CN110257051B - 一种基于点击化学的dna功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用 - Google Patents

一种基于点击化学的dna功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于点击化学的DNA功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用。涉及纳米材料和生物医学分析化学领域。其制备方法是在量子点的合成过程中，将一端为叠氮或二苯基环辛炔修饰另一端为硫代磷酸酯修饰的DNA加入，作为量子点的共稳定剂，从而得到叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点标记试剂。该量子点标记试剂可对蛋白酶与癌细胞进行高效标记，并可将其用于生物检测与成像分析。结合DNA杂交原理，该标记试剂在纳米材料自组装等方面也具有重要的应用价值。同时，与其他基于点击化学的荧光标记试剂相比，该标记试剂的制备方法简单、无需任何化学修饰、易于纯化且标记试剂的荧光性能优异。

Description

一种基于点击化学的DNA功能化量子点的制备方法及其在生 物标记与检测中的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料和生物医学分析化学领域，具体涉及一种叠氮或二苯基 环辛炔修饰DNA功能化量子点及其在生物标记、检测与成像方面的应用。
背景技术
量子点具有优异的光学与化学性能，如发射光谱可调、吸收范围宽、斯托克 斯位移大、量子产率高且稳定性好，因此在生物传感方面得到了广泛的应用(I.L. Medintz etal,Nat.Mater.2005,4,435)。此外，量子点也常用作核酸、蛋白及病毒 等的标记试剂。蛋白等的量子点标记常采用共价偶联的方法，其中碳化二亚胺法 最为常用。但是，碳化二亚胺法存在偶联效率低、副产物多、易水解及标记选择 性差等问题。研究者们发现了一种新型的偶联方式，即生物正交反应，也命名为 点击反应(Q.Wang et al,J.Am.Chem.Soc.2003,125,3192)。最先报道的是铜离 子催化叠氮与炔烃的环加成反应，该方法选择性好、偶联效率高、无水解副产物 且不会发生交叉偶联(J.E.Hein et al,Chem.Soc.Rev.2010,39,1302)。但是该方 法需要Cu+作为催化剂，而过量的铜离子不仅会对细胞及生物体造成伤害，还会 猝灭量子点的荧光，因此该方法在荧光纳米材料的标记受到了一定的限制(A.Bernardin et al,Bioconjugate Chem.2010,21,583)。基于张力驱动的叠氮与炔烃的 环加成反应(SPAAC)，除具有铜离子催化叠氮与炔烃的环加成反应的优点外， 该方法还具有不需要催化剂、反应条件温和等优势(N.J.Agard et al,J.Am.Chem. Soc.2004,126,15046)，近年来该方法得到了广泛的应用。
Schieber等人通过SPAAC法将量子点标记于转铁蛋白上，并通过转铁蛋白 与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体作用，实现了对肿瘤细胞的成像分析，该方法标记 效率高且不影响蛋白活性(C.Schieber et al,Angew.Chem.Int.Edit.2012,51, 10523)。Hao等人利用SPAAC法将量子点标记于流感病毒的包膜蛋白上，该方 法标记条件温和且效率高(J.Haoet al,Anal.Chem.2012,84,8364)。上述方法需 要将二苯基环辛炔类化合物偶联在量子点表面。量子点的二苯基环辛炔类化合物 修饰主要是通过碳化二亚胺法实现的，该方法会使量子点的荧光效率降低，且稳 定性也会受到一定的影响。因此，需要建立一种简单、有效的方法用于构建基于 点击反应的量子点标记试剂。
加拿大Kelley课题组设计了一类硫代磷酸酯修饰的DNA，并在合成量子点 的过程中引入，一锅法合成了DNA功能化量子点(N.Ma et al,Nat.Nanotech. 2009,4,121)。该方法无需对量子点进行修饰，能保证量子点的发光效率与稳定 性不受影响。其中，正常磷酸酯基的DNA仍然具有靶向性，可与目标核酸、蛋 白及细胞等作用。但是，该量子点只具有靶向作用的单功能性。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了一种叠氮或二苯 基环辛炔修饰DNA功能化量子点的制备方法，该方法在合成量子点的过程中，加 入叠氮或二苯基环辛炔与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，一步合成了叠氮或二苯 基环辛炔修饰的DNA功能化量子点，该量子点标记试剂的发光效率高、稳定性、 易于标记且可具有靶向性。
本发明的再一目的在于提供上述叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子 点在生物标记与检测方面的应用。本发明将该标记试剂应用到葡萄糖氧化酶与 HeLa细胞的标记，展现出了一定的普适性。与其他共价偶联方法对比，该探针 用于蛋白酶的标记具有连接效率高、无副产物、标记速度快、可增强蛋白酶活性 及量子点的稳定性等优势；与其他生物标记方法对比，该探针用于HeLa细胞的 标记具有无需任何化学修饰试剂、标记效率高、发光效率高等优点。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案：
一种叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点的制备方法，其合成方法， 包括如下步骤：
1)将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶 液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至8.0～9.0；取亚碲酸钠与硼氢 化钠，使其摩尔比为1:2，加入10mL单口烧瓶中，置于冰浴、无氧条件下反应 5h，为混合溶液B，快速将混合溶液B转入混合溶液A中，最后加入20～200μM 叠氮或二苯基环辛炔与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反 应釜中，于150～200℃下反应20～35min，得到叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA 功能化CdTe:Zn2+量子点；所述DNA设计原则：5～20个硫代磷酸酯修饰碱基+ 4～10个连接臂+DNA序列+修饰的叠氮或二苯基环辛炔，所述DNA序列一 方面起连接作用，且与CdTe:Zn2+量子点的连接数量可通过硫代磷酸酯修饰的碱 基个数及其浓度进行调控；另外，所述DNA序列为具有靶向功能的DNA序列， 可与目标核酸、蛋白及细胞等作用；
2)将所得到的叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点溶液 用分子截留量为30KD的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗 涤离心，循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到叠氮或二苯基环辛炔修饰 DNA功能化CdTe:Zn2+量子点纯品，置于4℃下保存备用。
优选地，上述步骤1)量子点上所连接的DNA序列同时被叠氮或二苯基环 辛炔和硫代磷酸酯修饰的，由发明人设计并由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成，其5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有叠氮或二苯基环辛炔的核酸 序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*AAAA AAA ACC TTC CTC CGC AAT ACT CCC CCA GGT AAA-N3、G*G*G*G*G*G*G*G*A AAA AAAACC TTC CTC CGC AAT ACT CCC CCA GGT AAA-DBCO(5’→3’,*为硫代磷酸酯修饰， 3’端可修饰为叠氮或二苯基环辛炔)。
优选地，上述步骤1)中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸的摩尔比为 1:(0.5～3):(1～10)，亚碲酸钠与硼氢化钠的摩尔比为2:1，其中，混合水溶液中 氯化镉浓度为0.001～0.0625mM。
本发明第二方面，提供上述制备方法获得的叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA 功能化量子点。
本发明第三方面，提供叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点在蛋白 标记中的应用。
优选地，所述蛋白为葡萄糖氧化酶。
本发明第四方面，提供叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点在细胞 标记中的应用。
优选地，所述细胞表面表达唾液酸受体，因为加入的糖基化合物会通过多步 酶催化生成唾液酸，可与细胞表面唾液酸受体特异性作用。
优选地，所述细胞为HeLa细胞。
本发明第五方面，提供叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点在纳米 材料、核酸、病毒及细菌标记中的应用。
本发明提供的叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用于 葡萄糖氧化酶与HeLa细胞标记及应用的原理：如图1A所示，通过硫与金属镉 之间强的相互作用，实现一锅法合成叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点， 并通过共价偶联将二苯基环辛炔修饰在葡萄糖氧化酶表面，最后通过点击反应将 叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点与二苯基环辛炔修饰的葡萄糖氧化酶连 接在一起，得到量子点与葡萄糖氧化酶的复合物(GOx-QDs)；然后将GOx-QDs 用于葡萄糖的检测。如图1B所示，通过硫与金属镉之间强的相互作用，一锅法 合成了二苯基环辛炔修饰DNA功能CdTe:Zn2+量子点，在HeLa细胞培养液中加 入叠氮修饰的糖基化合物(Ac4ManNAz)，最后加入二苯基环辛炔修饰DNA功 能CdTe:Zn2+量子点，实现了HeLa细胞的高效标记与成像。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
1、在量子点的合成过程中，加入叠氮或二苯基环辛炔和硫代磷酸酯共同修 饰的DNA，首次一步法合成了叠氮或二苯基环辛炔修饰的DNA功能化量子点， 并将该标记试剂应用于葡萄糖氧化酶及HeLa细胞的标记。与常用的共价偶联法 相比，该方法无需任何偶联，制备方法简单、成本低，不需要昂贵的设施，在一 般实验室均可完成。
2、与其他共价偶联方法对比，该探针用于蛋白酶的标记具有连接效率高、 无副产物、标记速度快、可增强蛋白酶活性及量子点的稳定性等优势。所制备的 GOx-QDs用于葡萄糖检测线性范围为0.1-20μM，检出限为0.017μM。
3、与其他生物标记方法对比，该探针用于HeLa细胞的标记具有无需任何 化学修饰试剂、标记效率高、发光效率高等优点。
4、叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点还可用于其他多种分子的 修饰，如纳米材料自组装、蛋白、核酸、细胞、病毒及细菌等，具有较好的普适 性。量子点的生物标记能更好地拓宽量子点在生物传感、成像与示踪等方面的应 用。
附图说明
图1为叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用于葡萄糖氧化 酶与HeLa细胞标记及应用的原理图。
图2为实施例1所合成的叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的透射电镜与 紫外-可见光吸收光谱表征图。
图3为实施例1所制备的叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点与葡萄糖氧化 酶偶联的表征图。
图3A为葡萄糖氧化酶偶联前后的圆二色谱图，图3B为葡萄糖氧化酶偶联 前后的表面电势表征结果.
图4为实施例2所制备的GOx-QDs用于葡萄糖检测的光谱与线性关系图。
图4A为葡萄糖检测的光谱图；图4B为在一定浓度范围内，量子点的荧光 与葡萄糖的浓度呈线性关系。
图5为实施例1所合成的叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点与葡萄糖氧化 酶混合用于葡萄糖的检测。
图5A为葡萄糖检测的光谱图；图5B所示，在一定浓度范围内，量子点的 荧光与葡萄糖的浓度呈线性关系。
图6为实施例2所制备的GOx-QDs用于葡萄糖的可视化检测结果。
图6A为量子点与葡萄糖氧化酶混合及GOx-QDs两种探针分别用于葡萄糖 的可视化检测结果；图6B为量子点的灰度值与葡萄糖浓度的线性关系，插图为 GOx-QDs用于纸芯片检测葡萄糖的分析结果。
图7为实施例2所制备的GOx-QDs用于血糖浓度的测定。
图7A为探针加入不同血样的光谱图；图7B为该方法测定的血糖浓度与商 品化仪器测定的结果。
图8为实施例7所合成的二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的细 胞毒性。
图9为不同用量的实施例3所合成的二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用于HeLa细胞标记与成像的结果。
图10为实施例3所合成的二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点与 HeLa细胞不同孵育时间用于标记与成像的结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的 实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。 【实施例1】一种叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的制备方法
其制备方法包括如下步骤：
1)将0.025mmol氯化镉、0.025mmol氯化锌和0.05mmol N-乙酰-L-半胱氨 酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH 值至9.0；取0.01mmol亚碲酸钠与0.005mmol硼氢化钠，加入10mL的单口烧 瓶中，置于冰浴、无氧条件下反应5h，为混合溶液B；快速将混合溶液B转入 混合溶液A中，最后加入25nmol叠氮与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均 匀后转移至水热反应釜中，于200℃下反应30min，得到叠氮修饰DNA功能化 CdTe:Zn2+量子点；
所述的DNA由发明人设计好交由上海生工合成，其5’端修饰有硫代磷酸 酯，3’端修饰有叠氮的核酸序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*A AAA AAA ACC TTC CTC CGC AAT ACTCCC CCA GGT AAA-N3(5’→3’,*为硫代磷酸酯修饰， 序列亦可换成5’端修饰有叠氮，3’端修饰有硫代磷酸酯)。
2)将所得的叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点溶液用分子截留量为30 KD的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗 涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到荧光染料修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量 子点纯品，置于4℃下保存备用，需要时再将其稀释成所需浓度的水溶液。
由图2A的透射电镜图可知，量子点具有良好的分散性与粒径均一性。由图 2B的紫外-可见吸收光谱图可知，该探针存在257nm及578nm两个明显的吸收 峰，其分别为DNA与量子点的吸收峰，可见，叠氮修饰的DNA已成功连接到 量子点上。
【实施例2】一种叠氮修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用于葡萄糖氧化酶标记 的方法
其标记方法包括如下步骤：
首先，将葡萄糖氧化酶(GOx)进行DBCO修饰。称取0.5mg NHS-DBCO试 剂，加入20μLDMSO溶解；再称取10mg GOx，溶于500μL Tris-HCl缓冲溶 液(pH 7.4,20mM)，将溶于DMSO的NHS-DBCO试剂加入上述GOx溶液中， 反应过夜。用30KD超滤管对上述反应溶液进行离心超滤，超滤时间为10min， 转速为5000rpm。最后，将超滤得到的GOx-DBCO溶液加入实施例1制备的 N3-DNA功能化CdTe:Zn2+QDs溶液中，反应4h，再用100KD超滤管对上述反 应溶液进行离心超滤，超滤时间为10min，转速为5000rpm。将所得到的 GOx-QDs置于4℃冰箱中保存，备用。
图3A为葡萄糖氧化酶偶联前后的圆二色谱图，如图所示，葡萄糖氧化酶修 饰前后圆二色谱有着明显的区别，初步表明量子点成功修饰到葡萄糖氧化酶表 面。图3B为葡萄糖氧化酶偶联前后的表面电势表征结果，如图3B所示，葡萄 糖氧化酶修饰前后表面电势有比较明显的区别，进一步证明量子点成功修饰到葡 萄糖氧化酶表面。
【实施例3】一种葡萄糖氧化酶-量子点(GOx-QDs)复合物用于葡萄糖检测的 方法
其检测方法包括如下步骤：
取10μL【实施例2】制备的GOx-QDs(400nM)，并加入不同浓度的葡萄 糖，加入20mM的Tris缓冲液(pH＝8.4)使得反应体系的总体积为400μL。 将混合溶液于室温条件下反应30min，然后，用350nm作为激发波长测定其荧 光光谱。
如图4A所示，量子点的荧光随着葡萄糖浓度的增加而逐渐降低。如图4B 所示，在一定浓度范围内，量子点的荧光与葡萄糖的浓度呈线性关系，线性范围 为0.1-20μM，检出限为0.017μM。
【实施例4】一种葡萄糖氧化酶与量子点混合用于葡萄糖检测的方法
其检测方法包括如下步骤：
取10μL【实施例1】制备的量子点(400nM)，加入固定量的葡萄糖氧化 酶(5U/mL)，再加入不同浓度的葡萄糖，最后加入20mM的Tris缓冲液(pH ＝8.4)使得反应体系的总体积为400μL。将混合溶液于室温条件下反应60min， 然后，用350nm作为激发波长测定其荧光光谱。
图5A为葡萄糖检测的光谱图，如图所示，量子点的荧光随着葡萄糖浓度的 增加而逐渐降低。如图5B所示，在一定浓度范围内，量子点的荧光与葡萄糖的 浓度呈线性关系，线性范围为1-50μM，检出限为0.27μM。将量子点与葡萄糖 氧化酶混合用于葡萄糖检测的方法与【实施例3】GOx-QDs用于葡萄糖检测的 方法比较，发现GOx-QDs用于葡萄糖的检测具有更快的速度、更宽的线性范围 及更高的检测灵敏度。
【实施例5】一种葡萄糖氧化酶-量子点复合物(GOx-QDs)用于葡萄糖可视化 检测的方法，其检测方法包括如下步骤：
1)取5μL GOx-QDs(4μM)，再加入不同浓度的葡萄糖，最后加入20mM 的Tris缓冲液(pH＝8.4)使得反应体系的总体积为200μL。将混合溶液于室温 条件下反应10min，然后，在紫外暗箱中用激发波长为365nm的紫外灯照射、 观察并拍照。
2)取5μL裸量子点(4μM)，再加入不同浓度的葡萄糖，最后加入20mM 的Tris缓冲液(pH＝8.4)使得反应体系的总体积为200μL。将混合溶液于室温 条件下反应10min，然后，在紫外暗箱中用激发波长为365nm的紫外灯照射、 观察并拍照。
3)取2μL GOx-QDs(400nM)，滴入纸芯片上，再加入2μL不同浓度的葡 萄糖，反应2min，然后，在紫外暗箱中用激发波长为365nm的紫外灯照射、观 察并拍照。
图6A为量子点与葡萄糖氧化酶混合及GOx-QDs两种探针分别用于葡萄糖 的可视化检测结果，由图可知，GOx-QDs用于葡萄糖检测具有更高的检测灵敏 度。图6B中的插图为GOx-QDs用于纸芯片检测葡萄糖的分析结果，当葡萄糖 浓度增加时，荧光强度降低，且该方法分析速度快，仅需两分钟。根据量子点的 灰度值与葡萄糖浓度的关系，可建立良好的线性关系。
综上所述，该探针可实现葡萄糖的可视化检测，且检测灵敏度高。而且该探 针还可用于葡萄糖的纸芯片分析。该方法分析速度快，灵敏度高。此外，该方法 能简单快速地实现实际样品检测，在实际样品分析中具有一定的应用价值。
【实施例6】一种葡萄糖氧化酶-量子点复合物(GOx-QDs)用于糖尿病患者的 血糖浓度测定的方法
其检测方法包括如下步骤：
正常人与糖尿病患者的血液样本由武汉大学中南医院提供。血液样本先通过 离心将血浆分离得到血清样品，转速为5000rpm，时间为10min。100μL【实 施例2】所制备的GOx-QDs(80nM)及1.0μL血清样品加入Tris-HCl溶液中(20 mM pH 8.4)，总体积为400μL。室温下反应30min，以350nm为激发波长测定 其荧光光谱。
图7A为探针加入不同血样的光谱图，不同的血样会对量子点的荧光造成不 同的猝灭效果，根据图4所建立的线性关系，计算可得血糖的浓度。图7B为该 方法测定的血糖浓度与商品化仪器测定的结果，由图可知，该方法可实现对血糖 浓度的准确测定。
【实施例7】一种二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的制备方法
其合成方法包括如下步骤：
1)将0.025mmol氯化镉、0.025mmol氯化锌和0.05mmol N-乙酰-L-半胱氨 酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH 值至9.0；取0.01mmol亚碲酸钠与0.005mmol硼氢化钠，加入10mL的单口烧 瓶中，置于冰浴、无氧条件下反应5h，为混合溶液B；快速将混合溶液B转入 混合溶液A中，最后加入25nmol二苯基环辛炔与硫代磷酸酯共同修饰的DNA， 搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于200℃下反应30min，得到二苯基环辛炔 修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点；
所述的DNA由发明人设计并由上海生工合成，其5’端修饰有硫代磷酸酯， 3’端修饰有二苯基环辛炔的核酸序列分别为G*G*G*G*G*G*G*G*A AAA AAA ACC TTC CTC CGC AATACT CCC CCA GGT AAA-DBCO(5’→3’,*为硫代磷 酸酯修饰，序列亦可换成5’端修饰有二苯基环辛炔，3’端修饰有硫代磷酸酯)。
2)将所得到的CdTe:Zn2+量子点溶液用分子截留量为30KD的超滤管进行 离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超 滤管倒置离心，得到CdTe:Zn2+量子点纯品，置于4℃下保存备用，需要时再将 其稀释成所需浓度的水溶液。
图8为上述所合成的二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点的细 胞毒性。如图所示，当量子点的浓度为250nM时，对HeLa细胞的毒性仍然不 明显，表明该量子点可较好的用于HeLa细胞的标记与成像。
【实施例8】一种二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用于HeLa细 胞标记的方法
其标记方法包括如下步骤：
对【实施例7】制备的二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点用量 进行了优化，如图9所示，当加入的量子点越多时，HeLa细胞内的荧光强度越 明显；当量子点的用量为50μL时，效果与量子点加入量为40μL的效果相当， 表明量子点的加入量基本达到饱和。
将HeLa细胞孵育在含有40μM Ac4ManNAz的培养基中，孵育时间分别为 3、6、12和24h，孵育温度为37℃。孵育完后，轻轻吸干培养基，然后用1mL PBS冲洗细胞两次。然后，再把HeLa细胞孵育在含有DBCO-DNA功能化量子 点(40μL)的培养基中，孵育时间为4h，孵育温度为37℃。将含DBCO-DNA 功能化量子点的培养基轻轻抽吸，用1mL培养基冲洗细胞三次。再将HeLa细 胞在培养基中孵育30min，轻轻抽吸培养基，用1mL培养基冲洗细胞三次。最 后用新鲜培养基替代旧培养基，用共聚焦显微镜观察HeLa细胞。
如图10所示，加入相同量的Ac4ManNAz，当孵育时间越长时，HeLa细胞 内的荧光强度越明显；当孵育时间为24h时，HeLa的成像效果已经非常明显， 表明Ac4ManNAz的孵育时间基本已经足够。图9与图10的实验结果表明二苯 基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点可用于HeLa细胞的无修饰及快速标 记与成像。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种基于点击化学的DNA功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(8)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (45)
<223> 3’端修饰为叠氮或二苯基环辛炔
<400> 1
ggggggggaa aaaaaacctt cctccgcaat actcccccag gtaaa 45

Claims (9)

1.一种叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点，其特征在于，所述叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点通过以下合成方法制备获得，具体包括如下步骤：
1）将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液A，其中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸的摩尔比为1: (0.5～3): (1～10)，用氢氧化钠溶液调节混合溶液A的pH值至8.0～9.0，混合水溶液中氯化镉浓度为0.001～0.0625 mM；取亚碲酸钠与硼氢化钠，使其摩尔比为2：1，加入10 mL单口烧瓶中，置于冰浴、无氧条件下反应5 h，为混合溶液B，快速将混合溶液B转入混合溶液A中，最后加入20～200 µM 叠氮或二苯基环辛炔与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，于150～200 ℃下反应20 ～35 min，得到叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点；所述的叠氮或二苯基环辛炔与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，其 5’端修饰有硫代磷酸酯，3’端修饰有叠氮或二苯基环辛炔的核酸序列分别为G*G*G* G*G*G* G*G*A AAA AAA ACC TTC CTC CGC AATACT CCC CCA GGT AAA-N3、G*G*G* G*G*G* G*G*A AAA AAA ACC TTC CTC CGC AAT ACTCCC CCA GGT AAA-DBCO， *为硫代磷酸酯修饰，N3代表叠氮，DBCO代表二苯基环辛炔；
2）将所得到的叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点溶液用分子截留量为30 KD的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化CdTe:Zn2+量子点纯品，置于4 ℃下保存备用。
2.权利要求1所述的叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点在蛋白标记中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白为葡萄糖氧化酶。
4.权利要求1所述的二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点在细胞标记中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞表面表达唾液酸受体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞为HeLa细胞。
7.权利要求1所述的叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点在纳米材料、核酸、病毒及细菌标记中的应用。
8.一种葡萄糖氧化酶-量子点GOx-QDs复合物，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶-量子点GOx-QDs复合物通过以下合成方法制备获得，具体包括如下步骤：
首先，将葡萄糖氧化酶GOx进行DBCO修饰：称取0.5 mg NHS-DBCO试剂，加入20 μL DMSO溶解；再称取10 mg GOx，溶于500 μL pH 7.4, 20 mM Tris-HCl缓冲溶液，将溶于DMSO的NHS-DBCO试剂加入上述GOx溶液中，反应过夜；用30 KD超滤管对上述反应溶液进行离心超滤得到GOx-DBCO，超滤时间为10 min，转速为5000 rpm；最后，将超滤得到的GOx-DBCO溶液加入权利要求1所述的叠氮修饰DNA功能化量子点溶液中，反应4 h，再用100 KD超滤管对上述反应溶液进行离心超滤，超滤时间为10 min，转速为5000 rpm，将得到的葡萄糖氧化酶-量子点GOx-QDs置于4℃冰箱中保存，备用。
9.权利要求8所述的葡萄糖氧化酶-量子点GOx-QDs复合物在制备检测葡萄糖的试剂中的应用。
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