CN109959691B - 一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法 - Google Patents

一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本专利公开了一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，在电极表面修饰半导体ZnO纳米材料及不同粒径CdTe量子点形成级联结构，极大的增强了光电流强度。通过三螺旋分子的形成和拆解，三螺旋分子开关的优越性为核酸的高特异性检测开辟了新的策略，借助电化学工作站实现了对核酸的超灵敏检测。本发明通过改变适配DNA的序列，发明的光致电化学传感器还可以用于各种核酸的检测，该方法具有低成本、高灵敏、响应快速的优点，在生物分析和临床诊断中具有重要的应用前景。

Description

一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的 方法
技术领域
本发明涉及一种成本低、操作简单、灵敏度高的核酸的检测方法，属于核酸的检测技术领域。
背景技术
核酸是生物体内重要的遗传信息载体，它在生命活动中存储和传播遗传信息方面发挥作用，并确定一系列主要的生命现象，如生物的生长，遗传和变异。因此，准确，快速和特异性的核酸测定已成为现代生命科学中用于基因治疗，临床诊断和癌症研究的核心问题。
迄今为止，用于核酸检测的方法有电化学法，电化学发光法，荧光发光法和比色法，在这些检测核酸的方法中，虽然它们各有优势，但也存在成本高、分析时间长、设备复杂等问题。因此，迫切需要开发一个有效的平台，不仅能解决上述问题，而且可以实现可靠且便携的核酸检测器件。
为了提高核酸检测的灵敏度，建立了一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关的低成本、高灵敏、快速的光致电化学生物传感器。采用微流控纸基平台生长贵金属纳米材料，增加纸电极的比表面积，有效地增加电极的导电性能。利用半导体 ZnO 纳米材料及不同粒径 CdTe 量子点形成级联结构，由于其独特的物理化学性质和光电活性，极大的增强了光电流强度，同时还具有生物相容性好，易于制备等优点，使得其具有更好的应用前景。通过三螺旋分子的形成和拆解，三螺旋分子开关的优越性为核酸的高特异性检测开辟了新的策略，实现了对核酸的超灵敏检测。所建立的核酸检测方法是一种具有普适性的可以用于各种核酸的检测，在生物分析和临床诊断中具有重要的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种设计合理，成本低廉，操作简便，环境友好且灵敏度高的生物传感器对核酸进行检测。
所述的一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法过程如下：
（1）设计纸芯片工作层和辅助层的亲水区域和疏水蜡打印区域，在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极，辅助层亲水区域制备参比电极和对电极（附图1）；
（2）将 ZnO 纳米棒（ZnO NRs）和两种不同粒径的 CdTe-COOH 量子点（CdTe-COOHQDs）和 CdTe-NH2 量子点（CdTe-NH2 QDs）形成级联光活性材料固定在步骤（1）所得工作电极制备光致电传感界面；
（3）将发夹结构的 DNA (H-DNA) 固定在步骤（2）所得光致电传感界面，随后采用6-巯基己醇（MCH）封闭非特异性活性位点；
（4）将标记碱性磷酸酶和适配 DNA 修饰的金纳米粒子（ALP-Au NPs-DNA）固定在步骤（3）所得光致电传感界面制备光致电化学传感器（附图2）；
（5）将目标 DNA （T-DNA）滴加到步骤（4）所得光致电化学传感器，利用500W氙灯光源激发，电化学工作站检测产生的光电流。
所述的一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法具体步骤如下：
（1）本发明所述的纸材料为色谱纸，纸芯片图案用 Adobe Illustrator CS4 软件设计，该微流控纸芯片包括工作层和辅助层，工作层和辅助层中间圆形区域为亲水区域，其余部分为蜡打印疏水区域，其中工作层亲水区域直径尺寸为6 mm，辅助层亲水区域直径尺寸为8 mm；采用丝网印刷的方法，在工作层亲水区域印刷碳工作电极，辅助层亲水区域印刷Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
本发明所述在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极的步骤为：首先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL 质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到生长金纳米粒子的工作电极。
（2）本发明所述将 ZnO NRs 和两种不同粒径的 CdTe-COOH QDs 和 CdTe-NH2QDs 相继固定在步骤（1）所得的工作电极的步骤为：
ZnO NRs 的制备步骤如下：在搅拌下将0.44 g 醋酸锌溶解在10 mL 乙醇胺中以形成透明溶液，向溶液中加入5 mL 水和15 mL 乙二醇并超声处理30分钟，随后将溶液转移到100 mL 聚四氟乙烯内衬的高压釜中在180 ℃ 加热4小时，反应后将其在室温下自然冷却至室温，将沉淀物离心并用无水乙醇和蒸馏水分别冲洗3次，在室温下干燥12小时得到ZnO 粉末；
CdTe-COOH QDs 的制备步骤如下：将89 μL 3-巯基丙酸加入到配有冷凝器和温度计的三颈烧瓶中的120 mL 5mM CdCl2 水溶液中，之后将溶液用氮气鼓泡持续30分钟，在搅拌下滴加1.0 M NaOH溶液调节pH至11.8，然后将0.12 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，反应在100 ℃ 和氮气气氛中进行6小时，得到 CdTe-COOH QDs 溶液；
CdTe-NH2 QDs 的制备步骤如下：在搅拌下将3.6 mmol 的巯基乙胺加入到圆底烧瓶中的100 mL 12 mM CdCl2 水溶液中，将溶液用高纯度氮气脱气30分钟，然后加入稀 NaOH溶液将溶液的pH调节至5.7，然后将0.1 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，将反应混合物溶液加热至100 ℃ 并在氮气气氛下回流1小时，最后获得 CdTe-NH2 QDs溶液；
将 ZnO NRs 溶解在0.1 mM 4-氨基苯硫酚（PATP）乙醇溶液中，将混合物搅拌4小时，然后将沉淀物离心并溶解在乙醇溶液中，得到 ZnO/PATP，滴加10~200 μL ZnO/PATP 溶液于生长金纳米粒子的工作电极上，室温下静置20分钟，待其干燥后，逐次滴加20 μLCdTe-COOH QDs 和20 μL CdTe-NH2 QDs，室温下孵育30分钟，最后，使用超纯水洗涤上述工作电极3次，于室温下干燥30分钟，制备得到 CdTe-NH2/CdTe-COOH/ZnO NRs 级联光电活性材料修饰的光致电传感界面。
（3）本发明所述将 H-DNA 固定在步骤（2）所得的光致电传感界面，随后采用MCH封闭非特异性活性位点的步骤为：将20 μL 20 mg/mL N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和10 mg/mL羟基丁二酰亚胺的混合溶液滴加到步骤（2）所得的光致电传感界面并孵育30分钟，然后滴加20 μL 1μM 的 H-DNA，孵育16小时，加入20 μL MCH 放置30分钟封闭光致电传感界面的非特异性活性位点。
（4）本发明所述将 ALP-Au NPs-DNA 固定在步骤（3）所得光致电传感界面的步骤为：在2.0 mL Au NPs 溶液中滴加0.2 M K2CO3溶液将pH调节至8.2，然后将20 μL 1 μM DNA和40 μL 0.8 mg/mL碱性磷酸酶加入其中，孵育2小时，将混合物以10000 rpm离心20分钟，并用磷酸洗涤缓冲液洗涤三次，将沉淀物分散在200 μL 蒸馏水中以获得 ALP-Au NPs-DNA分散液；取20 μL ALP-Au NPs-DNA 滴加到光致电传感界面，在室温下孵育90分钟，制备得到光致电化学传感器。
（5）本发明所述的将 T-DNA 滴加到步骤（4）检测光电流的步骤为：将20 μL T-DNA滴加到步骤（4）所得的光致电化学传感器的工作区域，利用500W氙灯产生的白光作为光源激发，在含有0.1 M 抗坏血酸磷酸钠的磷酸盐缓冲溶液中利用电化学工作站进行光电流检测。
本发明的有益效果
（1）本发明采用纸电极作为工作电极，相比于传统的玻碳电极和导电玻璃电极，价格低廉，环保，可任意处理。
（2）本发明利用 ZnO NRs 和不同粒径的 CdTe QDs 光电活性材料形成的级联结构，有效的增强了光电流强度。
（3）本发明采用三螺旋 DNA 结构，相比于传统的双螺旋 DNA 结构，具有更好的灵活性和可操作性，通过三螺旋分子的形成和拆卸，实现了核酸的超灵敏检测。
（4）本发明所述的检测核酸的方法是一种具有普适性的可以用于各种核酸的检测。
附图说明
图1：纸芯片的设计。
图2：光致电化学传感器的构建。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例
一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法在 HIV-1 中的应用，其特征是包括以下步骤：
（1）用 Adobe Illustrator CS4 软件设计微流控纸芯片的工作层和辅助层，工作层和辅助层中间圆形区域为亲水区域，其余部分为蜡打印疏水区域，其中工作层亲水区域直径尺寸为6 mm，辅助层亲水区域直径尺寸为8 mm；采用丝网印刷的方法，在工作层亲水区域印刷碳工作电极，辅助层亲水区域印刷Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
本发明所述在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极的步骤为：首先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL 质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到生长金纳米粒子的工作电极。
（2）本发明所述将 ZnO NRs 和两种不同粒径的 CdTe-COOH QDs 和 CdTe-NH2QDs 相继固定在步骤（1）所得的工作电极的步骤为：
ZnO NRs 的制备步骤如下：在搅拌下将0.44 g 醋酸锌溶解在10 mL 乙醇胺中以形成透明溶液，向溶液中加入5 mL 水和15 mL 乙二醇并超声处理30分钟，随后将溶液转移到100 mL 聚四氟乙烯内衬的高压釜中在180 ℃ 加热4小时，反应后将其在室温下自然冷却至室温，将沉淀物离心并用无水乙醇和蒸馏水分别冲洗3次，在室温下干燥12小时得到ZnO 粉末；
CdTe-COOH QDs 的制备步骤如下：将89 μL 3-巯基丙酸加入到配有冷凝器和温度计的三颈烧瓶中的120 mL 5mM CdCl2 水溶液中，之后将溶液用氮气鼓泡持续30分钟，在搅拌下滴加1.0 M NaOH溶液调节pH至11.8，然后将0.12 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，反应在100 ℃ 和氮气气氛中进行6小时，得到 CdTe-COOH QDs 溶液；
CdTe-NH2 QDs 的制备步骤如下：在搅拌下将3.6 mmol 的巯基乙胺加入到圆底烧瓶中的100 mL 12 mM CdCl2 水溶液中，将溶液用高纯度氮气脱气30分钟，然后加入稀 NaOH溶液将溶液的pH调节至5.7，然后将0.1 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，将反应混合物溶液加热至100 ℃ 并在氮气气氛下回流1小时，最后获得 CdTe-NH2 QDs溶液；
将 ZnO NRs 溶解在0.1 mM 4-氨基苯硫酚（PATP）乙醇溶液中，将混合物搅拌4小时，然后将沉淀物离心并溶解在乙醇溶液中，得到 ZnO/PATP，滴加10~200 μL ZnO/PATP 溶液于生长金纳米粒子的工作电极上，室温下静置20分钟，待其干燥后，逐次滴加20 μLCdTe-COOH QDs 和20 μL CdTe-NH2 QDs，室温下孵育30分钟，最后，使用超纯水洗涤上述工作电极3次，于室温下干燥30分钟，制备得到 CdTe-NH2/CdTe-COOH/ZnO NRs 级联光电活性材料修饰的光致电传感界面。
（3）本发明所述将 H-DNA 固定在步骤（2）所得的光致电传感界面，随后采用MCH封闭非特异性活性位点的步骤为：将20 μL 20 mg/mL N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和10 mg/mL羟基丁二酰亚胺的混合溶液滴加到步骤（2）所得的光致电传感界面并孵育30分钟，然后滴加20 μL 1μM 的 H-DNA，孵育16小时，加入20 μL MCH 放置30分钟封闭光致电传感界面的非特异性活性位点。
（4）本发明所述将 ALP-Au NPs-DNA 固定在步骤（3）所得光致电传感界面的步骤为：在2.0 mL Au NPs 溶液中滴加0.2 M K2CO3溶液将pH调节至8.2，然后将20 μL 1 μM DNA和40 μL 0.8 mg/mL碱性磷酸酶加入其中，孵育2小时，将混合物以10000 rpm离心20分钟，并用磷酸洗涤缓冲液洗涤三次，将沉淀物分散在200 μL 蒸馏水中以获得 ALP-Au NPs-DNA分散液；取20 μL ALP-Au NPs-DNA 滴加到光致电传感界面，在室温下孵育90分钟，制备得到光致电化学传感器。
（5）HIV-1检测：将20 μL HIV-1-DNA 滴加到步骤（4）所得的光致电化学传感器的工作区域，利用500W氙灯产生的白光作为光源激发，在含有0.1 M 抗坏血酸磷酸钠的磷酸盐缓冲溶液中利用电化学工作站进行光电流检测。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法
<130> 2019
<141> 2019-04-11
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagtgagag aggagactgc 20
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctctctcatg tggaaaatct ctagcagtct ctctc 35
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actgctagag attttccaca t 21

Claims (6)

1.一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征包括以下步骤：
（1）设计纸芯片工作层和辅助层的亲水区域和疏水蜡打印区域，在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极，辅助层亲水区域制备参比电极和对电极；
（2）将 ZnO 纳米棒（ZnO NRs）和两种不同粒径的 CdTe-COOH 量子点（CdTe-COOH QDs）和 CdTe-NH2量子点（CdTe-NH2 QDs）形成级联光电活性材料固定在步骤（1）所得工作电极制备光致电传感界面；
（3）将发夹结构的 DNA (H-DNA) 固定在步骤（2）所得光致电传感界面，随后采用6-巯基己醇（MCH）封闭非特异性活性位点；
（4）将标记碱性磷酸酶和适配 DNA 修饰的金纳米粒子（ALP-Au NPs-DNA）固定在步骤（3）所得光致电传感界面制备光致电化学传感器；
（5）将目标 DNA （T-DNA）滴加到步骤（4）所得光致电化学传感器，利用500W氙灯光源激发，电化学工作站检测产生的光电流。
2.根据权利要求1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的纸芯片材料为色谱纸，纸芯片图案用 AdobeIllustrator CS4 软件设计，该纸芯片包括工作层和辅助层，工作层和辅助层中间圆形区域为亲水区域，其余部分为蜡打印疏水区域，其中工作层亲水区域直径尺寸为6 mm，辅助层亲水区域直径尺寸为8 mm；采用丝网印刷的方法，在工作层亲水区域印刷碳工作电极，辅助层亲水区域印刷Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
所述在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极的步骤为：首先将80mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃保持1分钟，最后加入2.8 mL 质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到生长金纳米粒子的工作电极。
3.根据权利要求1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 ZnO NRs 和两种不同粒径的 CdTe-COOH QDs 和 CdTe-NH2 QDs 相继固定在步骤（1）所得的工作电极的步骤为：
ZnO NRs 的制备步骤如下：在搅拌下将0.44 g 醋酸锌溶解在10 mL 乙醇胺中以形成透明溶液，向溶液中加入5 mL 水和15 mL 乙二醇并超声处理30分钟，随后将溶液转移到100 mL 聚四氟乙烯内衬的高压釜中在180 ℃加热4小时，反应后将其在室温下自然冷却至室温，将沉淀物离心并用无水乙醇和蒸馏水分别冲洗3次，在室温下干燥12小时得到 ZnO粉末；
CdTe-COOH QDs 的制备步骤如下：将89 μL 3-巯基丙酸加入到配有冷凝器和温度计的三颈烧瓶中的120 mL 5mM CdCl2 水溶液中，之后将溶液用氮气鼓泡持续30分钟，在搅拌下滴加1.0 M NaOH 溶液调节pH至11.8，然后将0.12 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，反应在100 ℃和氮气气氛中进行6小时，得到 CdTe-COOH QDs 溶液；
CdTe-NH2 QDs 的制备步骤如下：在搅拌下将3.6 mmol 的巯基乙胺加入到圆底烧瓶中的100 mL 12 mM CdCl2 水溶液中，将溶液用高纯度氮气脱气30分钟，然后加入稀 NaOH 溶液将溶液的pH调节至5.7，然后将0.1 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，将反应混合物溶液加热至100 ℃并在氮气气氛下回流1小时，最后获得 CdTe-NH2 QDs 溶液；
将 ZnO NRs 溶解在0.1 mM 4-氨基苯硫酚（PATP）乙醇溶液中，将混合物搅拌4小时，然后将沉淀物离心并溶解在乙醇溶液中，得到 ZnO/PATP，滴加10~200 μL ZnO/PATP 溶液于生长金纳米粒子的工作电极上，室温下静置20分钟，待其干燥后，逐次滴加20 μL CdTe-COOH QDs 和20 μL CdTe-NH2 QDs，室温下孵育30分钟，最后，使用超纯水洗涤上述工作电极3次，于室温下干燥30分钟，制备得到 CdTe-NH2/CdTe-COOH/ZnO NRs 级联光电活性材料修饰的光致电传感界面。
4.根据权利要求1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 H-DNA 固定在步骤（2）所得的光致电传感界面，随后采用MCH封闭非特异性活性位点的步骤为：将20 μL 20 mg/mL N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和10 mg/mL羟基丁二酰亚胺的混合溶液滴加到步骤（2）所得的光致电传感界面并孵育30分钟，然后滴加20 μL 1μM 的 H-DNA，孵育16小时，加入20 μL MCH 放置30分钟封闭光致电传感界面的非特异性活性位点。
5.根据权利要求1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 ALP-Au NPs-DNA 固定在步骤（3）所得光致电传感界面的步骤为：在2.0mL Au NPs 溶液中滴加0.2 M K2CO3溶液将pH调节至8.2，然后将20 μL 1 μM DNA 和40 μL0.8 mg/mL碱性磷酸酶加入其中，孵育2小时，将混合物以10000 rpm离心20分钟，并用磷酸洗涤缓冲液洗涤三次，将沉淀物分散在200 μL 蒸馏水中以获得 ALP-Au NPs-DNA 分散液；取20 μL ALP-Au NPs-DNA 滴加到光致电传感界面，在室温下孵育90分钟，制备得到光致电化学传感器。
6.根据权利要求1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 T-DNA 滴加到步骤（4）检测光电流的步骤为：将20 μL T-DNA 滴加到步骤（4）所得的光致电化学传感器的工作区域，利用500W氙灯产生的白光作为光源激发，在含有0.1 M 抗坏血酸磷酸钠的磷酸盐缓冲溶液中利用电化学工作站进行光电流检测。
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