CN109957522B - 一株特基拉芽孢杆菌cas-mei-2-33及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌CAS‑MEI‑2‑33及其应用，属于烟草废弃物回收再利用技术领域。该菌株于2017年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14826。该菌株具有生长迅速、能降解果胶的性能，且该菌株可以以烟草废弃物为原料发酵生产果胶酶，获得果胶酶的粗酶液，该菌株能够使得烟草废弃物变废为宝，既在一定程度上提高了烟草废弃物的利用问题，又扩大了碱性果胶酶的来源。本发明菌株适用于发酵生产果胶酶。

Description

一株特基拉芽孢杆菌CAS-MEI-2-33及其应用
技术领域
本发明涉及一株特基拉芽孢杆菌CAS-MEI-2-33及其应用，属于烟草废弃物回收再利用技术领域。
背景技术
我国是烟草生产大国，每年除了生产大量烟叶外，伴随产生大量的烟草废弃物，包括烟梗、烟花、烟根、烟杈、腋芽、打顶除掉的顶叶以及脚叶等，通常被大量丢弃在田间或储存霉烂，不仅是资源浪费，对环境也是一种破坏。目前虽对烟草废弃物的利用开发逐步展开，如利用其生产有机肥、制备活性炭、栽培平菇、制备工业乙醇以及生产农药等，但由于各种方法的局限性，但对其开发利用程度还远远不够。对烟草废弃物的开发利用一直是适应环境友好型社会要求不断努力的方向。
研究发现，烟梗中果胶含量较高，约占7％-11％左右，目前利用烟梗生产果胶酶的菌株主要是真菌，真菌发酵周期较长，且利用真菌发酵生产的果胶酶一般偏酸性；而细菌因其繁殖快，发酵周期短，越来越被人们重视。细菌发酵所产果胶酶一般偏碱性，碱性果胶酶不仅在咖啡和茶叶发酵中、棉纤维精练和麻脱胶中发挥重要作用，而且在造纸污水处理中也有重要应用，目前，利用细菌发酵烟梗生产果胶酶还没有研究报道，该研究不仅能在一定程度上提高对烟草废弃物的利用，而且还能扩大市场所需碱性果胶酶的来源，具有重要意义。
发明内容
为扩大现有碱性果胶酶来源、提高烟草废弃物利用率的问题，本发明提供了一株特基拉芽孢杆菌CAS-MEI-2-33及其应用，该菌株能够以烟草废弃物为原料发酵生产果胶酶，在一定程度上解决了烟草废弃物的回收利用，而且扩大了碱性果胶酶来源，采用的技术方案如下：
本发明特基拉芽孢杆菌CAS-MEI-2-33是从雪茄外***烟叶中分离得到的，该菌株已经于2017年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，保藏编号为CGMCC NO.14826。
本发明特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33的筛选方法为：①菌悬液制备方法：将雪茄外***烟叶在无菌条件下粉碎后置于无菌0.85％生理盐水中，35℃-37℃恒温振荡30-60min，转速为150-180rpm/min，获得菌悬液原液，然后利用梯度稀释法获得稀释菌悬液。②利用以果胶为唯一碳源的筛选培养基进行筛选：将梯度稀释的菌悬液涂布于筛选培养基上，37℃培养箱中倒置培养48h。
将筛选获得的高产果胶酶细菌进行分子鉴定：利用引物27F和1492R对筛选到的高产果胶酶菌株进行分子鉴定，获得菌株的属水平上的分类信息。
本发明还提供了特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33在发酵生产果胶酶中的应用。
优选地，所述应用是利用所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33发酵烟草废弃物生产果胶酶。
优选地，所述烟草废弃物为烟梗。
最优地，所述应用是将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至LB液体培养基中，在35℃-37℃、150rpm-180rpm的条件下过夜活化获得一级种子液，然后按照1％(体积)接种至LB液体培养基中，在35℃-37℃、150rpm-180rpm的条件下培养获得二级种子液，将二级种子液按照3％(体积)的接种量接种至50ml发酵培养基中，于37℃下培养，发酵40h；所述发酵培养基包括如下组分：烟梗40g/L，K2HPO4 0.05％-0.15％，无水硫酸镁0.04-0.06％，硫酸铵0.25％-0.35％，硫酸亚铁0.001％，初始pH值7。
本发明还提供了一种含有特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33的菌剂。
本发明还提供了一种上述菌剂在发酵生产果胶酶中的应用。
本发明有益效果：
本发明筛选获得了一株新的菌株，该菌株经过16S rDNA分子鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，该菌株具有生长迅速、能降解果胶的性能，且该菌株可以以烟草废弃物为原料发酵生产果胶酶，获得果胶酶的粗酶液，该菌株能够使得烟草废弃物变废为宝，既在一定程度上提高了烟草废弃物的利用问题，又扩大了碱性果胶酶的来源。
本发明的菌株可以以烟草废弃物为原料发酵生产果胶酶，烟草废弃物如烟梗，可以作为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株发酵生产果胶酶的原料。利用本发明的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株，以烟草废弃物为原料，发酵获得的果胶酶具有较高的酶活，如该菌株最终利用烟梗发酵生产果胶酶经过发酵优化后活达最高可达1370.008U/ml，并且该果胶酶在40℃时具有较好的温度稳定性，在pH8.0-10.0具有较稳定的酶活力。
附图说明
图1为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33降解果胶产透明圈结果。
图2为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株发酵烟梗产酶时间曲线及发酵优化结果；图中：A，特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33发酵产酶时间曲线；B：菌株发酵烟梗发酵培养基的最适初始pH结果；C，菌株发酵烟梗发酵培养基中烟梗浓度实验结果；D，菌株发酵烟梗接种量优化实验结果。
图3为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株产果胶酶粗酶液酶学性质结果；图中：A，果胶酶粗酶液最适反应pH；B，果胶酶粗酶液最适反应温度；C，果胶酶粗酶液的温度稳定性实验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应该视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：
一、材料和方法
1、以下实施例中涉及到的培养基配方如下：
(1)LB液体培养基：Yeast extract 4.5-5.5g/L，Trypone 9.5-10.5g/L，NaCl9.5-10.5g/L.115℃-121℃高温灭菌20-30min。
(2)固体筛选培养基：果胶0.5％，K2HPO4 0.1％，无水硫酸镁0.05％，硫酸铵0.3％，硫酸亚铁0.001％，琼脂1.8％，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(3)果胶酶发酵培养基：
发酵产酶时间曲线确定培养基：烟梗1.5％-2.5％，K2HPO4 0.05％-0.15％，无水硫酸镁0.04-0.06％，硫酸铵0.25％-0.35％，硫酸亚铁0.001％，自然pH，115℃-121℃灭菌20-30min。
发酵培养基初始pH优化培养基：烟梗1.5％-2.5％，K2HPO4 0.05％-0.15％，无水硫酸镁0.04-0.06％，硫酸铵0.25％-0.35％，硫酸亚铁0.001％，利用HCl或NaOH调节初始pH至6,7,8,9，以及自然pH共五个梯度，115℃-121℃灭菌20-30min。
发酵培养基烟梗浓度优化培养基：烟梗浓度设置1％，2％，3％，4％，5％五个浓度梯度，K2HPO4 0.05％-0.15％，无水硫酸镁0.04-0.06％，硫酸铵0.25％-0.35％，硫酸亚铁0.001％，利用NaOH调节初始pH7，115℃-121℃灭菌20-30min。
发酵培养基中接种量优化培养基：烟梗浓度3.5％-4.5％，K2HPO4 0.05％-0.15％，无水硫酸镁0.04-0.06％，硫酸铵0.25％-0.35％，硫酸亚铁0.001％，利用NaOH调节初始pH7，115℃-121℃灭菌20-30min。
2、以下实施例中果胶酶测定标准曲线绘制方法：
利用D-半乳糖醛酸做标准曲线，标准曲线绘制按照下表方法进行：
半乳糖醛酸溶液(1mg/mL)：精确称取0.1000g半乳糖醛酸，用pH 9.0 50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至100mL。
表1标准体系
按表1中体系加入试剂，沸水煮沸5min，冷却后定容至25mL。0号作对照测OD540，做标准工作曲线。
经实验确定标准曲线为：y＝0.0822x-0.0839，R2＝0.9997
3、以下实施例中发酵粗酶液中果胶酶活测定方法为：
果胶酶活性定义：在反应条件下，每分钟反应生成1μmol半乳糖醛酸所需要的酶量定义为一个酶活单位，用U/mL表示。果胶酶活力计算公式如下：
式中：△A-样品与对照的吸光度差值；N-稀释倍数；K-半乳糖醛酸标准曲线斜率；t-反应时间，30min；M-半乳糖醛酸分子量，M＝194.14。
果胶酶活测定体系为：20μL粗酶液+1mL 0.2％果胶底物(pH 9.0、50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制)于10mL离心管中混匀，于50℃水浴反应30min，反应结束后，加入1mL DNS试剂，沸水中精确煮沸5min终止反应，置于冰水中冷却，后放置至室温，在波长540nm下测定其吸光度，以灭活处理的等量粗酶液作为空白对照。在反应前将粗酶液进行稀释，使测量的吸光值范围在标准曲线数值的范围内。
二、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株的筛选
1.菌悬液制备方法：
将雪茄外***烟叶在无菌条件下粉碎后置于无菌0.85％生理盐水中，37℃恒温振荡60min，转速为150rpm/min，获得菌悬液原液，然后利用梯度稀释法获得稀释菌悬液。
2.固体筛选培养基及培养：
以果胶为唯一碳源的筛选培养基成分为：果胶0.5％，K2HPO4 0.1％，无水硫酸镁0.05％，硫酸铵0.3％，硫酸亚铁0.001％，琼脂1.8％，pH 7.0，121℃灭菌20min。将梯度稀释的菌悬液涂布于筛选培养基上，37℃培养箱中倒置培养48h。培养后经刚果红染色、氯化钠脱色处理后，获得能明显产生透明圈的细菌。
三、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株的鉴定
1.将所选筛选分离的细菌，培养于LB液体培养基中，培养12～24h后，得到菌悬液。
2.取菌悬液，离心弃上清，提取基因组DNA，以提取基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增程序如表2所示。
PCR上游引物为27F：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(SEQIDNO.2)
下游引物1492R：5’-cggctaccttgttacgactt-3’(SEQIDNO.3)
表1 PCR扩增体系(50μL)
表2 PCR扩增程序
3.取5μLPCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测。
4.将在1500bp左右有条带出现的PCR产物，送去测序公司测序，测序结果，利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对，该16S rDNA序列与特基拉芽孢杆菌16SrDNA序列有100％的相似性，初步鉴定改菌种为特基拉芽孢杆菌。该菌株保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14826。测序结果如SEQIDNO.1所示。
四、利用烟梗发酵高产果胶酶及优化实验
(1)产果胶酶菌株的发酵：
①菌种活化培养获得一级种子液：将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌种接种至3-5ml LB液体培养基中，35-37℃，150-180rpm振荡培养8-12h，获得一级种子液。
②将一级种子液按照3％-5％(体积分数)的接种量接种至发酵培养基中，35-37℃，150-180rpm振荡培养，从接种后培养4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h等时间点取样，经8000-12000rpm低温离心3-5min后保留上清，4℃保存，检测发酵上清液中果胶酶的酶活，确定CAS-MEI-2-33菌株发酵烟梗的发酵产酶时间曲线。具体结果见图2-A，由结果可知，在发酵40h时，该菌株产果胶酶酶活最高，达293.112U/ml。
(2)特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33发酵烟梗产果胶酶的发酵条件优化，包括发酵培养基的初始pH、培养基中烟梗浓度及接种量几个方面进行优化。具体包括以下操作步骤：
①在发酵产酶时间确定的基础上，对发酵培养基的初始pH进行优化，具体步骤：将发酵培养基配好后，利用NaOH或HCl对灭菌前培养基的pH调整为6、7、8和9四个pH梯度以及自然pH共五个梯度作为产果胶酶发酵培养基进行发酵。首先将特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至5ml LB液体培养基，37℃，180rpm过夜活化获得一级种子液，然后按照1％(体积分数)的接种至二级种子液50ml LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h获得二级种子液，将二级种子液按照5％(体积分数)接种至50ml发酵培养基中，37℃，180rpm培养，发酵40h结束后测定发酵上清液中的果胶酶活力，具体结果见图2-B，由结果可知，发酵培养基的初始pH为7时，特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33产果胶酶酶活最高，达617.6885U/ml。
②在发酵时间和发酵培养基初始pH确定的基础上，对发酵培养基中烟梗的添加浓度进行优化，具体为：将烟梗按照1％，2％，3％，4％和5％五个质量浓度作为碳源进行培养基配制，调节pH后，作为产果胶酶培养基进行发酵。首先将特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至5ml LB液体培养基，37℃，180rpm过夜活化获得一级种子液，然后按照1％(体积分数)的接种至二级种子液50ml LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h获得二级种子液，将二级种子液按照5％(体积分数)接种至50ml发酵培养基中，37℃，180rpm培养，发酵40h结束后测定发酵上清液中的果胶酶活力，具体结果见图2-C，由结果可知，发酵培养基中，烟梗的浓度在40g/L时，特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)CAS-MEI-2-33发酵产果胶酶酶活最高，达729.9023U/ml。
③在发酵时间、培养基初始pH及培养基中烟梗浓度确定后，根据实验结果配制好所需发酵培养基对特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33菌株发酵的接种量进行优化，具体为：首先将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至5ml LB液体培养基，37℃，180rpm过夜活化获得一级种子液，然后按照1％(体积分数)的接种至二级种子液50ml LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h获得二级种子液，将二级种子液按照1％，3％，5％，7％，9％(体积分数)接种量接种至50ml发酵培养基中，37℃，180rpm培养40h，发酵结束后测定发酵上清液中的果胶酶活力，获得该发酵条件下的最适接种量，具体结果见图2-D，由结果可知，接种量为3％时，在优化培养基中，特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33发酵产果胶酶酶活最高，为1370.008U/ml。
四、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33发酵烟梗产果胶酶酶学性质探索
①.粗酶液最适反应pH：以果胶为底物，按照20μL粗酶液+1mL的0.2％果胶底物(pH7.0、50mmol/L的磷酸盐缓冲液，8.0、9.0、10.0，50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制，11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠配制)于10mL离心管中混匀，在60℃下水浴30min，结束后，加入1mL DNS试剂，沸水精确煮沸5min终止反应，冷却，于波长540nm下测定其吸光度(通过利用粗酶液稀释使吸光值在标准曲线吸光值范围内)，以灭活处理的等量粗酶液作为空白对照。其中在pH10.0时该粗酶液具有最大酶活，此时酶活达1743.474U/ml，具体结果见图3-A。
②.粗酶液最适反应温度：以果胶为底物，按照20μL粗酶液+1mL的0.2％果胶底物(pH 10.0、50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制)于10mL离心管中混匀，于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴反应30min，反应结束后，加入1mL DNS试剂，沸水精确煮沸5min终止反应，冷却，于波长540nm下测定其吸光度(通过利用粗酶液稀释使吸光值在标准曲线吸光值范围内)，以灭活处理的等量粗酶液作为空白对照，其中在40℃有最高反应酶活，此时粗酶液中果胶酶酶活达1498.92U/ml，具体结果见图3-B。
(3)酶的热稳定性
将粗酶液分别放置在40℃，50℃，60℃水浴中保温，间隔20min取样，进行果胶酶活力测定，测定步骤为：以果胶为底物，按照20μL粗酶液+1mL的0.2％果胶底物(pH9.0、50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制)于10mL离心管中混匀，在60℃下水浴30反应min，结束后，加入1mL DNS试剂，沸水精确煮沸5min终止反应，冷却，于波长540nm下测定其吸光度(通过利用粗酶液稀释使吸光值在标准曲线吸光值范围内)，以灭活处理的等量粗酶液作为空白对照。以酶活力最高者为100％，计算不同温度下的相对酶活。具体结果见图3-C，该粗酶液中果胶酶在40℃、50℃下，具有较稳定的果胶酶活，分别在相应的温度下保温180min后，剩余酶活仍具有原来酶活的84％和76％。
然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一株特基拉芽孢杆菌CAS-MEI-2-33及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 测序结果
<400> 1
cggcggctgg ctcctaaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg 60
tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120
actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat 180
ttgtgggatt ggcttaacct cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt 240
gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300
gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc 360
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420
ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg atgtcaagac 480
ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540
cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg 600
cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat cgtttacggc 660
gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt 720
tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg 780
ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct 840
ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg 900
cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960
agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtaccgccc tattcgaacg gtacttgttc 1020
ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg 1080
tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg 1140
tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg ttgccttggt 1200
gagccattac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa 1260
gccacctttt atgtttgaac catgcggttc aaacaaccat ccggtattag ccccggtttc 1320
ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta 1380
acatcaggga gcaagctccc atctgtccgc tcgac 1415
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR上游引物
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR下游引物
<400> 3
cggctacctt gttacgactt 20

Claims (7)

1.一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33，其保藏编号为CGMCCNO.14826，保藏日期为2017年10月17日。
2.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33在发酵生产果胶酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是利用所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33发酵烟草废弃物生产果胶酶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述烟草废弃物为烟梗。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至LB液体培养基中，在35℃-37℃、150rpm-180rpm的条件下过夜活化获得一级种子液，然后按照体积百分比为1％的接种量接种至LB液体培养基中，在35℃-37℃、150rpm-180rpm的条件下培养获得二级种子液，将二级种子液按照体积百分比为3％的接种量接种至50ml发酵培养基中，于37℃下培养，发酵40h；所述发酵培养基包括如下组分：烟梗40g/L，K2HPO40.05％-0.15％，无水硫酸镁0.04-0.06％，硫酸铵0.25％-0.35％，硫酸亚铁0.001％，初始pH值为7。
6.含有权利要求1所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33的菌剂。
7.权利要求6所述菌剂在发酵生产果胶酶中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046341A (zh) * 2019-12-27 2021-06-29 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法
CN111393211A (zh) * 2020-03-16 2020-07-10 中国烟草总公司海南省公司 一种雪茄外***烟叶生物有机专用肥及其制备方法和应用
CN112391323B (zh) * 2020-12-03 2023-03-03 云南省烟草公司昆明市公司 一株特基拉芽孢杆菌d5-8及其应用
CN112646755B (zh) * 2021-01-22 2022-06-28 西北农林科技大学 一株特基拉芽孢杆菌及其应用
CN114317364B (zh) * 2021-12-30 2023-06-13 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用
CN115989892A (zh) * 2022-07-19 2023-04-21 云南省烟草农业科学研究院 一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法
CN116004424B (zh) * 2022-08-12 2024-04-02 大连工业大学 一株特基拉芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用
CN115918909B (zh) * 2022-12-30 2023-10-17 西南科技大学 一种猪源芽孢杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543119A (zh) * 2015-07-01 2016-05-04 鲁东大学 一株产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法
CN106282049A (zh) * 2016-08-08 2017-01-04 湖南农业大学 特基拉芽孢杆菌jn369及其应用
CN106690402A (zh) * 2017-01-12 2017-05-24 河南中烟工业有限责任公司 枯草芽孢杆菌smxp‑58菌株在烟梗中的应用
CN108285875A (zh) * 2017-01-10 2018-07-17 中国科学院微生物研究所 一株特基拉芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543119A (zh) * 2015-07-01 2016-05-04 鲁东大学 一株产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法
CN106282049A (zh) * 2016-08-08 2017-01-04 湖南农业大学 特基拉芽孢杆菌jn369及其应用
CN108285875A (zh) * 2017-01-10 2018-07-17 中国科学院微生物研究所 一株特基拉芽孢杆菌及其应用
CN106690402A (zh) * 2017-01-12 2017-05-24 河南中烟工业有限责任公司 枯草芽孢杆菌smxp‑58菌株在烟梗中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Production of alkaline pectinase: a case study investigating the use of tobacco stalk with the newly isolated strain Bacillus tequilensis CAS-MEI-2-33;Ge Zhang等;《BMC Biotechnology》;20190712;第19卷;第1-11页 *

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