTGTTGGAATCCGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTGACTTACTGTTCTTCTTTGATGTCTTGGTACAGACAAGTTCCAGGAAAGGGTTTGGAATTTGTTTCTTTTATTGATAGATTGGGTAGAACTTCTTACGATGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCTCAAGATAACGCTAAGAACACTGTTTACTTGCAAATGAACAACTTGAAGCCAGAAGATACTGCTACTTACTACTGTAAGATTACTTGTTACGATTCTGGTTTTCAACAATGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCTGGTTCTTGT
HuNb10-59-GSC(SEQ ID NO:41)
EVQLLESGGGLVQPGGSLTLSCAASGYRGCKAIKTWYRQAPGKGLEFVSFIDDDGRTSYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYRCKVDSTAGGTWCPYGKWGQGTLVTVSSGSC
HuNb10-59-GSC(SEQ ID NO:42)
GAGGTTCAATTGTTGGAGTCTGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGACTTTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTTACAGAGGTTGTAAGGCTATTAAGACTTGGTACAGACAAGCTCCAGGTAAAGGTTTGGAGTTCGTTTCTTTCATTGATGATGATGGTAGAACTTCTTACGCTGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCTCAAGACAACGCTAAGAACACTGTTTACCTGCAAATGAACTCTTTGAAGCCTGAAGATACTGCTACTTACAGATGTAAGGTTGATTCTACCGCTGGTGGTACTTGGTGTCCATACGGAAAGTGGGGTCAAGGTACTTTGGTTACTGTTTCTTCTGGTTCTTGT
HuNb1-40-HSA Nb3-11-GSC(SEQ ID NO:43)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCDSLMYWYRQGPGKGLEFVSFIDRAGRTSYADSVQGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAMYYCKITCYNSGYQQWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGGGLVEPGGSLRLSCVASGFTFQHYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISLVGGGTSYADSVKGRFTMSRDNAKNTLYLQLNSLKSEDTAMYYCVRGWHPDVPRPLGQGTLVTVSSGSC
HuNb1-40-HSA Nb3-11-GSC(SEQ ID NO:44)
GAGGTGCAGCTCCTCGAATCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCCGGCGGATCTCTGAGGCTCTCCTGTGCTGCTTCCGGACTGACATACTGTGACTCCCTCATGTACTGGTATAGGCAGGGACCTGGGAAAGGCCTCGAATTTGTTAGTTTTATCGACAGGGCAGGCCGAACCTCCTACGCAGACAGTGTGCAGGGTCGGTTTACAATTTCACAGGACAATGCCAAGAATACTGTTTACCTGCAGATGAACAACTTGAAACCCGAGGATACTGCAATGTATTATTGCAAAATCACCTGCTACAATAGCGGATATCAGCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTTACTGTCTCCTCTGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGTGGAGGATCAGGGGGTGGAGGTTCAGGAGGCGGGGGAAGTGAAGTTCAGCTGCAGGAATCAGGAGGGGGGTTGGTCGAACCCGGGGGGAGTCTCCGGTTGAGTTGTGTTGCATCCGGGTTCACTTTCCAGCATTACGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCTTGGAATGGGTGTCTAGTATCTCTCTCGTGGGTGGCGGTACCTCATACGCTGACTCAGTGAAAGGTCGGTTCACTATGTCTCGCGACAATGCTAAGAATACTCTGTATCTCCAGCTGAATAGCCTGAAAAGCGAGGACACAGCCATGTACTACTGCGTCCGAGGATGGCACCCTGATGTGCCCCGACCTCTCGGGCAGGGGACCTTGGTCACAGTCTCATCCGGAAGTTGC
HuNb2-26-HSA Nb3-11-GSC(SEQ ID NO:45)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCSSLMSWYRQVPGKGLEFVSFIDRLGRTSYDDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTATYYCKITCYDSGFQQWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGGGLVEPGGSLRLSCVASGFTFQHYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISLVGGGTSYADSVKGRFTMSRDNAKNTLYLQLNSLKSEDTAMYYCVRGWHPDVPRPLGQGTLVTVSSGSC
HuNb2-26-HSA Nb3-11-GSC(SEQ ID NO:46)
GAAGTCCAGCTCCTCGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTCAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCCTGACATATTGTAGCAGCCTGATGAGCTGGTATAGGCAGGTGCCCGGGAAAGGACTGGAATTTGTCTCCTTCATCGACCGTCTCGGCAGAACTTCTTACGACGACTCCGTCAAAGGAAGATTCACCATTTCCCAGGACAACGCTAAGAACACAGTGTACCTGCAGATGAATAACCTCAAACCAGAGGATACAGCTACTTACTACTGCAAAATCACTTGCTATGACAGTGGTTTCCAGCAGTGGGGACAGGGTACCCTCGTGACCGTTTCATCCGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGTGGAGGATCAGGGGGTGGAGGTTCAGGAGGCGGGGGAAGTGAGGTCCAGTTGCAGGAGAGCGGGGGTGGACTGGTGGAGCCAGGGGGAAGTTTGAGACTCAGTTGTGTTGCCAGCGGTTTCACATTTCAGCATTACGCCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGACTGGAGTGGGTTAGCAGCATTTCTCTCGTCGGAGGGGGTACAAGCTATGCCGATTCAGTGAAGGGGCGTTTCACTATGTCCAGAGACAACGCAAAGAACACCTTGTACTTGCAGCTGAACTCCCTCAAAAGTGAGGACACAGCTATGTACTACTGCGTCCGGGGTTGGCACCCAGACGTTCCCAGGCCACTGGGGCAGGGAACATTGGTGACCGTGTCATCTGGCTCCTGT
HuNb10-59-HSA Nb3-11-GSC(SEQ ID NO:47)
EVQLLESGGGLVQPGGSLTLSCAASGYRGCKAIKTWYRQAPGKGLEFVSFIDDDGRTSYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYRCKVDSTAGGTWCPYGKWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGGGLVEPGGSLRLSCVASGFTFQHYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISLVGGGTSYADSVKGRFTMSRDNAKNTLYLQLNSLKSEDTAMYYCVRGWHPDVPRPLGQGTLVTVSSGSC
HuNb10-59-HSA Nb3-11-GSC(SEQ ID NO:48)
GAGGTCCAGCTCCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCTGGCGGAAGCCTGACACTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACCGGGGATGTAAAGCTATCAAGACCTGGTACAGGCAGGCCCCTGGAAAAGGCCTGGAATTTGTGTCTTTCATTGACGATGACGGCCGCACCAGCTATGCAGACTCCGTGAAAGGTAGATTTACTATTTCTCAGGACAACGCTAAGAACACTGTGTATCTGCAGATGAATAGTCTCAAACCTGAGGACACTGCAACTTATAGATGTAAGGTGGACAGCACTGCCGGCGGAACTTGGTGTCCATACGGAAAATGGGGACAGGGTACCCTGGTCACAGTGTCATCAGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGTGGAGGATCAGGGGGTGGAGGTTCAGGAGGCGGGGGAAGTGAGGTGCAGTTGCAGGAGTCCGGTGGTGGCTTGGTTGAGCCCGGAGGCAGTTTGCGTTTGTCCTGCGTCGCCTCTGGCTTCACCTTTCAGCATTATGCTATGAGTTGGGTGCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGTTGGAATGGGTTAGTTCAATTTCTCTCGTGGGTGGCGGGACTAGCTATGCCGATTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATGTCACGCGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTCCAGCTCAATAGCCTGAAGAGCGAAGATACCGCTATGTACTACTGCGTCCGCGGCTGGCACCCTGACGTGCCCAGGCCATTGGGCCAGGGGACATTGGTGACCGTTAGCAGCGGTAGCTGT
HuNb1-40-HSA Nb1-60-GSC(SEQ ID NO:49)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCDSLMYWYRQGPGKGLEFVSFIDRAGRTSYADSVQGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAMYYCKITCYNSGYQQWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVSAINSSGGYTRYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDSGDGKRYWSGEYFYRSRGQGTLVTVSSGSC
HuNb1-40-HSA Nb1-60-GSC(SEQ ID NO:50)
GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGCGGCCTGGTCCAGCCTGGAGGCAGCCTCCGGCTGTCCTGTGCCGCTTCTGGACTCACATACTGTGACAGCCTCATGTACTGGTATCGGCAGGGACCCGGTAAAGGACTGGAATTTGTCAGTTTTATCGACCGAGCAGGGCGCACATCTTACGCAGATAGTGTGCAGGGTCGCTTTACCATCAGTCAGGATAATGCAAAGAACACTGTGTATCTCCAGATGAACAATCTGAAGCCTGAAGATACCGCTATGTATTACTGCAAAATTACTTGTTATAACTCAGGATACCAGCAGTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACTGTTTCTAGCGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGTGGAGGATCAGGGGGTGGAGGTTCAGGAGGCGGGGGAAGTGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGAGGATTGGTTCAGCCTGGTGGGTCCCTGCGTTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTAGATTCTCATCATACTGGATGTATTGGGTGCGCCAGGCACCCGGTAAGGGCCTCGAATGGGTTAGTGCTATTAATTCAAGTGGCGGTTATACCCGGTATGCTGATTCAGTCAAGGGGCGGTTTACTATTTCTCGCGACAACGCTAAGAATACTTTGTACTTGCAGATGAATAGCCTGCGGGCAGAGGATACTGCAGTCTACTACTGTGCCACTGATAGTGGGGATGGTAAGCGTTATTGGTCTGGCGAATATTTTTACCGGTCCAGAGGTCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCAAGTGGCAGTTGC
HuNb2-26-HSA Nb1-60-GSC(SEQ ID NO:51)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYCSSLMSWYRQVPGKGLEFVSFIDRLGRTSYDDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTATYYCKITCYDSGFQQWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVSAINSSGGYTRYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDSGDGKRYWSGEYFYRSRGQGTLVTVSSGSC
HuNb2-26-HSA Nb1-60-GSC(SEQ ID NO:52)
GAGGTCCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGATCTCTGAGGCTGAGCTGCGCTGCCTCCGGCCTGACCTATTGTTCCAGCCTGATGTCCTGGTACCGGCAGGTCCCAGGCAAAGGTTTGGAGTTCGTTTCCTTTATCGATCGGCTGGGTCGAACATCCTACGATGATAGTGTTAAGGGCAGGTTTACTATTTCCCAGGATAACGCTAAGAATACCGTGTACTTGCAGATGAATAATCTCAAACCAGAGGACACAGCTACTTACTACTGCAAAATCACATGTTATGATAGCGGTTTCCAGCAGTGGGGTCAGGGCACACTCGTTACCGTTTCAAGCGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGTGGAGGATCAGGGGGTGGAGGTTCAGGAGGCGGGGGAAGTGAGGTTCAGCTGCAGGAATCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCTGGGGGGAGTCTGCGCCTGTCTTGTGCTGCTTCCGGCTTCCGTTTCTCATCCTACTGGATGTATTGGGTGAGACAGGCACCTGGAAAGGGGTTGGAATGGGTTAGTGCAATCAATTCCTCAGGGGGGTACACTAGGTACGCTGATTCTGTCAAAGGTCGGTTTACAATTAGCAGAGACAATGCTAAGAACACTCTCTATCTCCAGATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCACTGACTCCGGAGACGGAAAACGATATTGGAGCGGAGAATACTTTTACCGCTCCAGGGGACAGGGTACACTCGTGACAGTGTCTAGCGGCTCTTGT
HuNb10-59-HSA Nb1-60-GSC(SEQ ID NO:53)
EVQLLESGGGLVQPGGSLTLSCAASGYRGCKAIKTWYRQAPGKGLEFVSFIDDDGRTSYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYRCKVDSTAGGTWCPYGKWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVSAINSSGGYTRYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDSGDGKRYWSGEYFYRSRGQGTLVTVSSGSC
HuNb10-59-HSA Nb1-60-GSC(SEQ ID NO:54)
GAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGAGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCTCCCTCACCCTGTCCTGCGCCGCTTCTGGCTATCGGGGCTGCAAAGCCATTAAAACATGGTACAGGCAGGCCCCCGGAAAAGGGCTCGAATTTGTTTCCTTTATTGACGACGATGGTCGTACCTCCTATGCCGACAGTGTCAAGGGTCGTTTTACAATCAGTCAGGACAATGCAAAGAATACAGTCTACCTCCAGATGAATAGCCTGAAGCCAGAAGATACAGCTACATACCGCTGCAAGGTTGACAGTACAGCCGGGGGTACATGGTGTCCTTACGGTAAATGGGGGCAGGGAACCTTGGTGACCGTCAGCTCCGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGTGGAGGATCAGGGGGTGGAGGTTCAGGAGGCGGGGGAAGTGAGGTTCAGCTGCAGGAAAGCGGTGGGGGCCTCGTTCAGCCCGGAGGATCTTTGAGACTGAGTTGCGCAGCCAGTGGGTTTAGATTCTCTTCATATTGGATGTACTGGGTGCGGCAGGCACCCGGAAAGGGGTTGGAATGGGTGTCAGCAATTAACTCAAGCGGAGGTTATACAAGATACGCAGATAGTGTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCAGGGACAATGCCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGTTTGCGTGCCGAGGACACTGCTGTTTATTATTGCGCAACTGACTCTGGGGACGGTAAGCGCTATTGGTCCGGCGAGTATTTTTACCGCTCACGGGGCCAGGGAACACTCGTGACTGTGTCTAGTGGAAGTTGC
HSA Nb1-60(SEQ ID NO:55)
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVSAINSSGGYTRYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATDSGDGKRYWSGEYFYRSRGQGTLVTVSS
HSA Nb3-11(SEQ ID NO:56)
EVQLQESGGGLVEPGGSLRLSCVASGFTFQHYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISLVGGGTSYADSVKGRFTMSRDNAKNTLYLQLNSLKSEDTAMYYCVRGWHPDVPRPLGQGTLVTVSS
连接肽(SEQ ID NO:57)：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
5T4胞外段蛋白(SEQ ID NO:58)
SSPTSSASSFSSSAPFLASAVSAQPPLPDQCPALCECSEAARTVKCVNRNLTEVPTDLPAYVRNLFLTGNQLAVLPAGAFARRPPLAELAALNLSGSRLDEVRAGAFEHLPSLRQLDLSHNPLADLSPFAFSGSNASVSAPSPLVELILNHIVPPEDERQNRSFEGMVVAALLAGRALQGLRRLELASNHFLYLPRDVLAQLPSLRHLDLSNNSLVSLTYVSFRNLTHLESLHLEDNALKVLHNGTLAELQGLPHIRVFLDNNPWVCDCHMADMVTWLKETEVVQGKDRLTCAYPEKMRNRVLLELNSADLDCDPILPPSLQTS
5T4纳米抗体及其长效抗体序列信息汇总：
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的抗5T4纳米抗体具有优异的抗原结合活性，以及良好的内吞活性。
(2)本发明的抗5T4纳米抗体在宿主细胞中表达产量高，纯化后的纯度高，质量均一性好，利于成药。
(3)本发明的抗5T4纳米抗体经改造引入游离的半胱氨酸，用于定点偶联其他物质，包括linker连接的小分子药物和同位素等，用于影像产品及核药的开发。
(4)本发明的抗5T4纳米抗体可用于构建抗体-药物偶联物，并且可与抗血清白蛋白纳米抗体串联形成长效抗体，进而用于构建长效抗体-药物偶联物。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-ALaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：5T4纳米抗体的筛选
将高纯度的5T4胞外段蛋白(SEQ ID NO:58)免疫2只新疆双峰驼，经7次免疫后取骆驼外周血并从中分离PBMC，随后从中提取RNA并反转录成cDNA。又经巢式PCR获得VHH基因片段并将其克隆至噬菌体载体构建成噬菌体展示文库。经鉴定，两个文库的库容均达到5×109CFU，片段***率在90％以上。随后，利用噬菌体展示技术淘选抗原特异性的纳米抗体，经4轮淘选后得到10倍以上的特异性噬菌体富集。从中随机挑选克隆进行PE-ELISA鉴定，将阳性克隆测序最终获得11个不同家族的抗体。
实施例2：5T4纳米抗体的结合活性测定
将以上11个家族的抗体用E.coli细胞进行表达并用镍柱纯化，随后利用ELISA鉴定候选抗体的结合活性。
将人5T4胞外段蛋白包被96孔酶标板于37℃包被2小时；PBST洗涤后加入BSA封闭液37℃封2小时；PBST洗涤后再加入梯度稀释的待测5T4纳米抗体在37℃孵育1小时；PBST洗涤后加入稀释的生物素化的anti-his抗体孵育，随后再加入稀释的SA-HRP；PBST洗涤后加入显色液及终止液，酶标仪检测吸光值。
结果如图1所示，10个候选纳米抗体能有效结合5T4蛋白。
实施例3：5T4纳米抗体的细胞结合活性测定
利用流式细胞术检测3株ELISA结合活性较优的5T4纳米抗体(Nb1-40、Nb2-26和Nb10-59)与不同5T4高表达细胞株A431、BxPC3、A549的结合活性。
将培养的A431、BxPC3、A54细胞分别与稀释好的待测抗体于4℃孵育40min。PBS洗涤细胞后加入APC anti-HA antibody于4℃孵育40min，离心后洗涤细胞除去上清，PBS重悬细胞后流式细胞仪检测每个样品APC信号。结果如表1所示，3株候选纳米抗体与不同类型肿瘤细胞均具有良好的结合活性。
表1 5T4纳米抗体的细胞结合活性
实施例4：5T4纳米抗体的内吞活性测定
收集培养好的A431细胞计数后分装细胞至U型板；将稀释好的5T4纳米抗体加入细胞中于4℃孵育30分钟；PBS洗涤细胞后加入APC anti-HA antibody于4℃孵育30min；洗涤细胞后加入含1％FBS的培养基到未内吞(0h)实验组和内吞最大量(0h)实验组，将细胞重悬后放置于4℃；同时加入含1％FBS的培养基到内吞(0.5h、1h和2h)实验组，置于37℃CO2培养箱；分别在0.5h、1h和2h取出相应样品置于4℃冰箱；最后统一离心去上清，加入Strippingbuffer于4℃孵育。洗涤细胞后加入PBS重悬细胞，流式细胞仪检测每个样品APC信号。
结果如图2所示，三株5T4纳米抗体(Nb1-40、Nb2-26和Nb10-59)均具有良好的内吞活性。
实施例5：人源化5T4纳米抗体的设计和表达
将以上三株5T4纳米抗体(Nb1-40、Nb2-26和Nb10-59)进行人源化设计，保持CDR区不变，仅对候选抗体的骨架区进行人源化改造。改造后的抗体序列如下表2所示。
随后利用毕赤酵母表达人源化纳米抗体，评估其表达和发酵产量。
具体地，将人源化纳米抗体氨基酸序列按照毕赤酵母密码子优化的碱基序列克隆至pPICZaA载体上。再将线性化的质粒电转化至X-33感受态细胞中，于含有博来霉素抗性的YPD培养板中培养3天。挑取单克隆诱导培养3天，经SDS-PAGE胶图检测抗体的表达情况并评估其7L发酵罐产量。结果可见，3株人源化5T4纳米抗体在酵母细胞中均具有良好的表达产量。
表2人源化纳米抗体在毕赤酵母中的表达量
将以上人源化后的抗体进行结合活性鉴定。利用ELISA检测候选抗体与5T4胞外段蛋白的结合活性。简要地，将5T4蛋白包被酶标板过夜，待封闭液封闭后加入梯度稀释的人源化抗体孵育1小时；洗涤后加入羊抗VHH抗体孵育1小时；再次洗涤后加入HRP标记的鼠抗羊抗体孵育1小时，最后加入终止液并于酶标仪中读取OD450吸光值，结果如下表3所示。结果表明，人源化后的纳米抗体均保持了良好的抗原结合活性。
表3人源化抗体的结合活性
实施例6：长效5T4纳米抗体的设计和表达
设计不同结构的长效抗体并利用毕赤酵母表达，评估其表达和发酵产量。
具体地，将不同结构的长效抗体氨基酸序列按照毕赤酵母密码子优化的碱基序列克隆至pPICZaA载体上。再将线性化的质粒电转化至X-33感受态细胞中，于含有博来霉素抗性的YPD培养板中培养3天。挑取单克隆诱导培养3天，经SDS-PAGE检测抗体的表达情况并评估其7L发酵罐产量。
表4长效纳米抗体在毕赤酵母中的表达量
结果可见，构建的长效5T4纳米抗体在酵母细胞中均具有良好的表达产量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗5T4纳米抗体的VHH链，其特征在于，所述VHH链包含选自下组的互补决定区CDR：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3；或
(3)SEQ ID NO:17所示的CDR1、SEQ ID NO:18所示的CDR2和SEQ ID NO:19所示的CDR3。
2.一种抗5T4纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如权利要求1所述的VHH链。
3.一种抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：
A-L-B(Ia)；
B-L-A(Ib)；
其中，
A为如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体；
B为IgG的Fc片段；和
L为无或柔性接头。
4.一种多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体包含如权利要求1所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体、和/或如本权利要求3所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白。
5.一种抗5T4纳米抗体的长效抗体，其特征在于，所述长效抗体包含如权利要求1所述的抗5T4纳米抗体的VHH链或如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体，以及抗血清白蛋白纳米抗体部分。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白：如权利要求1所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体、如本权利要求3所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如权利要求4所述的多特异性抗体、或如权利要求5所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体。
7.一种抗体-药物偶联物，所述抗体-药物偶联物含有：
(a)选自下组的抗体部分：如权利要求1所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体、如本权利要求3所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如权利要求4所述的多特异性抗体、或如权利要求5所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
8.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含权利要求1所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体、如权利要求4所述的多特异性抗体、或如权利要求5所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体。
9.一种工程化的免疫细胞，所述细胞表面表达如权利要求8所述的嵌合抗原受体。
10.一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)如权利要求1所述的抗5T4纳米抗体的VHH链、如权利要求2所述的抗5T4纳米抗体、如本权利要求3所述的抗5T4纳米抗体Fc融合蛋白、如权利要求4所述的多特异性抗体、如权利要求5所述的抗5T4纳米抗体的长效抗体、如权利要求7所述的抗体-药物偶联物、和/或如权利要求9所述的工程化的免疫细胞；以及
(ii)药学上可接受的载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311368927.6A CN117624366A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 5t4纳米抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311368927.6A CN117624366A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 5t4纳米抗体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117624366A true CN117624366A (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=90015361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311368927.6A Pending CN117624366A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 5t4纳米抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117624366A (zh) |
-
2023
- 2023-10-20 CN CN202311368927.6A patent/CN117624366A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20080090414A (ko) | 세포 표면 표적에 대한 결합 특이성이 있는 이중 특이성리간드 및 이의 사용방법 | |
| US20220064324A1 (en) | Cross species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors | |
| CN112745392B (zh) | 抗pd-l1/cd47双特异性抗体及其用途 | |
| US20220127367A1 (en) | Human monoclonal antibodies specific for flt3 and uses thereof | |
| CN109485726B (zh) | 放射性标记抗纳米抗体在癌症的预后、诊断中的应用 | |
| US20220098323A1 (en) | High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use | |
| CN117024591A (zh) | 抗人b7-h3的单克隆抗体及其应用 | |
| EP4257605A1 (en) | Anti-tslp nanobody and use thereof | |
| EP4299589A1 (en) | Anti-human cd73 antibody and use thereof | |
| CN113045659B (zh) | 抗cd73人源化抗体 | |
| EP4159759A1 (en) | Anti-b7-h3 antibody and preparation therefor and use thereof | |
| CN108452320B (zh) | 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途 | |
| WO2019157772A1 (zh) | 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途 | |
| CN110152014B (zh) | 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途 | |
| CN114763383A (zh) | 靶向人bcma的单克隆抗体及其应用 | |
| CN117624366A (zh) | 5t4纳米抗体及其应用 | |
| WO2024051383A1 (zh) | 抗Trop2抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用 | |
| CN117430708B (zh) | 一种抗Claudin18.2抗体 | |
| WO2022151958A1 (zh) | 靶向人cd276的单克隆抗体及其应用 | |
| CN110141666B (zh) | 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途 | |
| CN116925220A (zh) | Il20rb中和抗体及其医药用途 | |
| CN117700553A (zh) | 靶向c-MET的纳米抗体、药物偶联物及其用途 | |
| CN117402255A (zh) | 抗人pd-l1和人ox40的双特异抗体及其应用 | |
| CA3161573A1 (en) | Antibody-drug conjugates specific for cd276 and uses thereof | |
| CN115819581A (zh) | 一种靶向人cd47的抗体、制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |