KR102585474B1 - 지속성 다중-특이적 분자 및 관련 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중-특이적 분자, 예컨대 지속성 다중-특이적 항체에 관한 것이다. 또한, 관련 방법이 개시된다.

Description

지속성 다중-특이적 분자 및 관련 방법{LONG ACTING MULTI-SPECIFIC MOLECULES AND RELATED METHODS}
관련 출원에 대한 교차 참고
본 출원은 2016년 10월 17일에 제출된 미국 가특허 출원 제62/408,865호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 내용은 본원에 참고를 위해 전체로서 통합된다.
본 발명의 분야
본 발명은 전체적으로 다중-특이성 분자에 관한 것으로, 특히, 지속성 다중-특이성 항체, 및 지속성 다중-특이성 결합 분자의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
다중-특이적 분자, 예를 들어, 이중 특이적 단일클론 항체 (BsAb)는, 2 이상의 상이한 분자들 (예컨대, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분)로 구성된 인공 단백질 또는 컨쥬게이트이다. 이중 특이적 항체는 2개의 상이한 유형의 표적들 (예를 들어, 항원)에 결합하고, 특정 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 이중 특이적 항체의 임상적인 개발은 1990년대 초반에 시작되었다 (Canevari, S. 등 1995, J. Hematother 4, 423-427; Valone, F.H. 등, 1995, J. Clin. Oncol. 13, 2281-2292). 유럽 의약청(EMA))에서 2009년에, 첫번째 이중 특이적 항체 "카투막소맙(Catumaxomab)" [상품명 레모맙 (Removab)]에 대한 유럽에서의 시판을 승인할 때까지 10년이 걸렸다. 두번째 이중 특이적 항체 "블리나투모맙(blinatumomab)" [상품명 블린사이토(Blincyto)]는 2014년에 US FDA에서 승인되었다. 이중 특이적 항체는 2개의 상이한 하이브리도마 세포주들의 체세포 융합 (Milstein, C. 등 1983, Nature, 305(5934): p. 537-40), 또는 2개의 상이한 단일클론 항체들 또는 항체 절편들의 화학적 컨쥬게이션 (Brennan, M., 등, 1985 Science, 229(4708): p. 81-3; Glennie, M. J., 등, 1987 J Immunol, 139(7): p. 2367-75)에 기초한 퀀드로마 (quadroma) 기술, 또는 최근 재조합 및 융합 기술을 통하여 제조되었다. 그러나, 재조합 이중 특이적 항체 제조의 어려움은 이러한 유망한 치료제가 환자에 적용되는데 큰 장애물이 되어 왔다 (Klein C. 등 2012, MAbs. 4(6): 653-663). 게다가, 이러한 분자들 중 일부의 짧은 반감기는 또한 이들이 추가로 임상에 적용되기에는 심각한 제한이 되었다. 추가로, 일부 질병 적용, 예컨대 고형암에 대한 적용시, 일부 이러한 분자들은 종양 조직에 깊이 침투하기에는 너무 크거나, 또는 종양 조직 내에서의 체류 시간이 제한되었고 (Thurber, G.M. 등, 2007, J. Nuclear Medicine. 48(6): 995-999; Minchinton, A.I. 등 2006, Nature Reviews Cancer. 6: 583-592), 이에 EK라 치료 결과가 좋지 않았다.
따라서, 신규한 지속성 이중 특이적 분자 및 이와 관련된 제조 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 개요
본 발명은 다중-특이적 분자 및 관련 방법을 제공함으로써 상기의 미충족된 수요를 해결한다.
일 측면에서, 본 발명은 화학식 Ⅰa의 다중-특이성 분자, 컨쥬게이트 또는 화합물을 제공하며, 여기에서 P는 비-면역원성 중합체이고; T는 3-관능성 소분자 링커 모이어티이고, 2개의 상이한 단백질과 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있는 하나, 둘 또는 그 이상의 관능기를 갖고; 그리고 A1 및 A2는 2개의 어느 상이하거나 또는 동일한 단백질이다.
특히, 본 발명의 일 측면은 화학식 Ⅰb의 컨쥬게이트를 제공한다:
화학식 Ⅰb
여기에서:
P는 비-면역원성 중합체이고;
B는 H, 말단 캡핑기이거나 또는 비어있고, 상기 캡핑기는 C1-50 알킬 및 아릴로부터 선택되고, 여기에서 상기 알킬 내의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체될 수 있고;
T는 하나, 둘, 또는 그 이상의 관능기를 갖는 다중-관능성 링커인데, 여기에서 T와 (L1)a 간의 연결기, 및 T와 (L2)b 간의 연결기는 동일 또는 상이할 수 있고; L1 및 L2 각각은 독립적으로 2관능성 링커이고;
a 및 b는 각각 1-10으로부터 선택되는 정수이고;
A1 및 A2는 어느 2개의 상이하거나 또는 동일한 단백질일 수 있다. 예를 들어, A1 및 A2는 서로 상이하고, A1 및 A2는 각각 독립적으로 항체 절편, 단쇄 항체, 또는 어느 다른 항원 결합 부분 또는 이들의 조합을 포함하거나; 또는 A1 및 A2는 동일하고, 이들 둘은 다중-특이적항원 결합 단백질이며; 그리고
y는 1-10으로부터 선택되는 정수이다.
적어도 하나의 단백질은 인식 결합 모이어티를 포함한다. 예를 들어, A1는 제1 인식 결합 모이어티를 포함하고, A2는 제2 인식 결합 모이어티를 포함한다. 2개의 상이한 단백질은 2개의 상이한 항체 또는 이의 항원-결합 부분일 수 있다. 일 실시예에서, 2개의 항체는 각각 세포독성 세포 상의 수용체에 결합하는 항-CD3 항체, 및 암세포의 수용체에 결합하는 항-CD19 항체이다. 2개의 항체는 단쇄 항체 (SCA 또는 scFv)일 수 있다.
비-면역원성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 탄수화물-기반 중합체, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필-메타크릴아미드 (HPMA), 및 이들의 공-중합체로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 비-면역원성 중합체는 PEG, 예컨대 분기형 PEG 또는 선형 PEG 또는 다중-아암 PEG이다. 그 경우에, 선형 PEG 또는 분기형 PEG의 적어도 하나의 말단은 H, 메틸 또는 저 분자량 알킬기로 캡핑된다. PEG의 총 분자량은 3,000 내지 100,000, 예를 들어, 5,000 내지 80,000, 10,000 내지 60,000, 및 20,000 내지 40,000일 수 있다. PEG는 영구적 결합 또는 절단가능한 결합을 통해 다중관능성 모이어티에 연결될 수 있다.
(L1)a 또는 (L2)b 내의 연결기, 또는 (L1)a와 단백질 A1 간의 연결기, 또는 (L2)b와 단백질 A2 간의 연결기를 형성하는 관능기 (예를 들어, 2개의 부위-특이적 컨쥬게이션 관능기)는, 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오 변이체, 방향족 설폰 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 아이오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조시클로옥틸 (DBCO), 카르보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논기, 히드라지드, 옥심, 포타슘 아실트리플루오로보레이트, O-카르바모일히드록실아민, 트랜스-시클로옥텐, 테트라진, 트리아릴포스핀 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, (L1)a 및 (L2)b 중 하나는 아지드 및 알킨으로 형성되는 연결기를 포함할 수 있다. (L1)a 및 (L2)b 중 다른 하나는 말레이미드 및 티올로 형성되는 연결기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 알킨은 디벤조시클로옥틸 (DBCO)일 수 있다. 다른 것들에서, T는 리신이고, P는 PEG이고, y는 1이고, 반면 알킨은 디벤조시클로옥틸 (DBCO)이다. 일부 구현예에서, A1 및 A2 중 하나는 아지드 태그 항체, 항체 사슬, 항체 절편, 또는 단쇄 항체로부터 유도될 수 있고, 여기에서 아지드는 각각의 (L1)a 또는 (L2)b 중의 알킨에 컨쥬게이트되고; A1 및 A2 중 다른 것은 티올 태그 항체, 항체 사슬, 항체 절편 또는 단쇄 항체로부터 유도될 수 있으며, 여기에서 티올은 각각의 (L1)a 또는 (L2)b 중의 말레이미드에 컨쥬게이트된다.
상기-기재된 다중-특이적 분자 또는 화합물은, 이하의 단계들을 포함하는 방법에 따라서 제조될 수 있다: (i) 2개의 상이한 단백질 또는 이들의 변형된 형태와 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있는 말단 이중-관능기를 갖는 비-면역원성 중합체를 제조하는 단계; 및 (ii) 비-면역원성 중합체와 2개의 상이한 단백질 또는 이들의 변형된 형태를 단계적으로 부위-특이적 컨주게이션을 하여, 화학식 Ⅰa 또는 Ⅰb의 화합물을 형성하는 단계. 일부 실시예에서, 제조 단계 전에, 단백질은 먼저 소분자 링커로 개질될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 다중-특이적 분자 또는 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제제도 제공한다. 본 발명은 추가로 유효량의 상기 기재한 다중-특이적 분자 또는 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 화합물을 필요로 하는 환자에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세 사항은, 이하의 상세한 설명에서 열거된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 상세한 설명 및 청구항에 명백히 나와있을 것이다.
도 1a는 실시예 1에 기재된 30kmPEG-Lys(말레이미드)-알킨 (화합물 2, 3,4,5, 6)의 제조를 위한 반응 개요를 개략적으로 도시한다.
도 1b는 실시예 2에 기재된 40k-Y-PEG-Lys(말레이미드)-알킨 (화합물 3a, 4a, 5a, 6a)의 제조를 위한 반응 개요를 개략적으로 도시한다.
도 1c는 실시예 3에 기재된 30kmPEG-Lys(말레이미드)-DBCO (화합물 4b, 5b, 6b)의 제조를 위한 반응 개요를 개략적으로 도시한다.
도 2a는 실시예 5에 기재된, Cu 촉매 없이 클릭 화학으로 PEG화 단쇄 항체 30kmPEG-SCACD3-SCACD19 (화합물 9-12)를 제조하기 위한 반응 개요를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2b는 실시예 6에 기재된, Cu 촉매 없이 클릭 화학으로 PEG화 단쇄 항체 30kmPEG-SCACD3-SCACD19 (화합물 1Ⅰa- 12a)를 제조하기 위한 반응 개요를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실시예 7에 기재된 시험관내 T 세포 매개 세포 독성을 도시한다.
도 4는 실시예 7에 기재된 생체 내 약물동태학(pharmacokinetics)을 도시한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 신규한 지속성 다중-특이적 분자 (예를 들어, 다중-특이적 또는 이중 특이적 항체) 및 상기 분자의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에서 제공된 다중-특이적 분자는 이중 부위-특이적 PEG화 이중 특이적 항체 (DSP-BsAb)이고, 2 이상의 항원, 또는 동일한 항원의 2 이상의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다.
이중 특이적 단일클론 항체 (BsAb)은 2개의 상이한 단일클론 항체의 항원-결합 절편을 포함하는 인공 단백질이다. 이는 2개의 상이한 유형의 항원, 또는 동일한 항원의 2 이상의 상이한 에피토프에 결합한다. 이러한 접근법의 가장 널리 사용되는 응용은 암 면역치료에 대한 것인데, 조작된 BsAb는 세포독성 세포의 수용체, 예를 들어 CD3, 및 암세포의 수용체, 예를 들어, CD19 모두에 결합하여, 세포독성 세포, 예를 들어 T 세포가 암세포를 파괴하도록 다시 유도한다. 예를 들어, 암-면역치료제들 중에서, Amgen 사에 의해 개발된 이중-특이적 T-세포 항체(bispecific T-cell engager, BiTE)인 블리나투모맙은 가장 성공적으로 개발된 치료제 중 하나이다.
블리나투모맙은 암 치료를 위한 이중 특이적 융합 항체이다. 이는 특히 CD19 및 CD3에 각각 결합하여 효과기 T 세포가 CD19 양성 B 암세포를 사멸시키도록 재유도하는 2개의 단-쇄 단일클론 항체로 구성된다. 그러나, 다른 재조합 항체 절편 단백질과 유사하게, 블리나투모맙은 혈액 순환 동안 매우 신속하게 제거되며, 휴대용 미니-펌프에 의해 일주일에 7일 동안 하루 24시간 계속적인 정맥 주입으로 투여되어야 한다 (Portell, C.A. 등, 2013, Clin Pharmacol, 5 (Suppl 1): p. 5-11). 이러한 특별한 약물 투여는 환자, 특히 청소년이 순응해야 할 난제였었다. 추가적으로, 높은 감염 기회는 이러한 환자에게서 최악의 경우 사망에 이르기도 하는 큰 위험이었다. 게다가, 이들의 극히 짧은 반감기 때문에, 블리나투모맙과 같은 융합된 단쇄 이중 특이적 항체는 통상 고형 암에서 체류 시간이 매우 짧고; 따라서, 효과기 세포가 고형암을 다시 파괴하는 경향의 성공은 매우 의문스러웠다. 추가로, 볼러스 주사에 의해 투여된 블리나투모맙은 가능하게는 항체가 뇌로 누출되는 것에 기인하여 잠재적인 중추 신경계(CNS) 독성이 발생할 수 있다 (Ahmed, M. 등 2015년 4월, Onco Immunology 4 (4)) e989776-1- e989776-11). 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 본원에서 신규한 이중 특이적 항체 기술-DSP-BsAb 기술을 개시하고 있다.
2개의 항체 또는 항체 절편을 화학적으로 컨쥬게이션하여 BsAb를 형성하는 것이, 과거 재조합 융합 방법의 도래 이전에 보고되었다. 또한, 처음으로 보고된 BsAb는 2개의 토끼 IgG의 펩신 소화, 및 이후 생성되는 Fab' 절편의 환원 후 재산화에 의해 수득되는 BsF(ab')2이다. BsF(ab')2 절편의 더욱 효율적인 제조는, 시스테인-반응성 동종- 및 이종-2관능성 가교결합 시약 (Brennan, M. 등 1985, Science 229 (4708): 81-83, Glennie, M. J. 등 1987, J Immunol 139 (7): 2367-2375, S. SONGSIVILAI & P. J. LACHMANN. Clin, exp. 1990, Immunol. 79, 315-321)을 사용하여, 또는 2개의 재조합 발현된 Fab' 절편들 간의 직접 컨쥬게이션 (Shalaby M. R. 등 1992, J Exp Med 175(1): 217-225)을 통하여 달성된다. 그러나, 다수의 방법이 항체 절편 (Fabs, 또는 scFvs)을 사용하여 이중 특이적 항체를 화학적으로 제조하기 위해 기술되었으나, 이러한 접근들 중 많은 것들은 대규모 제조에서의 여러가지 문제, 예를 들어 낮은 컨쥬게이션 수율 및 순도, 또는 어려움을 나타낸다.
오늘날, 분자 생물학의 발달로 인해 (모든 경우는 아니지만) 항체 절편 또는 사슬의 어느 쌍을 이중 특이적 항체 분자로 기술적으로 통합하는 것이 거의 가능해지고 있다. 그러나, 재조합 융합된 이중 특이적 항체 제조의 어려움은 임상적 발전에 대한 큰 장애물이 되어 왔다 (Klein C. 등 2012, MAbs. 4(6): 653-663). 추가로, 이러한 유망한 분자들의 짧은 반감기는 또한 이들이 추가로 임상으로의 발전을 심각하게 제한해왔다.
1970년대의 이의 발명 이후로, 가장 성공적인 단백질 개질 전략의 하나로서의 PEG화는, 약학적 산업에서 광범위하게 사용되어 왔다 (Jevsevar, S., M. 등, 2010, Biotechnology Journal, 5(1): p. 113-128; Veronese, F. Biodrug, 22(5): p. 315-329). 이들의 순환반감기를 연장하고 이들의 약물동태학 및 약역학을 개선하기 위한, PEG와 치료 분자, 예컨대 단백질 및 폴리펩티드의 컨쥬게이션은 잘 알려져 있다 (미국 특허 제4,179,337호).
선형 PEG가 사용되는 경우, PEG화 이중 특이적 항체의 2개의 가능한 포맷이 있다: 하나는 선형 PEG의 양 말단에 부착된 2개의 상이한 항체 또는 항원-결합 부분에 의한 것이고(포맷 I), 다른 하나는 PEG의 한쪽 말단에만 부착된 2개의 상이한 항체 또는 항원-결합 부분에 의한 것이다 (포맷 II). 특이적 적용에 따라, 하나의 포맷이 바람직하게는 다른 것들에 비해 더 선택될 수 있다. 시너지 효과를 위한 병행 치료의 경우, 다른 하나의 포맷보다 우위인 하나의 포맷의 선택은 중요한 것으로 보이지는 않지만, 암세포 사멸을 위한 세포독성 효과기 세포의 재이용의 경우에는, PEG의 양 말단에 부착된 2개의 상이한 항체 또는 항원-결합 부분에 의한 포맷(포맷 I)은 적어도 이하의 2가지 이유 때문에, 더 열위이다. 먼저, 표적 세포의 효과기 세포에 대한 근접성은 효과기 세포가 직접 용해되도록 효과적으로 재유도하는 면역 시냅스를 형성하는데 매우 중요하며 (Wuellner, U. 등, 2015, Antibodies, 4, p. 426-440; Bluemel, C. 등, 2010, Cancer Immunol Immunother. 59(8):p. 1197-209), 달리 말해, 이중 특이적 항체의 2개의 상이한 항체 또는 항원-결합 부분는 암-면역치료법을 위해서는 서로 매우 가까워서 효율적으로 작용해야 하나, 반면 PEG화 이중 특이적 항체의 포맷 I은 2개의 상이한 항원-결합 모이어티들 간의 공간적 거리를 조절하는 기전이 없고, 따라서 이러한 거리 요건을 충족할 수 없다. 둘째로, 이러한 포맷 중의 PEG 사슬은 자유롭게 움직일 수 없어서, 통상 짧은 제거 반감기를 갖는 항원-결합 모이어티를 보호하는 이의 가능성을 충분히 이용할 수 있다. 올바른 접근은 본 발명에 기재된 바와 같이, PEG의 단지 하나의 말단에만 부착된 2개의 상이한 항체 또는 항원-결합 부분을 갖는 PEG화 이중 특이적 항체 (포맷 II)을 만드는 것이며, 이로 인하여 PEG의 다른 말단 (선형 PEG의 경우) 또는 말단 (분지형 또는 다수의 아암 PEG의 경우)을 자유롭게 방치하여, PEG가 짧은-수명의 이중 특이적 항체를 더 효율적으로 보호할 수 있다. 이러한 구조 포맷 (포맷 II)으로, 필요한 면역 시냅스는 또한 암세포를 사멸하는 더욱 효율적으로 재표적화된 효과기 세포를 제공한다. 따라서, 더 나은 약물동태학 및 더 나은 약역학을 기대할 수 있다.
2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체를 하나의 PEG 말단에 부위-특이적적으로 컨쥬게이션하여 PEG화 이중 특이적 항체를 형성하기 위해서는, PEG의 말단 관능기, 예컨대 히드록실기, 카르복실기 등은 2개의 항체 절편 또는 단쇄 항체와 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있는 말단 분기형 이종 이중-관능기로 변환되어야 한다. 말단 분기형 PEG을 제조하기 위한 방법은 US6756037, US6638499, 및 US6777387에 기재되어 있지만, 이들 특허에 기재된 말단 분기형 PEG 중 어느 것도 2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체, 또는 항원-결합 부분의 다른 포맷과 부위-특이적 컨쥬게이션을 수행할 수 없다.
개념적으로, PEG화 이중 특이적 항체는 PEG를 융합된 이중 특이적 항체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 접근법의 문제점은, 융합된 항체의 제조가 단일 항체 절편 또는 단쇄 항체의 제조보다 훨씬 더 기술적으로 난제이며 어렵다는 것이다. 본 발명에 개시된 대안적 접근은 2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체를 별도로 제조한 후, 이러한 2개의 항체 절편 또는 단쇄 항체를 PEG와 화학적으로 연결하고, 이들 사이에 3-관능성 소분자 모이어티를 갖는 것이다.
2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체를 PEG에 화학적으로 연결하여 PEG화 이중 특이적 항체를 형성하는데 사용될 수 있는 2개의 접근법이 있다. 제1 접근법은 먼저 2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체를 부위-특이적으로 연결한 후, 부위-특이적 PEG화를 하는 것이다. 이러한 접근법의 문제점은 2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체의 커플링에 있다. 커플링 공정은 통상 단순히 이러한 항체 절편 또는 단쇄 항체의 이량체 [예를 들어, (scFv1)2 및 (scFv2)2] 형성 경향에 기인하여, 식별 및 정제의 관점에서 매우 어려우며, 이는 종종 표적 화합물 (예를 들어, scFv1-scFv2)과 유사한 분자량 및 물리적 특징을 갖는 것으로 판명되었다.
다른 접근법은 본 발명에 기재된 DSP-BsAb 기술을 사용하고 있다. DSP-BsAb 기술에 의하면, 먼저 항체 절편 또는 단쇄 항체을 부위-특이적으로 PEG화한 후, 다른 항체 절편 또는 단쇄 항체과 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있다. PEG화 항체 절편 또는 PEG화 단쇄 항체가 항체 절편 또는 단쇄 항체 또는 이들의 이량체와는 매우 상이한 특징을 갖기 때문에, 이러한 접근법에 의하면, 정제 및 특성화 공정이 훨씬 용이할 수 있다.
본 발명은 2개의 상이한 항체 절편 또는 단쇄 항체, 예컨대 항-CD19 및 항-CD3와 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있는 말단 분기형 PEG의 제조 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이중 특이적 항체에 대한 혈액 순환 반감기가 개선될 수 있다. 또한, 종래의 단일-특이적/모노-특이적 항체 절편, 단쇄 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 본 발명의 이중 특이적 항체의 제조에 사용할 수 있으며, 이는 재조합 융합된 이중 특이적 항체의 제조에 비해, 용이한 제조 공정을 의미한다. 게다가, 기재된 PEG화 이중 특이적 항체 포맷은 암-면역치료를 위해 암세포를 사멸시키는 효과기 세포를 재사용하는 장점을 갖는다. 추가로, 전통적인 전장 이중 특이적 항체 또는 이들의 어느 유도체는 통상 고형 암 조직에 깊이 침투하기에 너무 큰 반면, 전통적인 단쇄 이중 특이적 항체 또는 항체 절편 또는 이들의 어느 유도체는 고형 암 조직 내의 체류 시간이 제한되기 때문에, 본원에 기재된 P-BsAb 기술은 이중 특이적 항체의 크기와 순환 반감기 사이에 균형을 맞출 수 있는 능력을 갖고, 잠재적으로 고형 암에 대한 더욱 효과적인 치료법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 상기 논의된 문제를 해결하고, 이중 특이적 항체 기술을 개선시킨다.
I. 컨쥬게이트
본 발명의 일 측면에서, 이하의 화학식 (Ⅰa)의 화합물이 제공된다:
여기에서 P는 비-면역원성 중합체이고; T는 다중-관능성 모이어티, 예컨대 3-관능성 소분자 링커 모이어티이며, 이의 관능기들 중 2개는 2개의 상이한 단백질과 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있다. A1 및 A2는 어느 2개의 상이한 단백질, 예컨대 항체 절편 또는 단쇄 항체 또는 다른 형태의 항체 또는 이들의 조합이다.
특히, 본 발명의 일 측면은 이하의 화학식 (Ⅰb)의 컨쥬게이트를 제공한다:
화학식 Ⅰb
여기에서:
P는 비-면역원성 중합체이고;
B는 H, 말단 캡핑기이거나 또는 비어있고, 상기 캡핑기는 C1-50 알킬 및 아릴로부터 선택되며, 여기에서 상기 알킬 내의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체될 수 있으며;
T는 다중-관능성 링커이고, 여기에서 T와 (L2)a 사이의 연결기, 및 T와 (L2)b 사이의 연결기는 동일한 또는 상이할 수 있고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 2관능성 링커이고;
a 및 b는 각각 0-10으로부터 선택된 정수이고;
A1 및 A2는 서로 동일하거나 또는 상이하며, A1 및 A2 각각은 독립적으로 항체 절편, 단쇄 항체, 또는 항체 또는 다중-특이적 항체의 어느 다른 형태 또는 이들의 조합을 포함하고; 그리고
y는 1- 10으로부터 선택된 정수이다.
컨쥬게이트의 P 모이어티는 다양한 비-면역원성 중합체로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 중합체는 수용성이다. 중합체의 예에는 덱스트란, 탄수화물-계 중합체, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 알콜 및 다른 유사한 비-면역원성 중합체가 포함된다. 추가의 예시적인 중합체에는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(올레핀 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(아크릴산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 공중합체 또는 삼원중합체가 포함된다. 중합체는 선형 또는 분기형일 수 있다. 중합체의 평균 분자량은 약 100 내지 약 100,000 달톤, 예컨대 약 3,000 내지 약 100,000 달톤의 범위이며, 이의 모든 하위 범위를 포함한다.
중합체는 관능화, 활성화되거나, 또는 반응 파트너에 컨쥬게이트될 수 있는 말단기를 포함할 수 있다. 말단기의 비-제한적 실시예는 히드록실, 아미노, 카르복실, 티올, 및 할라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다.
일부 구현예에서, y는 1이고, 화학식 Ⅰb는 펜던트 중합체 사슬과의 컨쥬게이트를 나타낸다. 말단 B는 캡핑기의 역할을 할 수 있다.
일부 구현예에서, y는 2, 3, 4, 5 또는 6이고, 화학식 Ⅰb는 분기형 중합체 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트를 나타낸다. 일부 구현예에서, [B - P]y 내의 B는 저 분자량 C1-10 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 및 부틸이고, 여기에서 탄소 중 하나 이상은 헤테로원자 (예를 들어 O, S, 및 N)로 대체될 수 있다.
중합체 모이어티 P
일부 구현예에서, P는 PEG 모이어티를 나타낸다. 일부 구현예에서, 2개의 상이한 단백질, 예컨대 항체 절편 또는 단쇄 항체와 부위-특이적으로 컨주게이션할 수 있는 말단 분기형 이종이관능성 PEG의 제조 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 혈액 순환 반감기를 연장시킬 수 있는 이의 PEG화 이중 특이적 단쇄 항체의 제조 방법도 또한 제공된다.
예시적인 구현예에서, PEG의 말단 작용기, 예컨대 히드록실 또는 카르복실기 등은 활성화되고, 3-관능성 소분자 모이어티, 예컨대 Boc 보호된 리신과 컨쥬게이션하여, 말단 분기형 이종이관능성 PEG를 형성한다. 새롭게 형성된 카르복실기는 이후 알킨기를 갖는 소분자 스페이서와 커플링함으로써 알킨기로 변환된다. Boc 탈보호 후 노출된 아미노기는, 말레이미드기를 갖는 다른 소분자 스페이서와 컨주게이션되어, 말단 분기형 말레이미드/알킨 이종이관능성 PEG를 형성한다. 생성되는 말레이미드/알킨 말단 분기형 이종이관능성 PEG는 티올 태그 단쇄 항체 및 아지드 태그 단쇄 항체와 연속하여 부위-특이적으로 컨쥬게이션하여, PEG화 단쇄 이중 특이적 항체를 형성하고, PEG화 단쇄 이중 특이적 항체보다 더 긴 혈액 순환 반감기를 제공한다.
화학식 (Ⅰa) 또는 (Ⅰb)의 PEG화 이중 특이적 항체는 PEG 말단 작용기, 예컨대 히드록실, 카르복실기 등을 말단 분기형 이종이관능기로 변환시켜, 말단 분기형 이종이관능성 PEG, 예컨대 말단 분기형 말레이미드/알킨 이종이관능성 PEG를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, P 모이어티는 이하의 화학식의 PEG로부터 유도될 수 있다:
.
여기에서:
n은 약 10 내지 2300이고, 바람직하게는 10000 내지 40000, 또는 원하는 경우 그 이상의 총 분자량을 갖는 중합체를 제공한다. B는 메틸 또는 다른 저 분자량 알킬기 또는 -CH2(CH2)mF이다. B의 비-제한적인 예는 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필, 및 부틸을 포함한다. M은 0 내지 10이다. F는 3-관능성 소분자 화합물을 관능화, 활성화 및/또는 컨주게이션할 수 있는 말단 작용기, 예컨대 히드록실, 카르복실, 티올, 할라이드, 아미노기 등이다.
본 발명의 또 다르 구현예에서, 상기 방법은 또한 대안적 분기형 PEG에 의해 수행될 수도 있다. 분기형 P 모이어티는 이하의 화학식의 화합물로부터 유도될 수 있다: .
여기에서:
PEG는 폴리에틸렌 글리콜이고, m은 1 초과의 정수이며, 바람직하게는 10000 내지 40000, 또는 원하는 경우 그 이상의 총 분자량을 갖는 중합체를 제공한다. B는 메틸 또는 다른 저 분자량 알킬기이다. L은 2 이상의 PEG가 부착되는 기능적 연결 모이어티이다. 이러한 연결 모이어티의 예는 어느 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 리신, 또는 1,3-디아미노-2-프로판올, 트리에탄올아민, 2개 초과의 관능기가 부착된 어느 5 또는 6원 방향족 고리 또는 지방족 고리 등이고, S는 어느 비-절단가능한 스페이서이다. F는 말단 작용기, 예컨대 히드록실, 카르복실, 티올, 아미노기 등이고, i는 0 또는 1이다. i가 0과 동일한 경우, 화학식은 이하와 같다: .
여기에서: PEG, m, B 또는 L의 정의는 상술한 것과 동일한 의미를 갖는다.
관련 측면에서, 이하의 화학식을 갖는 다중-아암 중합체 모이어티와의 컨쥬게이트를 제공한다:
.
여기에서, B는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 중합체 아암에 연결하는 코어 역할을 한다. 코어 B의 구조는 대칭 또는 비대칭, 선형 또는 환형일 수 있다. 일부 구현예에서, B는 포화 지방족기이다. 코어의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자, 예컨대 산소, 황 또는 질소로 대체될 수 있다. 코어 B는, 중합체 아암과 함께, 폴리올, 폴리티올 또는 폴리아민의 잔기일 수 있다. 예는 글리세롤, 트리메틸올-프로판, 펜타에리스리톨, 소르베이트, 및 글리세롤의 올리고머를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 다중-아암 중합체 모이어티는 이하의 화학식으로부터 유도될 수 있다:
.
여기에서:
n은 약 10 내지 1200의 정수이며, m은 1 초과의 정수이며, 바람직하게는 10000 내지 40000, 또는 원하는 경우 이를 초과하는 총 분자량을 갖는 중합체를 제공한다. F는 말단 작용기, 예컨대 히드록실, 카르복실, 티올, 아미노기 등이다. B는 2 이상의 PEG가 부착되는 비-기능적 연결 모이어티이다. B의 구조는 대칭 또는 비대칭, 선형 또는 환형이 포화 지방족기일 수 있고, B의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자, 예컨대 산소, 황 또는 질소로 대체될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 대안적 중합체 물질, 예컨대 덱스트란, 탄수화물 - 염기 중합체, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 알콜 또는 다른 유사한 비-면역원성 중합체에 의해서도 수행될 수 있으며, 이들 말단기는 관능화되거나 또는 활성화되어 이종이관능기로 변환될 수 있다. 상술한 목록은 단지 예시적이며, 본원의 사용에 적합한 비-항원성 중합체의 유형을 제한하도록 의도되지 않는다.
3-관능성 링커 T
T는 P, (L1)a 및 (L2)b에 연결되는 3-관능성 링커를 나타낸다. T는 3개의 관능기의 어느 조합을 갖는 분자로부터 유래될 수 있으며, 이들의 비-제한적인 예는 히드록실, 아미노, 히드라지닐, 카르복실, 티올, 및 할라이드를 포함한다. 관능기는 3-관능성 링커에서 동일 또는 상이한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 1 또는 2개의 관능기는 다른 반응 파트너와의 선별적인 컨쥬게이션을 달성하기 위해 보호될 수 있다. 여러가지 보호기들이 예를 들어, Advanced Organic Chemistry by March (3판, 1985, Wiley 및 Sons, NewYork)를 포함하는 문헌에 공지되어 있다. 작용기는 또한 T와 또 다른 반응 파트너 간의 반응 전후에, 다른 기로 변환될 수도 있다. 예를 들어, 히드록실기는 메실레이트 또는 토실레이트 기로 변환될 수 있다. 할라이드는 아지도기로 대체될 수 있다. T의 산 작용기는 말단 알킨을 포함하는 아미노기와의 커플링에 의해, 알킨 관능기로 변환될 수 있다.
예시적인 구현예에서, T는 리신, 1,3-디아미노-2-프로판올, 또는 트리에탄올아민으로부터 유도된다. 이러한 분자 상의 하나 이상의 관능기는 선택적인 반응에 대해 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, T는 BOC-보호된 리신으로부터 유래된다.
2관능성 링커 L 1 및 L 2
링커 L1 및 L2는 모두 링커 사슬, 내부 연결기 및/또는 말단 연결기를 포함한다. 링커 사슬 및/또는 연결기 (내부 또는 말단)은 -(CH2)aC(0)NR1(CH2)b-, -(CH2)aO(CH2CH20)c-, -(CH2)a헤테로사이클릴-, -(CH2)aC(0)-, 및 -(CH2)aNR1-, -CR1=N-NR1-, -CR1=N-O-, -CR1=N-NR2-CO-, -N=N-CO-, -S-S-로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 여기에서 a, b, 및 c는 각각 0 내지 25로부터 선택되는 정수이고, 모든 하위 단위가 포함되며; R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C10 알킬을 나타낸다.
링커 L1 및 L2 내부의 헤테로사이클릴 연결기 (내부 위치 또는 말단 위치에 있든지 무관함)는 말레이미도-계 모이어티로부터 유도될 수 있다. 비-제한적인 적합한 전구체의 예는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산카르복실레이트 (SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스테르 (KMUA), γ-말레이미도부티르산 N-석신이미딜 에스테르 (GMBS), ε-말레이미드카프로산 N-히드록시석신이미드 에스테르 (EMCS), m-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스테르 (AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트 (SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트 (SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트 (PMPI)를 포함한다.
일부 다른 비-제한적인 예시적인 구현예에서, 각각의 링커 단위는 또한 N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트 (SIAB), N-석신이미딜 아이오도아세테이트 (SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트 (SBA), 또는 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP)로부터 선택된 할로아세틸-계 모이어티로부터 유도될 수도 있다.
대안적으로, 링커의 헤테로사이클릴 연결기는 상이한 링커 모이어티의 컨쥬게이션으로부터 형성되는 테트라졸릴 또는 트리아졸릴일 수 있다. 따라서, 헤테로사이클릴기는 또한 연결 지점으로 역할을 하기도 한다.
일부 구현예에서, (L1)a 및 (L2)b는 각각 이하의 것들을 포함한다:
X1-(CH2)aC(0)NR1(CH2)bO(CH2CH20)c(CH2)dC(0)- 또는
X3-(CH2)aC(0)NR1(CH2)bO(CH2CH20)c(CH2)dX2(CH2)eNR2,
여기에서 X1, X2 및 X3는 동일 또는 상이할 수 있고, 독립적으로 헤테로사이클릴 기를 나타낸다;
a, b, c, d 및 e는 각각 1-25로부터 선택된 정수이고; 그리고
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C10 알킬을 나타낸다.
일부 구현예에서, X1 및/또는 X3는 말레이미도-계 모이어티로부터 유도된다. 일부 구현예에서, X2는 트리아졸릴 또는 테트라졸릴 기를 나타낸다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 수소를 나타낸다. 일부 구현예에서, a, b, c, d 및 e는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로부터 독립적으로 선택된다.
연결기
본 발명의 컨쥬게이트의 상이한 모이어티들은 다양한 화학적 연결기들을 통해 연결될 수 있다. 예로는 아미드, 에스테르, 디설파이드, 에테르, 아미노, 카르바메이트, 하이드라진, 티오에테르, 및 카르보네이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, PEG 모이어티 (P)의 말단 히드록실기는 활성화된 후, 리신 (T)와 커플링되어, 화학식 Ⅰa 또는 Ⅰb의 P와 T 사이에서 바람직한 연결 지점을 제공할 수 있다. 한편, T와 L1 또는 L2 사이의 연결기는 링커 L1 또는 L2의 아미노기와 리신 (T)의 카르복실기 사이의 반응으로부터 생성되는 아미드일 수 있다. 컨쥬게이트의 바람직한 특징에 따라서, 적합한 연결기는 또한 항체 모이어티 (A)와 인접하는 링커 (L1 또는 L2)의 사이, 및 L1 또는 L2의 개별 링커들의 사이 또는 이들 내부에 통합될 수도 있다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트의 상이한 모이어티들 간의 연결기는 고유한 화학적 친화도를 갖거나, 또는 서로 선택성이 있는 한 쌍의 관능기의 커플링으로부터 유도될 수 있다. 이러한 유형의 커플링 또는 고리 형성으로, 특정 단백질 또는 항체 모이어티의 도입을 위한 부위-특이적 컨쥬게이션이 가능해진다. 부위-특이적 컨쥬게이션을 유도하는 이러한 관능기의 비-제한적인 예는, 티올, 말레이미드, 2'-피리딜디티오 변이체, 방향족 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 아이오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조시클로옥틸 (DBCO), 카르보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 히드라지드, 옥심, 포타슘 아실트리플루오로보레이트, O-카르바모일히드록실아민, 트랜스-시클로옥텐, 테트라진, 및 트리아릴포스핀을 포함한다.
합성
합성을 위한 핵심 단계들은 이하의 구현예에 의해 예시될 수 있다. 일단 원하는 PEG가 선택되면, PEG의 말단 작용기, 예컨대 히드록실, 카르복실기 등은 최신-인정된 공정을 사용하여 말단 분기형 이종이관능기로 변환된다. 넓게 말하면, 말단 분기형 이종이관능성 PEG, 예컨대 말단 분기형 이종이관능성 말레이미드/알킨 PEG는, 말단 히드록실기 또는 커플링 시약, 예컨대 Ν,Ν'-디이소프로필카르보디이미드 (DIPC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 등의 경우, 시약, 예컨대 디(N-석신이미딜) 카르보네이트 (DSC), 트리포스겐 등을 사용하여, 말단 카르복실기의 경우 염기, 예컨대 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP), 피리딘 등의 존재 하에, PEG의 말단 히드록실 또는 카르복실기를 N-히드록시석신이미드로 활성화시켜, 활성화 PEG를 형성함으로써 제조된다.
다음으로, 활성화 PEG는 염기, 예컨대 디이소프로필아민 (DIPE)의 존재 하에서 3-관능성 소분자, 예컨대 리신 유도체 H-Lys(Boc)-OH와 반응하여, 자유 카르복실기 및 Boc 보호된 아미노기를 갖는 말단 분기형 이종이관능성 PEG를 형성한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 원하는 경우, PEG의 다른 공지의 말단 관능기, 예컨대 할라이드, 아미노, 티올기 등 및 다른 공지의 3-관능성 소분자가 동일한 목적을 위한 대안으로서 사용될 수 있다. 3-관능성 소분자의 예는, 3개의 관능기 (NH2, NHNH2, COOH, OH, C=OX, N=C=X, S, 무수물, 할라이드, 말레이미드, C=C, C≡C 등)의 어느 조합을 포함하는 분자, 또는 이들의 보호된 버전을 포함한다.
말단 분기형 카르복실/Boc 아미노 이종이관능성 PEG는, 이후 알킨기, 예컨대 1-아미노-3-부틴 또는 NH2-DBCO를 갖는 소분자 스페이서와의 커플링에 의해, 말단 분기형 알킨/Boc 아미노 이종이관능성 PEG로 변환된다. 말단 분기형 알킨/Boc 아미노 이종이관능성 PEG에 산, 예컨대 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하면, 말단 분기형 알킨/아민 이종이관능성 PEG이 생성된다. 표적 말단 분기형 알킨/말레이미드 이종이관능성 PEG는, 말단 분기형 알킨/아민 이종이관능성 PEG를 말레이미드 기, 예컨대 NHS-PEG2-말레이미드를 갖는 또 다른 소분자 스페이서와 반응시킴으로써 수득된다. 이러한 말단 분기형 알킨/말레이미드 이종이관능성 PEG는 티올 태그 항체 및 아지드 태그 항체와 연속하여 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있다.
별도로, 2개의 단쇄 항체 (SCA) 절편, 항-CD3 (SCACD3) 및 항-CD19 (SCACD19)는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 일 실시예에서, 이들은 pPICZ 벡터를 포함하는 EasySelect™ 피키아(피키아) 발현 키트를 사용하여, 피키아(Pichia)에서 재조합 DNA 기술을 통하여 제조된다. 항체의 유전자, 예컨대 항-CD3 VH-VL 및 항-CD19 VL-VH가 합성되고, pPIZA 발현 벡터로 클로닝되어, 피. 파스토리스(P. pastoris) X33 종으로 형질전환된다. SCA의 발현은 메탄올에 의해 유도되고, Ni-킬레이팅 수지에 의해 정제된다. 추후의 컨쥬게이션을 용이하게 하기 위해, 부위-특이적 관능기, 예컨대 티올이 재조합 DNA 기술을 통해 단쇄 항체의 VH와 VL 사이의 링커로 삽입된다 (Yang, K. 등 2003, Protein Eng 16 (10): 761-770). 순수한 SCA는 크로마토그래피 공정을 통해 수득된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 다른 공지의 부위-특이적 관능기도 또한 원하는 경우 동일한 목적을 위한 대안으로서, 재조합 DNA 기술을 통해 VH와 VL 사이의 링커로 삽입될 수 있다.
PEG화 단쇄 이중 특이적 항체를 제조하기 위해, 말단 분기형 알킨/말레이미드 이종이관능성 PEG는 특히 유전적으로 삽입되는 유리 티올 작용기를 갖는 반응 부위로, PEG-(SCACD3)-알킨을 생성하고, 반면 SCACD19는 특히 소분자 아지드/말레이미드 2관능성 링커를 갖는 컨쥬게이트 부위로, 아지드-SCACD19를 생성한다. 정제된 아지드-SCADCD19 및 정제된 PEG-(SCACD3)-알킨은 특히 아지드-알킨 클릭 화학을 통해 표적 PEG화 단쇄 이중 특이적 항체 PEG-SCACD3/SCACD19를 형성하기 위한 반응 부위이다.
본 발명에서 사용된 티올/말레이미드 및 아지드/알킨 부위-특이적 컨쥬게이션 기의 쌍 이외에도, 당업자에게 명백한 바와 같이, 원하는 경우, 부위-특이적 컨쥬게이션 기의 다른 공지의 쌍, 예컨대 티올/2'-피리딜디티오 쌍; 티올/설폰 쌍; DBCO/아지드 쌍; 트랜스-시클로옥텐/테트라진 쌍; 카르보닐/히드라지드 쌍; 카르보닐/옥심 쌍; 아지드/트리아릴포스핀 쌍; 포타슘 아실트리플루오로보레이트/O-카르바모일히드록실아민 쌍이 유사하게 고안되어, 동일한 목적을 위한 대안으로 사용된다. 부위-특이적 컨쥬게이션기의 쌍의 상술한 목록은 단지 예시적인 것이며, 본원에 사용하기에 적합한 부위-특이적 컨쥬게이션 기의 쌍의 유형을 제한하려는 의도가 아니다.
용어의 정의
본원에 사용된 용어 "알킬"은, 통상 약 1 내지 25개 원자 길이의 범위를 갖는 탄화수소 사슬을 지칭한다. 이러한 탄화수소 사슬은 포화되는 것이 바람직하지만 반드시 그럴 필요는 없고, 통상 직쇄형이 바람직하기는 하지만, 분기형 또는 직쇄형일 수도 있다. 용어 Cl-10 알킬은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 탄소를 갖는 알킬기를 포함한다. 유사하게, Cl-25 알킬은 1 내지 25개의 탄소를 갖는 모든 알킬을 포함한다. 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, 이소프로필, n-부틸, n-펜틸, 2-메틸-1-부틸, 3-펜틸, 3-메틸-3-펜틸 등을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "알킬"은 3개 이상의 탄소 원자가 언급되는 경우 사이클로알킬을 포함한다. 달리 기재된 바 없는 경우, 알킬은 치환 또는 비-치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작용기"는 통상의 유기 합성 조건 하에서 사용되어, 이들이 부착된 엔티티(entity)와 통상 추가적인 작용기를 포함하는 다른 엔티티 사이에서 공유적 연결을 형성할 수 있는 기를 지칭한다. "이중 관능성 링커"는 컨쥬게이트의 다른 모이어티를 통해 2개의 관능기를 형성하는 2개의 연결기를 갖는 링커를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 새로운 작용기의 도입 또는 원래 화합물의 특성 변경을 목적으로, 추가적인 구조적 모이어티에 의해 화학적으로-개질된 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "보호기"는 특정 반응 조건 하에서 분자 내에서 특히 화학적으로 반응하는 작용기의 반응을 저해 또는 차단하는 모이어티를 지칭한다. 다양한 보호기가 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Organic Chemistry, 3판, Wiley, NewYork, 1999의 T. W. Greene 및 G. M. Wuts, Protecting groups, 및 P. J. Kocienski, Protecting groups, 3판, Thieme Chemistry, 2003, 그리고 이들에 언급된 참고 문헌에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "PEG" 또는 "폴리(에틸렌 글리콜)"는 폴리(에틸렌 옥사이드)을 지칭한다. 본 발명에 사용하기 위한 PEG는 통상 -(CH2CH20)n- 의 구조를 포함한다. PEG는 여러가지 분자량, 구조 또는 기하학적 형태를 가질 수 있다. PEG 기는 통상의 합성 반응 조건 하에서 화학적 변환을 용이하게 실시하지 않는 캡핑기를 포함할 수 있다. 캡핑기의 예에는, OC1-25 알킬 또는 -O아릴이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "링커"는, 상호연결 모이어티, 예컨대 항체 및 중합체 모이어티를 연결하는데 사용되는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭한다. 링커는 절단가능 또는 절단불가능할 수 있다. 컨쥬게이트를 위한 다양한 링커의 제조는, 예를 들어 Goldmacher 등, Antibody-drug Conjugates and Immunotoxins: From Pre-clinical development to therapeutic Applications, Chapter 7, in Linker Technology and Impact of Linker Design on ADC Properties, Edited by Phillips GL; Ed. Springer Science and Business Media, NewYork (2013)를 포함하는 문헌에 기재되어 있다. 절단가능한 링커는 특정 생물학적 또는 화학적 조건 하에서 절단될 수 있는 기 또는 모이어티를 포함한다. 예에는 효소적으로 절단가능한 디설파이드 링커, 1,4- 또는 1,6-벤질 제거, 트리메틸 록(lock) 시스템, 바이신(bicine)-계 자가 절단가능 시스템, 산-불안정 실릴 에테르 링커 및 다른 광-불안정 링커를 포함된다.
본원에 사용된 용어 "연결하는 기(linking group)" 또는 "연결기(linkage group)"는, 화합물 또는 컨쥬게이트의 상이한 모이어티들을 연결하는 작용기 또는 모이어티를 지칭한다. 연결기의 예에는, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 하이드라존, 옥심, 및 세미카르바지드, 카르보디이미드, 산 불안정(liable) 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기 및 에스테라제 불안정 기가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 링커 모이어티 및 중합체 모이어티는 아미드 또는 카르바메이트 연결기를 통해 서로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "다중 아암 (multiple arm)" 또는 "다중-아암의 (multiple-armed)"는, "코어" 분자 또는 구조에 연결된 2개 이상의 중합체-함유 "아암"을 갖는 중합체의 형태 또는 모든 구조를 지칭한다. 따라서, 다중-아암의 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 아암을 가질 수 있다.
Ⅱ. 다중-특이적 분자 및 항체
본 발명은 2 이상의 상이한 인식 특이성을 갖는 다중-특이적 분자를 포괄한다. 본 발명의 다중-특이적 분자는 그 중에서도, 제1 표적에 결합하는 제1 인식 결합 모이어티, 및 제2 표적에 결합하는 제2 인식 결합 모이어티를 포함하는 분자를 지칭한다. 특이적 구현예에서, 상기 인식 결합 모이어티들 중 하나 또는 둘 모두는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
항체
본 발명의 다중-특이적 분자는 어느 단리된 항체, 특히 단일클론 항체, 예컨대 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는 인간 단일클론 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체가 또한 예를 들어, 쥐 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 이들의 조합일 수도 있지만, 상기 항체는 인간 항체이다.
구조 요소
단일클론 항체 기술은 선택적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 절편의 형태의, 선택적으로 결합하는 제제의 제조를 허용한다. 단일클론 항체, 또는 이의 절편을 생성하기 위해서는, 종래의 하이브리도마 기술을 사용할 수 있다. 대안적으로, 단일클론 항체, 또는 이의 절편은, scFv (단쇄 가변 부위), 특히 인간 scFv의 파지 라이브러리의 사용에 의해 수득될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,885,793호, WO 92/01047, WO 99/06587를 참고하라).
일 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적 분자 내의 적어도 하나의 인식 결합 모이어티는 1가 항체 절편이다. 일 구현예에서, 1가 항체 절편은 단일클론 항체로부터 유래된다. 1가 항체 절편은 Fab, Fab'-SH, 단일 도메인 항체, F(ab')2, Fv 및 scFv 절편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 일 구현예에서, 1가 항체 절편은 Fab, Fab'-SH, 단일 도메인 항체, F(ab')2, Fv 및 scFv 절편을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 다중-특이성 분자 내의 적어도 하나의 인식 결합 모이어티는 단일 도메인 항체, 또는 scFv 또는 Fab-절편, 또는 단일클론 항체의 Fab'-절편이다.
다중-특이적 분자 내의 하나 이상의 인식 결합 모이어티는 또한 디아바디 또는 단일-도메인 항체일 수 있다. 디아바디는 2가 또는 이중 특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부분를 갖는 항체 절편이다 (예를 들어 EP 0 404 097, WO 93/01161, Hudson, P. J., 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134, 및 Holliger, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448를 참고하라). 또한, Hudson, P. J., 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134에 기재된 트리아바디 및 테트라바디도, 다중-특이적 분자 내의 인식 결합 모이어티를 위해 사용될 수 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부를 포함하는 항체 절편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 미국 특허 제6,248,516호).
다중-특이적 분자 내의 인식 결합 모이어티는 Fv일 수 있는데, 이는 완전한 항원-결합 부분를 포함하나 불변 부위가 없는 최소 항체 절편이다. scFv의 검토를 위해서는, 예를 들어, Plueckthun, in The Pharmacology of monoclonal antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), (Springer-Verlag, NewYork, 1994), pp. 269-315, WO 93/16185, 미국 특허 제5,571,894호, 미국 특허 제5,587,458호를 참고하라. 일반적으로, 6개의 초가변 부위 (HVRs)는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 단지 3개의 항원 특이적 HVR을 포함하는 절반의 Fv)은, 이의 항원을 인식하여 이에 결합하는 능력을 갖는다.
일 구현예에서, 1가 항체 절편은 하나의 중-쇄 및 하나의 경-쇄 가변 도메인의 이량체가 타이트하게 비-공유 연결된 2개-사슬 Fv 종이다. 일 구현예에서, 1가 항체 절편은 가요성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 하나의 중-쇄 및 하나의 경-쇄 가변 도메인으로 이루어지는 단-쇄 Fv (scFv) 종이다.
항체의 Fab 절편은 중-쇄 및 경-쇄 가변 도메인, 뿐만 아니라 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)도 포함한다. Fab' 절편은 항체 힌지 부위 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇 잔기를 추가함으로써, Fab 절편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 포함하는 Fab'를 지칭한다.
항체 절편의 제조를 위한 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 전통적으로, 항체 절편은 전장 항체의 단백질 가수분해적 소화를 통해 수득될 수 있다 (예를 들어, Morimoto, K., 등, J. Biochem. Biophys. Meth. 24 (1992) 107-117, Brennan, M., 등, Science 229 (1985) 81-83를 참고하라). 예를 들어, 전장 항체의 파파인 소화에 의해, "Fab" 절편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 절편이 생성되는데, 이들 각각은 단일 항원-결합 부분, 및 나머지 "Fc" 절편을 생성한다. 특정 항체 절편의 검토를 위해서는, Hudson, P. J., 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134를 참고하라.
항체 절편은 재조합 수단에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 절편은 모두 예를 들어 E. coli에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있으며, 따라서, 이러한 절편을 다량으로 제조하는데 용이하게 된다. 항체 절편은 표준 절차를 따라서 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편은 E. coli로부터 직접 회수할 수도 있다 (Carter, P., 등, Bio/Technology 10 (1992) 163-167). 또한, 항체 절편을 발현시키고 (필요한 경우) 이를 분비하게 하는데, 포유동물 세포 시스템이 사용될 수도 있다.
표적
세포 표면 분자 및/또는 이들의 리간드에 대한 다수의 치료용 항체가 알려져 있다. 이러한 항체는 다중-특이적 분자 내의 맞춤-제작된 특이적 인식 결합 모이어티의 선별 및 제조에 사용될 수 있다. 예로는 블리나투모맙/BLINCYTO 리툭산/맙테라/리툭시맙, H7/오크렐리주맙, 제발린/이브리주모맙, 아르제라/오파투무맙 (CD20), HLL2/에프라투주맙, 이노투조맙 (CD22), 제나팍스/다클리주맙, 시뮬렉트/마실리시맙 (CD25), 허셉틴/트라스투주맙, 페르투주맙 (Her2/ERBB2), 마일로타르/겝투주맙 (CD33), 랍티바/에팔리주맙 (Cd11a), 에르비툭스/세툭시맙 (EGFR, 표피 성장 인자 수용체), IMC-112Ⅰb (VEGF 수용체 2), 티사브리/나탈리주맙 (α4β1 및 α4β7 인테그린의 a4-하위 단위), 레오프로/압식시맙 (gpⅡb-gpⅡa 및 αβ3-인테그린), 오르토클론 OKT3/무로모납-CD3 (CD3), 벤라이스타/벨리무맙 (BAFF), 톨렉스/오텔릭시맙 (CD3), 솔리리스/데쿨리주맙 (C5 보체 단백질), 악템라/토실리주맙 (IL-6R), 파노렉스/에드레콜로맙 (EpCAM, 상피 세포 접착 분자), CEA-CAM5/라베투주맙 (CD66/CEA, 암배아 항원), CT-11 (PD-1, 프로그램화 세포 사멸-1 T-세포 저해 수용체, CD-d279), H224G11 (c-Met 수용체), SAR3419 (CD19), IMC-A12/식수투무맙 (IGF-1R, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체), MEDI-575 (PDGF-R, 혈소판-유래 성장 인자 수용체), CP-675, 206/트레멜리무맙 (세포독성 T 림프구 항원 4), R05323441 (태반 성장 인자 또는 PGF), HGS1012/마파투무맙 (TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), 베도틴 (SGN-35)/브렌툭시맙 (CD30), 및 ARH460-16-2 (CD44)를 포함한다.
본원에 기재된 다중-특이적 결합 분자/다중-특이적 항체는, 예를 들어 암 질병, 심혈관성 질병, 감염성 질병, 염증성 질병, 자가면역 질병, 대사성 (예를 들어, 내분비성) 질병, 또는 신경성 (예를 들어 신경퇴화성) 질병의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 질병의 예시적인 비-제한적인 예에는, 알츠하이머 병, 비-호지킨 림프종, B-세포 급성 및 만성 림프구 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 모발상 세포 백혈병, 급성 및 만성 골수성 백혈병, T-세포 림프종 및 백혈병, 다중 골수종, 신경교종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 암종 (예컨대, 구강, 위장관, 결장, 위, 폐관, 폐, 유방, 난소, 전립선, 자궁, 자궁 내막, 자궁 경부, 방광, 췌장, 뼈, 간, 담낭, 신장, 피부, 및 고환의 암종), 흑색종, 육종, 신경교종, 및 피부암, 급성 특발 혈소판감소 자색반증, 만성 특발 혈소판감소 자색반증, 피부근염, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반성 난창, 홍반성 신장염, 류마티스 열, 다선성 증후군, 수포성 유사천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반증, 연쇄상구균 감염후 신장염, 결절 홍반, 타카야수 동맥염, 에디슨 병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스처 증후군, 폐색성 혈전혈관염, 쇼그렌증후군, 원발성 담즙성 경변증, 하시모토병, 갑상선 중독증, 피부경화증, 만성 활동성 간염, 다발성근염/피부근염, 다발연골염, 심상성천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장염, 근위축성 측색경화증, 척수 매독, 거대 세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 급속진행성 신염, 건선, 또는 섬유성 폐렴이 있다.
다수의 세포 표면 마커 및 이들의 리간드가 알려져 있다. 예를 들어, 암세포는 이하의 세포 표면 마커 및/또는 리간드들 중 적어도 하나를 발현하는 것으로 보고되어 왔으며, 이는 탄산무수화효소 IX, 알파-페토단백질, 알파-ctinin-4, (A33 항체에 대해 항원 특이적인) A3, ART-4, B7-1, B7-H1, Ba-733, BAGE, BrE3-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CDla, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-Ⅰa, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD137, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CTLA-4, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1-α, 결장-특이적 항원-p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvⅢ, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, 엽산 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모성 고나도트로핀 (HCG) 및 이의 서브유닛, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자 (HIF-1), HSP70-2M, HST-2 또는 la, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), KC4-항원, KS-l-항원, KS 1-4, LAG3, Le-Y, LDR/FUT, 대식세포 이동 저해 인자 (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-Ⅰa, MIP-Ⅰb, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, 췌장암 뮤신, PD-1 및 이의 수용체, PD-L1, PD-L2, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 전립선 산성 인산분해효소, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, 5100, 서바이빈, 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신, TIM3(T-세포 이뮤노글로빈 및 뮤신-도메인 함유-3), TRAIL 수용체, TNF-α, Tn-항원, 톰슨-프리덴라이히 항원 (Thomson-Friedenreich antigen), 종양 괴사 항원, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관신생형성 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, 종양 유전자 마커 및 종양 유전자 산물을 포함하나 (예를 들어, Sensi 등, Clin. Cancer Res. 12 (2006) 5023-5032; Parmiani 등, J. Immunol. 178 (2007) 1975-1979; novellino 등, 암 Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207를 참고하라), 이에 제한되지 않는다. 따라서, 이러한 특이적 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드를 인식하는 항체는, 본 발명의 다중-특이성 분자 내의 특이적이고 선택적인 인식 결합 모이어티, 질병과 관련된 다수의/수많은 세포 표면 마커 또는 리간드에 대한 표적화 및 결합에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 암/종양의 치료를 위하여, 다중-특이적 결합 분자/다중-특이성 항체는 표적 종양-연관 항원 (TAA), 예컨대 Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cancer", 페이지 347 (미국 임상 화학 협회, 1979) 및 미국 특허 제4,150,149호; 미국 특허 제4,361,544호; 및 미국 특허 제4,444,744호에서 보고된 것을 사용한다.
종양 연관 항원에 대한 보고는 Mizukami 등, Nature Med. 11 (2005) 992-997; Hatfield 등, Curr. Cancer drug targets 5 (2005) 229-248; Vallbohmer 등, J. Clin. Oncol. 23 (2005) 3536-3544; 및 Ren 등, Ann. Surg. 242 (2005) 55-63)을 포함하며, 이들 각각은 식별된 TAA에 관한 참고로서 본원에 통합된다. 질병이 림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환과 관련된 경우, 표적화 항원은 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 또는 la, HM1.24, HLA-DR, 테나신, VEGF, P1GF, ED-B 피브로넥틴, 종양 유전자, 종양 유전자 산물 (예를 들어, c-met 또는 PLAGL2), CD66a-d, 괴사 항원, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) 및 L-R2 (DR5)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기-언급한 항원에 대한 항체는 본 발명의 이중 특이적 항체를 제조하기 위한, 결합 부분 또는 모이어티로 사용될 수 있다. 다수의 이중 특이적 항체는 2개의 상이한 표적들에 대해 제조될 수 있다.
항원 쌍의 예는 CD19/CD3, BCMA/CD3, HER 계열의 상이한 항원(EGFR, HER2, HER3)의 조합, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1β-/IL-8, IL-6 또는 IL-6R/IL-21 또는 IL-21R, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c-FMS/CSFlR, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-키트, BCR)로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원들의 조합, 인테그린, 및 (VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 및 안지오포이에틴로 이루어지는 군으로부터 선택된 수용성 리간드를 갖는 MMP, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-IR, IL 17A/F, EGF 수용체 1/CD3, 및 CD19/CD16)를 포함한다. 이중 특이적 항체의 추가적인 예는, (i) 루이스 x-, 루이스 b- 및 루이스 y-구조, 글로보 H-구조, KH1, Tn-항원, 뮤신의 TF-항원 및 탄수화물 구조, CD44, 당지질 및 당스핑고지질, 예컨대 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 및 사이알릴테트라오실세라미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원의 당 에피토프로 유도되는 제1 특이성, 및 (ii) EGFR, HER2, HER3 및 HER4로 이루어지는 군으로부터 선택된 ErbB 수용체 티로신 키나아제로 유도되는 제2 특이성을 가질 수 있다. 제2 항원 결합 부분와 조합된 GD2는, T-림프구, NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식 세포, 호중구, 간엽 줄기세포, 신경 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역 세포와 연결된다.
단일 특이성 또는 이중 특이적 항체는 본원에 기재된 방법을 사용하여, 또 다른 단일 특이성 또는 이중 특이적 항체와 함께 연결되어, 다중-특이적 항체를 제조할 수 있다. 이미 이용가능한 단일 특이성 또는 이중 특이적 치료 결합 엔티티, 예컨대 상기 기재된 이들 치료 항체를 사용함으로써, 필요한 다중-특이적 결합 분자의 신속하고 용이한 제조가 이루어질 수 있다. 2 이상의 상이한 에피토프에 대한 동시 표적화 및 결합을 위해 2 이상의 단일 치료 분자를 조합함에 의한 다중-특이적 치료의 이러한 맞춤-제작된 생성으로, 단일 치료 분자에 비해 추가적/시너지 효과를 기대할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이성 분자는 특히 이하의 표적 쌍과 상호작용하고 이에 대한 측정가능한 결합성을 나타내는 항체 쌍을 사용하여 제조되었다.
바람직한 구현예에서, 이중 특이적 분자는 각각 특히 CD3 및 CD19과 상호작용하여 이에 대한 측정가능한 친화도를 나타내는, 2개의 항체 또는 이의 항원-결합 절편들의 컨쥬게이트이다. 상기 항체는 각각 1×lO-6 M 이하, 예를 들어, 1×lO-7 M, 5ХlO-8 M, 1ХlO-8 M, 5ХlO-9 M, 1ХlO-9 M 이하의 KD, 또는 1×lO-8 M 내지 1×lO-10 M의 KD로, 인간 CD3 또는 CD19에 결합한다. 항원에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 에세이가 당업계에 알려져 있는데, 이는 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함한다. 항체의 결합 속도론 (예를 들어, 결합 친화도)은 또한 당업계에 알려진 표준 에세이, 예컨대 바이아코어(Biacore) 분석에 의해 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 또는 제2 인식 결합 모이어티는 관심 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 상응하는 CDRl, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 예를 들어, 각각의 인식 결합 모이어티는 단쇄 항체 Fv 부위 (scFv)일 수 있다. CDR 부위는 카밧 시스템 (Kabat, E. A., 등 (1991) Sequence of Proteins of Immune Interest, 5판, U.S. 미 보건국, NIH 간행물 제91-3242호)을 사용하여 상세히 기술된다. 항-CD3 scFv 및 항-CD19 scFv의 아미노산 서열이 이하에 나열되어 있다.
항-CD3 scFv 서열 (서열번호 1):
항-CD19 scFv 서열 (서열번호 2):
변형
일부 구현예에서, 항체의 VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 나열된 서열과 82%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치할 수 있고, 상응하는 항원-결합 활성 및 특이성을 보유한다. 상기 나열된 서열의 VH 및 VL 부위와 높은 (즉, 80% 이상의) 동일성을 갖는 VH 및 VL 부위를 갖는 항체는, 상기 언급된 중쇄 및 경쇄, 또는 관련된 CDR1, CDR2 및 CDR3를 암호화하는 핵산 분자의 돌연변이화 (예를 들어, 부위-특이적 또는 PCR-매개 돌연변이화), 및 이후 본원에 기술된 기능성 에세이를 사용하여 상기 암호화된 변형 항체를 보유된 기능에 대해 시험함으로써 얻을 수 있었다.
본원에서 사용된 2개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은, 2개의 서열 간의 퍼센트 동일성과 같다. 2개의 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열들 간에 공유되는 동일한 위치의 수의 함수 [즉, % 동일성= (동일한 위치의 #/위치의 총 #)×100]이며, 각 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하고, 이는 2개의 서열의 최적 배열을 위해 도입될 필요가 있다. 2개의 서열들 간의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은, 이하의 비-제한적인 예에 기재된 바와 같은, 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다.
2개의 아미노산 서열들 간의 퍼센트 동일성은, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 [Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]에 의해 결정될 수 있으며, PAM120 중량 잔기 테이블 (weight residue table), 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하였다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 간의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com)에 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘 (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 을 사용하여 결정될 수 있는데, 이는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 패널티, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 패널티를 사용하였다.
추가적 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 추가로 "문의 (query) 서열"로 사용되어, 예를 들어, 관련 서열을 식별하기 위한 공공 데이터베이스에서의 서치를 수행할 수 있다. 상기 서치는 Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 분자와 동일한 아미노산 서열을 얻기 위한 BLAST 단백질 서치는, XBLAST 프로그램, 스코어=50, wordlength=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해서는, 갭 BLAST는 Altschul 등, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 변수들이 사용될 수 있다 (www.ncbi.nlm.nih.gov 참고).
특정 구현예에서, 본 발명의 인식 결합 모이어티는 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위, 및 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하며, 여기에서 이러한 CDR 서열들 중 하나 이상은 본원에 기재된 바람직한 항체 또는 이들의 보존적 변형체를 기준으로 특이적인 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 항체는 원하는 기능적 특성을 보유한다.
본원에 사용되는 용어 "보존적 서열 변형"은, 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 상당히 영향을 주거나 또는 이들을 변형시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 알려진 표준 기술, 예컨대 부위-지향적 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 상기 아미노산 잔기의 계열은 당업계에서 정의되어 있다. 이러한 계열은 이하의 것들을 포함한다:
염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘),
산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산),
비전하 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판),
비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌),
베타-분기형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및
방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘).
따라서, 본 발명의 항체의 CDR 부위 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 상기 변형된 항체는 본원에 기재된 기능적 에세이를 사용하여 보유된 기능에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 인식 결합 모이어티는 변형된 항체를 조작하기 위한 개시 물질로서 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 개시 항체로부터 변형된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 양쪽 가변 부위 (즉, VH 및/또는 VL)의 내부, 예를 들어 하나 이상의 CDR 부위의 내부 및/또는 하나 이상의 프레임워크 부위의 내부에 있는 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 불변 부위(들) 내부의 잔기를 변형함으로써 조작되어, 예를 들어 항체의 효과기 기능(들)을 변형시킬 수 있다.
수행될 수 있는 가변 부위 조작의 한 유형은 CDR 그래프팅이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용을 한다. 이러한 이유로, CDR 내부의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다, 개별 항체들 간에 더 널리 퍼져있다(more diverse). CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하므로, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체 유래의 프레임워크 서열로 그라프트된, 특이적 자연발생적 항체 유래의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써, 특이적 자연발생적 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, Riechmann, L. 등 (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. 등 (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. 등 (1989) Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033; Winter에 대한 미국 특허 제5,225,539, 및 Queen에 대한 미국 특허 제 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 370 등을 참고하라).
이러한 프레임워크 서열은 생식세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고 문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자의 생식세포 DNA 서열은, "VBase" 인간 생식세포 서열 데이터베이스 (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 사용가능), 뿐만 아니라 Kabat, E. A., 등 (1991) Sequence of Protein of Immune Interest, 5판, 미 보건국, NIH 간행물 제91-3242호; Tomlinson, I. M., 등 (1992) "The Repertoire of Human Germ Cell VH Sequence reveals about Fifty Groups of VH Segments with Diffrent Hypervariant Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. 등 (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in Its Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836에서 찾을 수 있고; 상기 문헌 각각의 내용은 참고로서 본원에 포함된다. 또 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자에 대한 생식세포 DNA 서열은 GenBank 데이터베이스에서 발견할 수 있다.
프레임워크 또는 CDR 부위의 내부에 만들어진 변형에 대한 추가 또는 대안으로, 본 발명의 항체는 Fc 부위 내부에 변형을 포함하도록 조작되어, 통상 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포 독성을 변형시킬 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형되거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있거나) 또는 이의 당화를 변형시키도록 개질되고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변형시키도록 개질될 수 있다. Fc 부위의 잔기의 계수는 카밧의 EU 인덱스에 따른다.
또 다른 구현예에서, 항체의 당화가 변형될 수 있다. 당화는 예를 들어, 항원 또는 Fc 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가 또는 감소시키도록 변형될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내부의 하나 이상의 당화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 부위 프레임워크 당화 부위를 제거시킴으로써 그 부위의 당화를 제거하는, 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 이러한 접근은 미국 특허 제8008449호 및 제6350861호에 추가로 상세히 기재되어 있다.
효과기
일부 구현예에서, 다중-특이성 화합물 또는 분자는 하나 이상의 효과기 모이어티, 예를 들어 세포독성 제제, 예컨대 화학 치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 절편), 또는 방사능 동위원소에 추가로 컨주게이션될 수 있다.
일부 구현예에서, 효과기 모이어티는 마이탄시노이드 (미국 특허 제5,208,020호, 미국 특허 제5,416,064호, EP 0 425 235 참고), 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF, 미국 특허 제5,635,483호, 미국 특허 제5,780,588호, 미국 특허 제7,498,298호 참고), 돌라스타틴, 칼리케아미신 또는 이의 유도체 (미국 특허 제5,712,374, 미국 특허 제5,714,586호, 미국 특허 제5,739,116호, 미국 특허 제5,767,285호, 미국 특허 제5,770,701호, 미국 특허 제5,770,710호, 미국 특허 제5,773,001호, 미국 특허 제5,877,296호, Hinman, L. M., 등, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342, Lode, H. N., 등, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928 참고), 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz, F., 등, Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523, Jeffrey, S. C, 등, Bioorg. Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362, Torgov, M. Y., 등, Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721, Nagy, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834, Dubowchik, G. M., 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 1529-1532, King, H. D., 등, J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343, 및 미국 특허 제6,630,579호 참고), 메토트렉세이트, 빈데신, 탁산, 예컨대 도데탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀, 트리코테센, 및 CC1065을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는 약물이다.
다른 구현예에서, 효과기 모이어티는 효소 활성 독소 또는 이의 절편일 수 있는데, 이는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 사슬 [슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa 유래], 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노모르디카 카란티아 (monordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 겔로닌, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다.
다른 일부 구현예에서, 효과기 모이어티는 방사능 활성 원자일 수 있다. 여러가지 방사능 동위원소는 방사능 컨쥬게이트의 제조로부터 이용가능하다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Rel88, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사능 동위원소가 포함된다. 방사능 컨쥬게이트가 탐지를 위해 사용되는 경우, 이는 신티그래피 연구(scintigraphic studies)를 위한 방사능 활성 원자, 예를 들어 Tc99 또는 1123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 이미지화 [또한 자기 공명 이미지화 (MRI)라고도 알려짐]를 위한 스핀 라벨, 예컨대 I123 다시, I131, In111, F19, C13, N15, O17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
효과기 모이어티는 여러가지 2관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl)의 2관능성 유도체, 활성 에스테르 (예컨대, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 요소 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산 디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌 디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 성분 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 사용하여, 본원에 기재된 다중-특이적 화합물 또는 분자의 어느 요소에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta, E. S., 등, Science 238 (1987) 1098-1104에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA)는 방사능 뉴클레오티드의 착체로의 컨쥬게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참고). 본원에서 보고된 독성 모이어티의 착체로의 컨쥬게이션을 위한 링커는 세포 내의 세포독성 약물 유출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커, 또는 디설파이드-함유 링커 (Chari, R. V., 등, Cancer Res. 52 (1992) 127-131, 미국 특허 제5,208,020)일 수 있다.
(BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 시판 중인 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트) (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. 사, 미국 롤포드 111 소재)를 포함하나 이에 제한되지 않는) 효과기 모이어티는, 본원에 개시된 다중-특이적 화합물 또는 분자에 컨쥬게이트될 수 있으나, 가교-결합 링커 시약에 의해 제조된 이러한 컨쥬게이트에 제한되지 않는다.
조성물
본 발명은 또한 조성물, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 다중-특이적 분자를 함유하는 약학적 조성물도 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 CD 13 및 CD9 모두에 결합하는 다중-특이적 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 다중-특이적 분자 (Remington's 약학적 Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980))를, 동결 건조 제제 또는 수용액 형태의 선택적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합됨으로써 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수여체에 대해 비독성이며, 버퍼, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10개 미만의 잔기) 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로빈; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르베이트; 염-형성 카운터-이온, 예컨대 소듐; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN, PLURONICS, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
제형은 또한 치료될 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 제형은 추가로 또 다른 항체, 세포독성 제제, 또는 화학 치료제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절히 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내의 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's 약학적 Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는, 다중-특이적 분자를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 메트릭스를 포함하는데, 상기 메트릭스는 성형체 형태, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐이다. 서방성 메트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (미국 특허 제3773919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성되는 주사용 미소구체), 및 폴리-D-(--)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산이 100일에 걸쳐 분자를 유출할 수 있는 반면, 특정 하이드로겔 유출 단백질은 더 짧은 시기 동안 유출할 수 있다.
포획된 항체가 장기간 동안 체내에 잔류하는 경우, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성되거나 또는 응집되어, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화가 발생한다. 합리적인 전략은 관련되는 기전에 따른 안정화에 맞게 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 상호교환을 통해 분자간 S-S 결합이 형성되는 것으로 발견되는 경우, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결 건조하고, 수분 함량을 조절하고, 적합한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 병용 치료, 즉 다른 제제와 조합되어, 투여될 수 있다. 병용 치료에 사용될 수 있는 치료제의 예는 이하에 더욱 상세히 기재되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 활성 분자를 하나의 성분 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 용매 중에 포함시키고, 그 후 필요한 경우 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산체는 활성 화합물을 기본 분산체 배지 및 상기 나열된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조의 바람직한 방법은 진공 건조 및 동결-건조 (동결 건조)이며, 이에 의해 활성 성분＋ 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 어느 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성한다.
투여량
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은, 치료되는 피험체 및 특정 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 이 양은 약학적으로 허용가능한 담체와 조합될 때, 100 퍼센트 중에, 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 활성 성분의 범위, 바람직하게는 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 활성 성분일 것이다.
투여량 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여되거나, 시간의 경과에 따라 몇 개로 분할된 투여량이 투여되거나, 또는 상기 투여량은 치료 상황의 긴박성에서 나타나는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 쉬운 투여 및 투여량의 균일성을 위한 투여 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 기재된 투여 단위 형태는 투여될 피험체에 대한 통합 투여량으로 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 지칭하며; 각 단위는 원하는 치료 효과를 생성하도록, 필요한 약학적 담체과 함께 계산된 사전-결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여량 단위 형태의 상세는 (a) 달성될 활성 화합물의 독특한 특징 및 특정 치료 효과, 및 (b) 개인의 치료 감수성을 위해 이러한 활성 화합물을 제형화하는 업계에서 원래 갖고 있던 제한에 의해 결정되며, 직접적으로 이에 따라 달라진다.
본 발명의 다중-특이성 분자의 투여를 위해서는, 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/숙주 체중 kg, 및 더욱 통상적으로는 0.01 내지 50mg/kg의 범위이다. 예를 들어 투여량 0.3mg/kg 체중, 1mg/kg 체중, 3mg/kg 체중, 5mg/kg 체중 또는 10mg/kg 체중, 또는 1-10mg/kg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주당 2회, 1주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회, 4주당 1회, 한달에 1회, 3개월당 1회, 또는 3 내지 6 개월당 1회의 투여를 수반한다. 본 발명의 다중-특이적 분자를 위한 바람직한 투여량 요법은 정맥내 투여를 퉁한 1mg/kg 체중 또는 3mg/kg 체중을 포함하며, 다중-특이성 분자는 이하의 투여 스케줄들 중 하나를 사용하여 부여된다: (i) 6회 투여 동안은 4주마다 1회, 및 이후 3개월당 1회; (ii) 3주마다 1회; (iii) 3mg/kg 체중의 1회 투여, 및 이후 3주마다 1mg/kg 체중의 1회 투여.
대안적으로, 다중-특이성 분자는 서방성 제제로 투여될 수 있고, 이 경우 덜 빈번한 투여가 욕된다. 투여량 및 빈도는 환자 내의 다중-특이적 분자의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체는 최장 반감기를 나타내었고, 그 다음이 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체였다. 투여의 투여량 및 빈도는 치료가 예방적 또는 치료인식에 따라서 가변될 수 있다. 예방적 응용에서, 비교적 저 투여량은 장기간에 걸쳐 비교적 드문드문한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 이들의 나머지 수명 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 응용에서, 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량은 때때로, 질병의 전개가 감소하거나 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 요구된다. 이후, 환자는 예방적 요법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에 대한 독성 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 모드에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 양의 활성 성분을 얻도록 가변될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출률, 치료의 지속시간, 이용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 조건, 치료되는 환자의 종합 건강 및 이전 의료 기록, 및 의학 분야에 잘 알려진 유사한 인자를 포함하는, 여러가지 약물동태학적 인자에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 다중-특이적 분자의 "치료 유효 투여량"은, 바람직하게는 질병 증상의 심각성 감소, 질병 증상이 없는 시기의 빈도 및 지속 시간의 증가, 또는 질병 피해에 기인한 장애 및 결함의 방지를 가져온다. 예를 들어, 종양 치료를 위해서는, "치료 유효 투여량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장 또는 전이를 비처리 피험체 대비 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 제제 또는 화합물의 종양 성장 억제 능력은 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있는데, 이로써 인간에서 종양의 효능을 예측할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 화합물의 억제 능력, 예컨대 당업계의 숙련자들에게 알려진 에세이에 의한 시험관내 억제를 조사함으로써 평가될 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 종양 크기, 전이를 감소시킬 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 피험체에서 증상을 개선시킬 수 있다. 당업계의 숙련자는 피험체 크기, 피험체 증상의 심각성, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 이러한 인자를 기준으로 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
투여
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 여러 가지 방법들 중 하나 이상을 사용하는 하나 이상의투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에게는 자명한 바와 같이, 경로 및/또는 투여 모드는 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체의 투여의 바람직한 경로는 들어 주사 또는 주입에 의한, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 투여의 다른 비경구 경로를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는, 통상 장관 및 국소 투여가 아닌 주사에 의한 다른 투여 모드를 의미하며, 이는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안화내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 다중-특이성 분자는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질내, 직장내, 설하 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다.
활성 화합물은 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 임플란트, 경피 패치를 포함하는 조절 방출 제제, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템과 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았고, 일반적으로 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Relase Drug Delivery System, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NewYork, 1978를 참고하라.
치료 조성물은 당업계에 알려진 의학 장치에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 조성물은 바늘이 없는 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 제5399163호, 제5383851호, 제5312335호, 제5064413호, 제4941880호, 제4790824호, 및 제4596556호에 기재된 장치들에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘-알려진 임플란트 및 모듈의 예에는, 미국 특허 제4487603호, 제4486194호, 제4447233호, 제4447224호, 제4439196호, 및 제4475196호에 기재된 것들이 포함된다. 이러한 특허는 본원에 참고로 통합되어 있다. 많은 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다.
치료 방법
일 측면에서, 본 발명은 상기-기재된 다중-특이성 분자를 사용하여 피험체를 생체내 치료하여, 암 종양의 성장 및/또는 전이를 억제하는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 성장을 저지하고 및/또는 피험체에서 종양 세포의 전이성 전파를 제한하는 방법을 제공하는데, 이는 치료 유효량의 다중-특이성 분자를 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.
치료에 바람직한 암의 비-제한적인 예에는, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 유방암, 난소암, 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 직장암 (예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선암 (예를 들어 호르몬 난치성 전립선 선암종), 결장암 및 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암)이 포함된다. 추가적으로, 본 발명은 그 성장이 본 발명의 항체를 사용하여 억제될 수 있는 난치성 또는 재발성 악성 종양을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 다른 암의 예에는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁 내막의 암종, 자궁 경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨 질병, 비-호지킨 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경암, 유아의 고형암, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생형성, 척추 축 종양, 뇌간 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평상피세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도되는 것을 포함하는 환경 유도성 암, 및 상기 암들의 조합이 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "피험체"는, 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비-인간 동물은 모든 척추 동물, 예를 들어 포유동물 및 비- 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류을 포함하나, 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말이 바람직하기는 하다. 바람직한 피험체는 면역 반응의 강화가 필요한 인간 환자를 포함한다. 상기 방법은 특히 면역 반응을 증가시킴으로써 치료할 수 있는 질병을 갖는 인간 환자의 치료에 적합하다.
상기 치료는 또한 표준 암 치료와 조합될 수도 있다. 예를 들어, 이는 화학치료 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 투여되는 화학치료제의 투여량을 줄이는 것이 가능해질 수 있다 (Mokyr, M. 등 (1998) Cancer Research 58: 5301-5304).
숙주 면역 반응성을 활성화하는데 사용될 수 있는 다른 항체는, 본 발명의 다중-특이적 분자와 조합하여 사용될 수 있다. 이것은 DC 기능 및 항원 제시를 활성화하는 수지상 세포의 표면에 대한 분자 표적화를 포함한다. 예를 들어, 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 효과적으로 대체할 수 있고 (Ridge, J. 등 (1998) Nature 393: 474-478), 본 발명의 다중-특이적 분자와 함께 사용될 수 있다 (Ito, N. 등 (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). 유사하게, 항체 표적화 T 세포 공동 자극 분자, 예컨대 CTLA-4 {예를 들어, 미국 특허 제5,811,097), CD28 (Haan, J. 등 (2014) Immunology Letters 162:103-112), OX-40 (Weinberg, A. 등 (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-ⅠbB (Melero, I. 등 (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), 및 ICOS (Hutloff, A. 등 (1999) Nature 397: 262-266) 또는 항체 표적화 PD-1 (미국 특허 제8008449호) PD-1L (미국 특허 제7943743호 및 제8168179호)는 또한 T 세포 활성화의 증가된 수준을 제공할 수도 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 다중-특이적 분자는 항신생물 항체, 예컨대 아스리툭산 (리툭시맙), 허셉틴 (트라스투주맙), BEXXAR (토시투모맙), 제발린 (이브리투모맙), CAMPATH (알렘투주맙), LYMPHOCIDE (에프르투주맙), AVASTIN (베바시주맙), 및 TARCEVA (에를로티닙) 등과 함께 사용될 수 있다.
용어의 정의
용어 "펩티드," "폴리펩티드," 및 "단백질"은, 본원에서 중합체 내의 아미노산 잔기의 배열을 설명하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 희귀한 아미노산 및 합성 아미노산 유사체 외에, 표준 20개의 자연발생적 아미노산으로 구성될 수 있다. 이들은 길이 또는 번역후 변형 (예를 들어, 당화 또는 인산화) 여부와 무관하게, 아미노산의 어느 사슬일 수 있다.
"재조합" 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된; 즉, 원하는 펩티드를 암호화하는 외인성 DNA 작제물에 의해 형질전환된 세포에서 생산된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. "합성" 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 화학적 합성에 의해 제조된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대한 용어 "재조합"은, 참고로 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 개질에 의해 변형되거나, 또는 변형된 세포로부터 유래된 것을 말한다.
상기 언급된 서열 및 이종 서열 중 하나 이상을 함유하는 융합 단백질은 본 발명의 범주 내에 있다. 이종 폴리펩티드, 핵산, 또는 유전자는 외래종으로부터 기원한 것이거나, 또는 동일한 종인 경우 이의 원래 형태로부터 실질적으로 변형된 것이다. 2개의 융합된 도메인 또는 서열은, 이들이 자연발생적 단백질 또는 핵산에서 서로 인접하지 않는 경우 서로 이종이다.
"단리된" 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은, 자연적으로 연관된 다른 단백질, 지질 및 핵산으로부터 분리된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 폴리펩티드/단백질은 정제된 제제의 건조 중량을 기준으로 적어도 10% (즉, 10% 내지 100%의 어느 퍼센트, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 및 99%)를 구성한다. 순도는 어느 적합한 표준 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 기재된 단리된 폴리펩티드/단백질은 천연 공급원으로부터 정제되거나, 재조합 DNA 기술, 또는 화학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
"항원"은 면역 반응을 유도하거나 또는 그 반응 산물에 결합하는 물질을 지칭한다. 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포가 결합하는 항원의 부위를 지칭한다.
본원에서 사용된 "항체"는 최광의로 사용되며, 특히 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함), 다클론성 항체, 다중-특이적항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 항체 절편을 포함한다.
본원에서 사용된 "항체 절편"은 온전한 항체의 일부를 포함할 수 있으며, 일반적으로 이는 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 부위 및/또는 FcR 결합 능력을 보유하는 항체의 Fc 부위를 포함한다. 항체 절편의 예는 선형 항체; 단-쇄 항체 분자; 및 항체 절편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체 절편은 IgG 중쇄의 전체 가변 부위를 보유하며, IgG 경쇄를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 절편" 또는 "Fc 부위"는, 이뮤노글로빈 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는, 실질적으로 동종의 항체 군집으로부터 얻은 항체, 즉, 적은 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 개별 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위로 유도된다. 추가로, 통상 상이한 결정기 (에피토프)로 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 종래의 (다클론성) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기로 유도된다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 동종 군집으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며, 어느 특정 방법에 의한 항체 제조를 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 먼저 Kohler 및 Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975) (본원에서 참고로 통합됨)에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참고, 본원에서 참고로 통합됨)에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 또한 예를 들어 Clackson 등, Nature, 352, 624-628 (1991) 및 Marks 등, J Mol Biol, 222, 581-597 (1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있으며, 상기 문헌은 각각 본원에서 참고로 통합된다.
본원에서 단일클론 항체는 특히 "키메라" 항체 (이뮤노글로빈)를 포함하는데, 이는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 유래, 또는 특정 항체 유형 또는 하위 유형에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 동종인 반면, 상기 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종 유래 또는 다른 항체 유형 또는 하위 유형, 뿐만 아니라 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 절편이 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 동종이다. (미국 특허 제4,816,567호; Morrison 등, Proc Natl Acad Sci USA, 81, 6851-6855 (1984); Neuberger 등, Nature, 312, 604-608 (1984); Takeda 등, Nature, 314, 452-454 (1985); 국제특허출원 PCT/GB85/00392 참고, 상기 각각은 본원에서 참고로 통합됨).
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는, 비-인간 이뮤노글로빈으로부터 유래하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화 항체는 이의 수여체의 초가변 부위로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 용량을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 부위로부터의 잔기로 대체되는, 인간 이뮤노글로빈 (수여체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로빈의 Fv 프레임워크 부위 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수여체 항체 또는 공여체 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 인간화 항체는 적어도 하나, 통상 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로빈의 초가변 루프에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 이뮤노글로빈 서열의 FR 잔기에 해당한다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 이뮤노글로빈 가변 부위 (Fc), 통상 인간 이뮤노글로빈의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가적인 상세 사항에 대해서는, Jones 등, Nature, 321, 522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332, 323-329 (1988); Presta, Curr Op Struct Biol, 2, 593-596 (1992); 미국 특허 제5,225,539호를 참고하고, 상기 문헌 각각은 본원에서 참고로 통합된다.
"인간 항체"는 완전 인간 서열을 갖는 어느 항체를 지칭하는데, 이는 예컨대 인간 항체 서열을 발현하는 인간 하이브리도마, 인간 파지 디스플레이 라이브러리 또는 형질전환 마우스로부터 수득될 수 있다.
용어 "약학적 조성물"은 담체, 불활성 또는 활성을 갖는 활성 제제의 조합을 지칭하며, 생체내 또는 생체외에서의 진단 또는 치료 용도에 특히 적합하게 한다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는, 생리학적으로 양립가능한 용매, 분산 매체, 코팅, 항박테리아 및 항진균 제제, 등장성 및 흡수 지연제, 등의 어느 것 또는 모든 것을 포함한다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 이후 피험체에 또는 피험체 상에 투여되고, 바람직하지 않은 생리학적 효과를 유발하지 않는다. 약학적 조성물 중의 담체는 또한 활성 성분과 양립가능하며, 이를 안정화할 수 있다는 의미에서 "허용 가능해야" 한다. 하나 이상의 용해제는 활성 제제의 전달을 위한 약학적 담체로서 사용될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예에는, 투여 형태로서 유용한 조성물을 달성하기 위한 생체적합성 비히클, 보조제, 첨가제, 및 희석제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 다른 담체의 예는 콜로이드성 실리콘 옥사이드, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 및 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 추가적인 적합한 약학적 담체 및 희석제, 뿐만 아니라 이들의 용도를 위한 약학적 필수품이, 레밍턴의 약학 과학에 기재되어 있다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 투입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 치료 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"은, 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하나, 원치않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, Berge, S. M., 등 (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19를 참고하라).
본원에 사용된 용어 "세포독성 제제"는, 세포의 기능을 억제 또는 방지하고, 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사능 동위원소 {예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사능 동위원소), 화학 치료제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성 독소 (이들의 절편 및/또는 변이체 포함)를 포함하는 것으로 의도된다.
"화학 치료제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학 치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드, 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오마르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로수우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 예를 들어, AgnewChem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994) 참고]; 다이네미신 A을 포함하는 다이네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 마우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 디옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 마이토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사 물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데모콜신; 디아지퀴온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대 메이타신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다졸; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도실린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 라이족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도데탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 마이톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미놉테린; 젤로다; 이단트로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 약학적으로 허용가능한 염, 이들의 어느 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 이러한 정의 내에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 역할을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤)을 포함하는 항-에스트로겐제; 및 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린; 및 약학적으로 허용가능한 염, 이들의 어느 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 질환, 질환의 증상, 질환 후의 질병 상태, 또는 질환에 대한 소인(predisposition)을 치료, 완화, 경감, 해결, 발병 지연, 예방 및 개선시킬 목적으로, 질환을 갖거나 또는 질환의 위험성이 있는 환자에 화합물 또는 제제를 투여하는 것을 지칭한다.
"유효량"은 치료된 피험체에 치료 효과를 부여하는데 요구되는 활성 화합물/제제의 양을 지칭한다. 유효 투여량은 당업계의 숙련자들도 알고 있듯이, 치료된 병태의 유형, 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 치료적 처치와의 병행 사용 가능성에 따라 달라질 것이다. 신생물 병태를 치료하기 위한 조합의 치료 유효량 은 비처리 동물에 비해 예를 들어, 종양 크기 감소, 종양 증식소(foci) 수의 감소를 유발하거나, 또는 종양 성장을 늦추게 되는 양이다.
본원에 기재된 바와 같이, 다수의 범위의 값들이 제공된다. 문맥상 명백히 달리 기재된 바 없는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에서 하한 범위의 1/10이 특히 기재되는 것으로 이해된다. 어느 언급된 값 또는 상기 언급된 범위 내의 개재 값들과, 어느 다른 언급된 값 또는 상기 언급된 범위 내의 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위도, 본 발명에 포함된다. 이러한 소범위의 상한 및 하한은 독립적으로 상기 범위 내에 포함되거나 또는 제외될 수 있으며, 상기 상한 및 하한 중 어느 하나, 둘 모두가 포함되지 않거나, 또는 둘 모두가 소범위 내에 포함되는 각 범위도 또한 본 발명 내에 포함되며, 상기 언급된 범위 내에서 임의로 특히 배제된다. 상기 언급된 범위가 상기 상한 및 하한 중 하나 또는 둘을 포함하는 경우, 상한 및 하한 중 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제하는 포함된 이러한 범위도 또한 본 발명에 포함된다.
용어 "약"은, 일반적으로 표시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 10%를 지칭한다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타내고, "약 1"은 0.9-1.1을 의미할 수 있다. "약"의 다른 의미는 문맥상 명백할 수 있는데, 예컨대 반올림일 수 있으며, 예를 들어 "약 1"은 또한 0.5 내지 1.4를 의미할 수도 있다.
실시예
실시예 1. 30kmPEG-Lys(말레이미드)-알킨의 제조 (도 1a)
30kmSC-PEG (화합물 2)의 제조:
25g의 30kmPEG-OH (MW=30000, 1 eq)을 2시간 동안 360㎖의 시약 톨루엔과 공비혼합하여(azeotrope), 75㎖ 톨루엔/물을 제거하였다. 공비 혼합 후, 용액을 45-50℃로 냉각시켰다. 166mg의 트리포스겐 (0.67 eq.)을 PEG, 및 이후 131.8mg의 무수 피리딘 (2 eq.)에 첨가하였다. 반응을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이후, 239.8mg의 N-히드록시석신이미드 (2.5 eq.), 및 이후 164.8g의 무수 피리딘 (2.5 eq.)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 질소 하에 교반하였다. 피리딘 염은 여과하였다. 용매를 Rotavapor로 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 오븐에서 40℃에서 건조하여, 23g의 30kmSC-PEG을 얻었다.
30kmPEG-Lys(Boc)-OH (화합물 3)의 제조:
369mg의 H-lys(boc)-OH (3eq.), 646.5mg의 DIEA (lOeq.) 및 15g의 30kmSCPEG (1 eq.)를, 100㎖ DMF 및 150㎖ DCM 중에서 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 물질은 여과로 제거하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 40℃ 진공 하에 건조하여, 12.8g의 30kmPEG-Lys(Boc)-OH를 얻었다.
30kmPEG-Lys(Boc)-알킨 (화합물 4)의 제조:
11g의 30kmPEG-Lys(Boc)-OH (1 eq.)를 110㎖의 DCM 중에 용해시키고, 0-5℃로 냉각시켰다. 101.4mg의 1-아미노-3-부틴 (4eq.), 및 그 후 402.6mg의 DMAP (9eq.) 및 422.4mg의 EDC (6 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 냉각은 생략하고, 반응을 실온에서 밤새 방치하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 40℃에서 건조하여, 10.4g의 30kmPEG-Lys(Boc)-알킨을 얻었다.
30kmPEG-Lys-알킨 (화합물 5)의 제조:
10g의 30kmPEG-lys(Boc)-알킨에, 실온에서 1시간 동안 150㎖의 TFA/DCM (1:2)를 처리한다. 용매를 진공 하에 제거한다. 잔여물을 에틸 에테르/DCM로부터 재결정화한다. 분리된 생성물은 진공 하에 40℃에서 건조되어, 9.5g의 30kmPEG-Lys-알킨을 얻었다.
30kmPEG-Lys(말레이미드)-알킨 (화합물 6)의 제조:
9g의 30kmPEG-lys-알킨 (1 eq.)를 90㎖의 DCM 중에 용해하였다. 0/5 ℃에서 774mg의 DIEA (20 eq), 및 이후 281mg의 NHS-PEG2-Mal (2.2 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 건조시켜, 8g의 3OkmPEG-Lys(말레이미드)-알킨을 얻었다.
실시예 2. 40kY-PEG-Lys(말레이미드)-알킨의 제조 (도 1b)
40k-Y-PEG-Lys(Boc)-OH (화합물 3a)의 제조:
246mg의 H-lys(boc)-OH (4eq.), 323mg의 DIEA (lOeq.) 및 10g의 40k-Y-PEG-NHS (1 eq.)를, 100㎖ DMF 및 100㎖ DCM 중에 용해하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 물질을 여과 제거하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 40℃ 진공 하에 건조하여, 9.1g의 40k-Y-PEG-Lys(Boc)-OH을 얻었다.
40k-Y-PEG-Lys(Boc)-알킨 (화합물 4a)의 제조:
9g의 40k-Y-PEG-Lys(Boc)-OH (1 eq.)을 90㎖의 DCM에 용해하고, 0-5℃로 냉각하였다. 62.3mg의 1-아미노-3-부틴 (4eq.), 및 이후 247mg의 DMAP (9eq.) 및 259mg의 EDC (6 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 냉각은 생략하고, 반응을 실온에서 밤새 방치하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 40℃에서 건조하여, 8.4g의 40k-Y-PEG-Lys(Boc)-알킨을 얻었다.
40k-Y-PEG-Lys-알킨 (화합물 5a)의 제조:
8.2g의 40k-Y-PEG-lys(Boc)-알킨에 120㎖의 TFA/DCM (1:2)을 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔여물을 에틸 에테르/DCM로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 7.9g의 40k-Y-PEG-Lys-알킨을 얻었다.
40k-Y-PEG-Lys(말레이미드)-알킨 (화합물 6a)의 제조:
7.68g의 40k-Y-PEG-lys-알킨 (1 eq.)을 80㎖의 DCM에 용해시켰다. 495mg의 DIEA (20 eq), 및 이후 204mg의 NHS-PEG2-Mal (2.5 eq)를 0/5℃에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 건조하여, 7.24g의 40k-Y-PEG-Lys(말레이미드)-알킨을 얻었다.
실시예 3. 30kmPEG-Lys(말레이미드)-DBCO 의 제조 (도 1c)
30kmPEG-Lys(Boc)-DBCO (화합물 4b)의 제조:
6g의 30kmPEG-Lys(Boc)-OH (1 eq.)을 60㎖의 DCM에 용해하고, 0-5 ℃로 냉각하였다. 221.1mg의 NH2-DBCO (4eq.), 및 이후 219.6mg의 DMAP (9 eq.) 및 230.4mg의 EDC (6 eq.)를 첨가하였다. 혼합물을 0~5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 냉각은 생략하고, 반응을 실온에서 밤새 방치하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 40℃에서 건조시켜, 5.7g의 30kmPEG-Lys(Boc)-알킨을 얻었다.
30kmPEG-Lys-DBCO (화합물 5b)의 제조:
5.7g의 30kmPEG-lys(Boc)-DBCO에 실온에서 1시간 동안 86㎖의 TFA/DCM (1:2)을 처리하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔여물을 에틸 에테르/DCM로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 40℃에서 건조하여, 5.5g의 30kmPEG-Lys-알킨을 얻었다.
30kmPEG-Lys(말레이미드)-DBCO (화합물 6b)의 제조:
5.5g의 30kmPEG-lys-DBCO (1 eq.)을 55㎖의 DCM에 용해시켰다. 473mg의 DIEA (20 eq), 및 이후 195mg의 NHS-PEG2-Mal (2.5 eq)을 0/5 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔여물을 2-프로판올로부터 재결정화하였다. 분리된 생성물을 진공 하에 건조하여, 5.1g의 30kmPEG-Lys(말레이미드)-DBCO을 얻었다.
실시예 4. SCACD3 및 SCACD19의 제조
단쇄 항체 (SCA) 절편 항-CD3 (SCACD3) 및 항-CD19 (SCACD19)는, pPICZ 벡터를 포함하는 EasySelect?? 피키아 발현 키트를 사용하여, 재조합 DNA 기술에 의해 피키아 파스토리우스(피키아 pastorius) 내에 만들어졌다. 항-CD3 VH-VL 및 항-CD19 VL-VH를 암호화하는 유전자를 합성하여, 이를 pPIZA 발현 벡터에 클로닝하고, P. pastoris X33 종에 형질전환하였다. SCA의 발현은 메탄올에 의해 유도하고, Ni-킬레이팅 수지로 정제하였다. 추후의 컨쥬게이션을 용이하게 위해, 부위-특이적 관능기 티올은 재조합 DNA 기술을 통해, SCACD3 및 SCACD19 모두에 대한 VH와 VL의 사이의 링커에 삽입되었다. 순수한 SCACD3 및 SCADCD19는 크로마토그래피 공정을 통해 수득하였다. SCACD3 및 SCACD19의 DNA 서열은 이하에 열거하였다.
pUC57 내의 SCACD3의 DNA 서열 (서열번호 3):
pUC57 내의 DNA 서열 SCACD19 (서열번호 4):
실시예 5. Cu 촉매없이 클릭 화학에 의한 30kmPEG-(SCACD3)SCACD19의 제조 (도 2a)
아지드-PEG 10 -말레이미드 (화합물 9)의 제조:
15mg의 N-석신이미딜 4-말레이미도부티레이트 (1 eq.)는 200㎕ DMSO 중의 38mg의 아지도-dPEG10-아민 (1.5 eq.)과 실온에서 45분 동안 반응하였다. 생성되는 화합물 아지드-PEG10-말레이미드는 다음 단계에서 추가적인 정제 없이 바로 사용되었다.
아지드-SCACD19 (화합물 10)의 제조:
31mg의 SCACD19 (1 eq.) (1-5 mg/㎖)는 20mM 트리스, 1.5% PEG600, pH8.0 중의 2-8 mM의 TCEP-HCl에 의해 30분 동안 환원되었다. 환원된 SCADCD19 (1 eq.)는 200㎕의 2관능성 링커 아지드-PEG10-말레이미드 (50 eq.)에 첨가되었다. 혼합물을 볼텍스하고, 실온에서 3시간 동안 진탕기에 방치하였다. 반응을 100㎕의 200 mM 시스테인에 의해 실온에서 10분 동안 퀀칭하였다. 과잉의 링커 아지드-PEG10-말레이미드를 20 mM 트리스, 1.5% PEG600, pH8.0의 버퍼를 포함하는 탈염 컬럼 HiPrep™ 26/10 (Cat#17-5087-01, GE Healthcare, NJ), 및 이후 Capto™ Q (GE Healthcare, NJ) 컬럼에 의해 제거하였다. Capt™ Q로부터 나온 분획을 모아서, SimplerBlue™로 염색한 SDS-페이지에 의해 분석하였다. SDS-페이지 프로파일에 기초하여, 원하는 화합물 아지드-SCACD19 분획을 모우고, 1-5 mg/㎖로 농축하고, 추가적인 사용을 위해 냉장고에 보관하였다.
30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO (화합물 11)의 제조:
24mg의 SCACD3 (1 eq.) (1-5 mg/㎖)는 20 mM 소듐 포스페이트, 1.5% PEG600, pH 6.0 중의 2-5 mM TCEP-HCl에 의해 30분 동안 환원되었다. 환원된 24mg의 SCADCD3 (1 eq)을 20 mM Na 포스페이트, 1.5% PEG600, pH 6.0 중의 264mg의 30KmPEG-Lys(말레이미드)-DBCO (10 eq.)와 혼합하였다. 혼합물을 볼텍스하고, 실온에서 약 3시간 동안 진탕기에 방치하였다. 30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO는 20mM, Na 포스페이트, 1.5% PEG600, pH6.0로 사전-평형화된 20㎖ CM 세파로스 패스트 플로우 (GE Healthcare) 컬럼에 의해 정제되었다. 샘플을 로딩한 후, 컬럼을 10 CV의 평형화 버퍼으로 세척하여, 유리 PEG를 완전히 제거한 후, 0.5 M NaCl로 용출하였다. 분획을 모아서, SimplerBlue™ 및 요오드로 염색된 SDS-페이지에 의해 분석하였다. SDS-페이지 프로파일을 기준으로, 30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO를 모우고, 1-5mg/㎖로 농축하였다. 버퍼는 추가적인 사용을 위해 PBS로 교환되었다.
30kmPEG-SCACD3/SCACD19 (화합물 12)의 제조:
30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO (화합물 11)와 아지드-SCACD19 (화합물 10)의 컨쥬게이션은, 실온에서 밤새 PBS 중에 1:1 몰비로 클릭 화학에 의해 달성되었다. 표적 PEGF화 이중 특이적 항체 30kmPEG-SCACD3/SCACD19의 정제는, 먼저 20 mM 트리스, pH8.0 버퍼를 포함하는 HiPrep™ 26/10 탈염 컬럼, 및 이후 DEAE 패스트 플로우 세파로스 (GE Healthcare, NJ) 및 CM 패스트 플로우 세파로스 (GE Healthcare)에 의해 수행되었다. 모든 컬럼 크로마토그래피 정제는 상기 기술한 공정과 유사하게 전개되었다. 분획을 모아서, SimplerBlue™ 및 요오드로 염색한 SDS-페이지에 의해 분석하였다. SDS-페이지 프로파일을 기준으로, 최종적인 이중 특이적 항체 산물을 모우고, PBS, pH 7.4 중에 ~ 1mg/㎖까지 농축하였다. 표적 화합물은 SEC-HPLC 및 세포 기반 활성 에세이에 의해 확인되었다.
실시예 6. Cu 촉매 없이 클릭 화학에 의한 30kmPEG-(SCACD3) SCACD19의 제조 (도 2b)
30kmPEG-Lys(SCACD3)-알킨 (화합물 1Ⅰa)의 제조:
24 mg의 SCACD3 (1 eq.) (1-5 mg/㎖)를 pH 6.0에서 30분 동안 20 mM 소듐 포스페이트, 1.5% PEG600 중의 2-5 mM TCEP-HCl에 의해 환원시켰다. 환원된 24mg의 SCADCD3 (1 eq.)을 20 mM Na 포스페이트, 1.5% PEG600, pH 6.0 중의 264mg의 30KmPEG-Lys(말레이미드)-알킨 (10 eq.)과 혼합하였다. 혼합물을 볼텍스하고, 실온에서 약 3시간 동안 진탕기에 방치하였다. 30kmPEG-Lys(SCACD3)-알킨 (화합물 1Ⅰa)을 20mM, Na 포스페이트, 1.5% PEG600, pH6.0로 평형화한 20mL CM 세파로스 패스트 플로우 (GE Healthcare) 컬럼에 의해 정제하였다. 샘플을 로딩한 후, 컬럼을 10 CV 평형화 버퍼로 세척하여 유리 PEG를 완전히 제거한 후, 0.5 M NaCl에 의해 용출하였다. 분획을 모아서 SimplerBlue™ 및 요오드로 염색한 SDS-페이지에 의해 분석하였다. SDS-페이지 프로파일에 기초하여, 30kmPEG-Lys(SCACD3)-알킨을 모아서, 1-5 mg/㎖로 농축하였다. 버퍼는 추가적인 사용을 위해 PBS로 교환되었다.
30kmPEG-SCACD3/SCACD19 (화합물 12a)의 제조:
30kmPEG-Lys(SCACD3)-알킨 (화합물 11a)과 아지드-SCACD19 (화합물 10)의 컨쥬게이션은, 1:1 몰비로 PBS 중에 실온에서 밤새 15μM Cu(I) 및 (DMSO 중에 사전-제조된) 30μM의 트리스(벤질트리아졸릴메틸)아민 (TBTA)의 존재하에 클릭 화학에 의해 달성되었다.
표적 PEGF화 이중 특이적 항체 30kmPEG-SCACD3/SCACD19 (화합물 12a)의 정제는, 실시예 5의 화합물 12에 대해 기재된 바와 유사하게 실시되었다.
실시예 7. 생물학적 데이터 (도 3 및 4)
시험관내 T 세포 매개 세포 독성
시험관내 bscCD19×CD3 세포 독성 에세이는 PEG화 이중 특이적 항체 화합물 12의 세포 독성 효능을 평가하기 위해 수행되었다. 이 연구는 DSP-BsAb 기술이 이중 특이적 항체의 제조를 위한 대안적 기술이라는 점을 입증하기 위해 사용되었고, 이 기술은 효과기 세포를 이용하여 암-면역치료시 암세포를 파괴할 수 있다. 화합물 12의 세포 독성은 비색 LDH 유출 에세이를 사용하여 결정되었다. 반 최대 유효 농도 (EC50) 값은 GraphPad Prism 6에 의한 4 파라미터 논리 비-선형 퇴행 모델 피트에 의해 분석되었다.
간략히, 이 연구를 위해, 37℃/5% CO2에서 완전 배지 중에 유지된 표적 Raji 세포 (B 림프종 세포주)는, 상이한 농도의 화합물 12 (첨가되기 전에 1% FBS이 보충된 페놀 레드 불포함 MEM 배지로 희석됨)와 함께 37℃에서 0.5 시간 동안 배양되었다. CD8+ T 세포 분리 키트에 의해 PBMCs (20명의 건강한 개인 유래)로부터 단리한 CD8+ T 세포를, 효과기 세포로서 첨가하였다 (E:T 비 = 5:1). 화합물 12, Raji 세포 및 효과기 세포의 혼합물은, 추가로 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 배양되었다. LDH 키트에 의한 세포 생존성을 검정하기 위해 상청액을 모았다. OD492nm 및 OD650nm에서의 흡광도 데이터를 판독하였다. OD492nm 데이터에서 백그라운드 (OD650nm)를 뺀 값을 분석하여, LDH 유출을 연구하였다. 세포 용해의 백분율은 이하의 수식에 의해 계산하였다:
세포 용해율 (%) = 100×(OD샘플 데이터-OD표적 세포+효과기 세포)/(OD최대 유출- OD최소 유출)
결과 [평균 + SD, (n = 3)]는 도 3에 도시되어 있다. 분석 데이터는 표 1에 나열되었다. 8.24 ng/㎖의 EC50 값은, 화합물 12가 표적 세포에 대해 상당한 세포독성을 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 화합물 12는 표적 세포에 대한 투여량-의존적 사멸력도 나타내었다.
시험관내 약물동태학
이 연구는, 본원에 개시된 DSP-BsAb 기술이 전통적인 단쇄 이중 특이적 항체의 제거 반감기를 극적으로 연장할 수 있다는 것을 입증하기 위해 고안된 것이다. PEG화 단쇄 이중 특이적 항체의 약물동태학은, 래트에 1mg/kg를 정맥내 주사한 후 결정되었다. 래트에서의 PEG화 컨쥬게이트의 반감기가 통상 인간에서보다 5배 범위 내로 더 짧기 때문에, 이 연구에서 래트에서의 PEG화 단쇄 이중 특이적 항체의 반감기는, 인간에서 주당 가능한 약물 투여를 위해서는 약 10시간 또는 그 이상까지 도달해야 한다.
연구를 위하여, 실험은 이하와 같이 수행되었다: 무종양 스프라그-다울리 수컷 래트 (약 250g, n=3)에 2개의 경부 정맥 캐뉼러(JVC)를 고정시켰다. 음식은 약물 투여 최소 12시간부터 투여후 4시간까지 동물에서 보류하였다. 물은 임의로 제공하였다. 래트에 1mg/kg 이중 특이적 항체 화합물 12의 단일 주입을 JVC를 통해 정맥내 주사하였다. 다양한 시점 (사전-투여, 30분, 1, 2, 4, 8, 12, 24 및 48시간)에서, 약 0.3㎖ 혈액 샘플을 경부 정맥 캐뉼러 또는 꼬리 정맥로부터 얻었고, 이를 소듐 헤파린을 함유하는 차가운 시험관으로 옮겼다. 샘플을 4℃에서 원심분리하고, 혈장을 모아서, 에세이를 수행할 때까지 동결하였다.
약물동태학 분석은 ELISA 에세이를 사용하여 수행되었다. 간략히, 먼저 마이크로플레이트를 CD19 항원으로 밤새 2-8 ℃에서 코팅하였으나, 표면 상의 모든 비-특이적 결합 부분는 PBS 중 2% PBS로 블로킹되었다. 래트 혈장 샘플을 적용하기 전에, 상기 플레이트를 PBS, 0,05% v/v 트윈 20로 3×5분 세척하였다. 37℃에서 1.5 시간동안 배양한 후, 플레이트를 PBS, 0.05% v/v 트윈 20으로 3×5분 세척한 후, 37℃에서 1시간 동안 항-PEG 항체를 결합시켰다. 효소-연결된 항체가 적용되기 전에, 플레이트를 PBS, 0.05% v/v 트윈 20으로 3×5분 세척하였다. 이후, 플레이트는 효소 기질을 처리하여 발색시키고, 1 N 황산으로 반응을 정지시켰다. 화합물 12의 혈장 농도을 계측 곡선으로부터 계산하고, 시간에 대해 플로팅하였다. 결과 (도 4 및 표 2)는, 화합물 12이 블리나투모맙 (단쇄 CD19/CD3 이중 특이적 항체의 비-PEG화 버전) (t1/2 < 0.5 시간)보다 래트에서 제거 반감기 (T1/2 = 27.48시간)가 훨씬 길다는 것을 보여주었다.
바람직한 구현예의 상술한 실시예 및 상세한 설명은, 청구항에서 정의된 본 발명을 제한하기보다는 오히려 예시로 받아들여져야 한다, 자명한 바와 같이, 상기 제시된 특징들의 다수의 변형 및 조합은 청구항에 제시된 바와 같은 본 발명을 벗어나지 않고서 사용될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 범주에서 벗어나는 것으로 간주되지 않으며, 이러한 모든 변형은 이하의 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본원에서 인용된 모든 참고 문헌은 전체로서 본원에 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> PRINCETON ENDURING BIOTECH, INC Liu, Shu-Min Wu, Dechun <120> Long Acting Multi-Specific Molecules and Related Methods <130> P19-027-INP-FOX <150> 62/408,865 <151> 2016-10-17 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> single chain antibody Fv <400> 1 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Cys Gly Ser Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Leu Lys <210> 2 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> single chain antibody Fv <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser 130 135 140 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 180 185 190 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 210 215 220 Arg Arg Glu Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 3 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single chain antibody (SCA) fragment <400> 3 gacatcaaac tgcaacaaag cggtgctgaa ctggcacgtc cgggcgcatc cgtcaaaatg 60 agctgtaaga cctcgggcta taccttcacc cgttacacga tgcattgggt caagcagcgt 120 ccgggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaacccgt ctcgtggcta caccaactac 180 aaccagaagt tcaaggataa ggcaaccctg accacggaca aaagctctag tacggcttat 240 atgcaactgt cctcactgac ctctgaagat agtgcggtgt attactgcgc ccgctattac 300 gatgaccact attgtctgga ctactggggc cagggtacca cgctgacggt gtcgagcgtt 360 gaaggcggtt ccggcggttc aggcggttcg ggcggtagcg gcggtgttga tgacattcag 420 ctgacccaat caccggcaat catgagcgct tctccgggtg aaaaggttac catgacgtgc 480 cgtgcgtcta gttccgtcag ttatatgaat tggtaccagc aaaagtctgg tacgagtccg 540 aaacgttgga tttatgatac ctccaaagtc gcaagcggtg tgccgtaccg tttcagtggt 600 tccggttcag gcacctcgta tagcctgacg atctcatcga tggaagccga agatgcggcc 660 acctattact gtcaacaatg gagtagtaac ccgctgacct ttggcgctgg cacgaaactg 720 gaactgaaat gt 732 <210> 4 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single chain antibody (SCA) fragment <400> 4 gacattcaac tgacgcaatc cccggcttcc ctggcggtct cgctgggtca acgcgcaacc 60 atctcgtgta aagcatcgca atcggtcgat tatgacggcg attcctatct gaactggtac 120 cagcaaattc cgggtcagcc gccgaagctg ctgatctacg atgcgagtaa tctggtctcc 180 ggcattccgc cgcgtttttc cggttcaggc tcgggtacgg acttcaccct gaacatccat 240 ccggtggaaa aagttgatgc ggccacctat cactgccagc aatctacgga agacccgtgg 300 acctttggcg gtggcacgaa gctggaaatt aaaggtggcg gtggcagcgg tggcggtggc 360 tctggtggcg gtggcagtca ggtgcaactg cagcaaagcg gtgcagaact ggtccgtccg 420 ggtagctctg tgaagatctc atgtaaagca tcgggctatg ctttcagttc ctactggatg 480 aattgggtta aacagcgccc gggccaaggt ctggaatgga ttggtcagat ctggccgggc 540 gacggtgata ccaactacaa tggcaaattt aagggtaaag cgacgctgac cgccgatgaa 600 tcatcgagca ccgcatatat gcagctgtct agtctggcaa gcgaagactc tgctgtttac 660 ttctgcgcac gtcgcgaaac cacgaccgtc ggtcgttact actacgctat ggactattgg 720 ggtcaaggca ccaccgttac cgtttcaagt tgc 753

Claims (26)

  1. 하기 화학식 Ib의 화합물:
    화학식 Ib
    상기 식에서:
    P는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이고;
    B는 H, C1-50 알킬 또는 없는 것이고, 여기서 상기 알킬 내의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체될 수 있고;
    T는 3-관능성 링커로서,
    (a) 티올, 히드록실, 아미노, 카르복실, 무수물, 또는 말레이미드로부터 유도된 연결을 포함하거나; 또는
    (b) 리신, 1,3-디아미노-2-프로판올, 또는 트리에탄올아민으로부터 유도된 것이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 2관능성 링커이고, 여기서 2관능성 링커는 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오, 방향족 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 아이오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조시클로옥틸 (DBCO), 카르보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 히드라지드, 옥심, 포타슘 아실트리플루오로보레이트, O-카르바모일히드록실아민, 트랜스-시클로옥텐, 테트라진, 또는 트리아릴포스핀으로부터 유도된 모이어티를 포함하는 것이며;
    a 및 b는 각각 1-10으로부터 선택된 정수이고;
    A1 및 A2는 2개의 상이하거나 또는 동일한 항체 또는 이의 항원-결합 부분이고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 하나 또는 둘 모두는 단일 인식 결합 모이어티 또는 다중 인식 결합 모이어티들을 포함하고; 그리고
    y는 1-10으로부터 선택된 정수임.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, A1는 제1 인식 결합 모이어티를 포함하고, A2는 제2 인식 결합 모이어티를 포함하는, 화합물.
  4. 제1항 및 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 2개의 상이한 항체 또는 이의 항원-결합 부분이고, 여기서 항체 또는 항원-결합 부분은 단일 인식 결합 모이어티 또는 다중 인식 결합 모이어티를 포함하는, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2개의 항체는 각각 세포독성 세포의 수용체에 결합하는 항-CD3 항체 및 암세포의 수용체에 결합하는 항-CD19 항체인, 화합물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 2개의 항체는 단쇄 항체인, 화합물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 중합체는 선형 PEG인, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 중합체는 분기형 PEG인, 화합물.
  10. 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG의 적어도 하나의 말단 또는 분기는 C1-10 알킬로 캡핑되는, 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PEG의 총 분자량은 5,000 내지 100,000인, 화합물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 따른 화학식 Ib의 화합물을 제조하는 방법으로서,
    (i) 2개의 상이한 항체 또는 이의 변형 버전과 부위-특이적 컨쥬게이션을 할 수 있는 말단 이중-관능기를 갖는 비-면역원성 중합체를 준비하는 단계로서, 여기서 상기 중합체는 PEG인 단계; 및
    (ii) 상기 비-면역원성 중합체와 상기 2개의 상이한 항체 또는 이의 변형 버전을 단계적으로 부위-특이적 컨주게이션하여, 화학식 Ib의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제14항에 있어서, 상기 항체 중 하나 이상은 단일 인식 결합 모이어티 또는 다중 인식 결합 모이어티를 포함하는, 방법.
  20. 제1항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 자가면역 질환 또는 암 종양의 성장 및/또는 전이를 치료하기 위한 약학적 조성물로, 2개의 항체 중 하나는 세포독성 세포 상의 수용체에 결합하는 항-CD3 항체이고 다른 하나는 암 세포 또는 질환 세포의 수용체에 결합하는 항체인 것인, 약학적 조성물.
  21. 제1항의 화합물의 유효량을 포함하는, 치료를 요하는 환자에 대해 자가면역 질환 또는 암 종양의 성장 및/또는 전이를 치료하기 위한 약학적 조성물로, 2개의 항체 중 하나는 세포독성 세포 상의 수용체에 결합하는 항-CD3 항체이고 다른 하나는 암 세포 또는 질환 세포의 수용체에 결합하는 항체인 것인, 약학적 조성물.
  22. 제1항에 있어서, (L1)a 및 (L2)b 중 하나는 아지드 및 알킨으로부터 형성된 연결을 포함하는, 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 (L1)a 및 (L2)b 중 다른 하나는 말레이미드 및 티올로부터 형성된 연결을 포함하는, 화합물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 알킨은 디벤조시클로옥틸 (DBCO)인, 화합물.
  25. 제1항에 있어서, T는
    리신, 1,3-디아미노-2-프로판올, 또는 트리에탄올아민으로부터 유도된 것인, 화합물.
  26. 제21항에 있어서, 자가면역 질환은 다발성 경화증인 약학적 조성물.
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