CN109925540B - 在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法、生物材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法、生物材料及其应用，涉及生物材料技术领域。在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法包括：将待负载材料在碱性溶液中静置后得到碱活化材料；在碱活化材料表面固定树枝状大分子，然后将修饰后的材料浸没于白蛋白溶液中静置反应；优选地，树枝状大分子为聚酰胺‑胺型树枝状大分子PAMAM；更优选地，PAMAM的分子量为6000‑10000。该生物材料是在待负载材料表面形成PAMAM层和白蛋白层，进而介导白蛋白形成蛋白层。将该生物材料用于制备心血管植入材料，可以减少血小板的粘附起到抗凝作用，提高材料生物相容性。

Description

在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法、生物材料及其 应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，且特别涉及在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法、生物材料及其应用。

背景技术

医用钛(Ti)及钛合金由于具有较好的生物相容性、力学性能、耐腐蚀性和可加工性，其应用也越来越广泛，成为了材料学科的重要分支。最初纯钛首先在美国以及英国被用来制作螺钉、髋关节以及髓内钉等生物医用材料，自1972年起我国开始采用了国产钛和钛合金制品，国内多家医院先后使用钛和钛合金用于临床治疗和研究。在20世纪90年代中期，钛金属及合金在神经外科、口腔颌面外科、矫形外科以及心血管***等领域得到了广泛的应用。

但是，作为心血管植入材料用于冠心病的治疗领域中，钛及钛合金的生物相容性尚未达到临床的要求。因此，对现有生物材料进行生物化改性和表面功能化修饰，是改善材料的生物相容性直接有效的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，能够在材料表面介导引入白蛋白，对材料表面进行生物化改性，改善材料的生物相容性。

本发明的另一目的在于提供一种生物材料，其负载有聚酰胺-胺型树枝状大分子层上和白蛋白层，可以减少血小板的粘附起到抗凝作用，改善材料的生物相容性，可以在制备心血管植入材料中得到应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出了一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，包括如下步骤：

将待负载材料在碱性溶液中静置后得到碱活化材料；

通过在碱活化材料表面固定树枝状大分子的方式对碱活化材料进行修饰，然后将修饰后的材料浸没于白蛋白溶液中静置反应；

优选地，树枝状大分子为聚酰胺-胺型树枝状大分子PAMAM；

更优选地，PAMAM的分子量为6000-10000。

本发明还提出一种生物材料，在待负载材料表面沉积有树枝状大分子层，树枝状大分子层上负载有白蛋白；

优选地，树枝状大分子为PAMAM；

其中，白蛋白层中的白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白，待负载材料选自钛片、硅片、载玻片和不锈钢中的任意一种，优选为钛片；

优选地，生物材料是采用上述在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法制备而得。

本发明还提出上述生物材料在制备心血管植入材料中的应用。

本发明实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法的有益效果是：其通过在待负载材料浸没于碱性溶液中进行碱活化后，再于碱活化材料表面固定聚酰胺-胺型树枝状大分子，利用聚酰胺-胺型树枝状大分子与白蛋白通过疏水作用及氢键作用而结合，进而达到介导白蛋白形成蛋白层的目的。

本发明实施例还提供一种生物材料，在待负载材料表面沉积有树枝状大分子层，树枝状大分子层上负载有白蛋白；优选地，树枝状大分子为PAMAM；其在待负载材料表面形成PAMAM层和白蛋白层，进而介导白蛋白形成蛋白层，对材料表面进行生物化改性，改善材料的生物相容性，可将该生物材料用于制备心血管植入材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明方法中在钛表面利用G3-PAMAM-COOH介导白蛋白结合形成蛋白层的各步骤示意图；

图2为G3-PAMAM-COOH与白蛋白自发结合产生的荧光淬灭图，表格为G3-PAMAM-COOH与白蛋白自发结合所需的结合能，以及结合后产生的焓变、熵变、吉布斯自由能变结果；

图3为样品的傅里叶变换红外光谱与甲苯胺蓝羧基定量图；

图4为样品表面载白蛋白的MicroBCA蛋白定量结果；

图5为样品的扫描电镜图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法、生物材料及其应用进行具体说明。

本发明实施例提供了一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，请结合图1，其包括如下步骤：

S1、碱活化

将待负载材料在碱性溶液中静置后得到碱活化材料，利用碱活化过程在材料表面引入羟基基团，使材料表面带强负电。

具体地，碱活化材料的制备过程是将待负载材料在2.5-3.5mol/L的碱性溶液中静置8-12h，然后进行清洗、干燥。碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱性溶液，其浓度控制在2.5-3.5mol/L为宜，碱性溶液的浓度过高会造成材料表面腐蚀严重(影响材料表面的粗糙度，进而影响后续PAMAM的固定和白蛋白的功能)，浓度过低会影响材料表面引入羟基基团的量，进而降低后续修饰过程中PAMAM的固定量。

具体地，待负载材料选自钛片、硅片、载玻片和不锈钢中的任意一种，优选为钛，可以为市购纯钛。钛及钛合金作为应用广泛的医用材料，改善其血液相容性和细胞相容性具有十分广阔的市场应用前景。

具体地，对碱活化后的材料进行清洗可以采用RO水超声清洗，然后再浸没在UP水中于70-90℃的温度条件下静置8-12h，用UP水超声清洗，最后烘干备用。

S2、PAMAM的固定

在碱活化材料表面固定树枝状大分子，优选地，树枝状大分子为聚酰胺-胺型树枝状大分子PAMAM，更优选地，PAMAM的分子量为6000-10000。利用PAMAM的内部空腔结构，可以装载药物分子，且末端致密的官能团通过修饰可连接生物活性物质，选择性的进行偶联或改性以提高生物利用度。具体可以根据聚酰胺-胺型树枝状大分子的末端基团进行具体方法的设计。

在一些实施例中，PAMAM的末端为氨基，在碱活化材料表面固定PAMAM的过程包括：将PAMAM溶液均匀铺展在碱活化材料表面，在30-40℃的温度条件下静置2-4h。PAMAM中的氨基可以与碱活化材料表面的羟基通过静电作用结合，进而使PAMAM固定在材料表面。

优选地，在PAMAM溶液与碱活化材料反应后，对材料表面进行洗涤、干燥。具体地，PAMAM溶液可以为PAMAM与磷酸盐缓冲液(pH7-8)形成的溶液。对材料表面洗涤可以使用磷酸盐缓冲液进行清洗，可以为多次清洗，如清洗三次。

在另外的实施例中，PAMAM的末端为羧基，在碱活化材料表面固定PAMAM的过程包括：对碱活化材料表面进行氨基化处理，然后将PAMAM溶液均匀铺展在材料表面，在30-40℃的温度条件下静置2-4h。通过在碱活化材料表面的羟基和氨基的静电作用实现在材料表面引入氨基的目的，然后利用引入的氨基与PAMAM上的羧基共价结合实现PAMAM的固定。

具体地，PAMAM溶液的浓度为0.5-10mg/mL，优选为1-3mg/mL。PAMAM溶液浓度过低会导致在材料表面不能充分固定PAMAM，而溶液浓度过高也将影响后续引入的白蛋白的生物功能。

具体地，氨基化处理过程是将碱活化材料浸没于氨基溶液中，静置反应8-12h；其中，氨基溶液选自多聚左旋赖氨酸溶液、没食子酸溶液、多巴胺溶液、多巴胺与己二胺共混液和硅烷偶联剂溶液中的任意一种。采用以上几种氨基溶液均能够实现在材料表面引入氨基基团的目的，多巴胺比较适用于不锈钢材料，而没食子酸以及硅烷偶联剂的毒性较高、氨基含量低。

因此，优选地，氨基溶液为多聚左旋赖氨酸溶于磷酸盐缓冲液形成的混合液，且磷酸盐缓冲液的pH为7-8，多聚左旋赖氨酸的分子量为150-300KDa，氨基溶液的浓度为2-3mg/mL。进一步优选地，在碱活化材料与氨基溶液反应后，采用磷酸缓冲液对材料表面进行清洗，以去除未反应的多聚左旋赖氨酸。

优选地，在将PAMAM溶液均匀铺展在材料表面之前，将PAMAM溶液与羧基活化剂在30-40℃的温度条件下反应0.5-1h；其中，羧基活化剂选自二氯甲烷和/或N-羟基琥珀酰亚胺。通过羧基活化剂活化PAMAM中的羧基，使得PAMAM与材料表面的氨基能够更充分的反应结合，提高PAMAM固定过程的反应速率和反应的充分性。

S3、介导BSA形成蛋白层

将PAMAM修饰后的材料浸没于白蛋白溶液中静置反应，利用聚酰胺-胺型树枝状大分子与白蛋白通过疏水作用及氢键作用而结合，进而达到介导白蛋白形成蛋白层的目的。

具体地，将白蛋白引入材料表面的过程是在30-40℃的温度条件下反应2-4h，并用磷酸盐缓冲液漂洗；其中，白蛋白溶液选自牛血清白蛋白或人血清白蛋白，优选为牛血清白蛋白。优选地，白蛋白溶液的浓度为35-45mg/mL。采用以上两种白蛋白能够显著提升材料的生物相容性和细胞相容性，牛血清白蛋白效果较好原料易得。

本发明实施例还提供了一种生物材料，在待负载材料表面沉积有PAMAM层，且在PAMAM层上负载有白蛋白层；其中，白蛋白层中的白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白；待负载材料选自钛片、硅片、载玻片和不锈钢中的任意一种，优选为钛片。通过在PAMAM层上负载白蛋白层，使PAMAM层和白蛋白层稳定装载在材料表面，在材料表面形成蛋白层。

优选地，生物材料是通过上述在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法制备而得，通过上述修饰方法可以提高对材料进行生物化改性。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实施例1-5中的PAMAM为购自威海晨源分子新材料有限公司的第三代产品G3-PAMAM-COOH(末端为羧基)，实施例6中使用的PAMAM为市购G3-PAMAM-NH₂(末端为氨基)。

实施例1

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其包括以下步骤：

(1)碱活化。将纯钛经表面清洗处理后，浸没于2.5mol/L的NaOH溶液中，反应8小时。然后，经过RO水超声清洗后，浸没于UP水中，在80℃条件下静置8小时，用UP水超声清洗，再烘干备用。

(2)表面氨基化。将经碱活化后的样品浸没于浓度为2mg/mL的多聚左旋赖氨酸溶液中(平均分子量约为150KDa的多聚左旋赖氨酸溶于pH＝7的磷酸盐缓冲液形成)，反应8h，然后用磷酸盐缓冲液清洗3遍后保存备用。

(3)PAMAM的共价固定。用分子量约为1000的PAMAM(末端为羧基)配置0.5mg/mL的树枝状大分子溶液，加入羧基活化剂二氯甲烷在30℃条件下反应0.5h，将树枝状大分子端部的羧基活化后，立即将树枝状大分子溶液滴加至氨基化修饰的的钛表面并在30℃下静置反应2h，最后用蒸馏水漂洗样品，干燥后即得载PAMAM的修饰表面。

(4)介导BSA形成蛋白层。将(3)步骤获得的样品浸没于35mg/ml的BSA溶液，在30℃条件下静置反应2h，PBS充分漂洗后即得目标物。

实施例2

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其包括以下步骤：

(1)碱活化。将纯钛经表面清洗处理后，浸没于3.5mol/L的NaOH溶液中，反应12小时。然后，经过RO水超声清洗后，浸没于UP水中，在90℃条件下静置12小时，用UP水超声清洗，再烘干备用。

(2)表面氨基化。将经碱活化后的样品浸没于浓度为3mg/mL的多聚左旋赖氨酸溶液中(平均分子量约为300KDa的多聚左旋赖氨酸溶于pH＝8的磷酸盐缓冲液形成)，反应12h，然后用磷酸盐缓冲液清洗3遍后保存备用。

(3)PAMAM的共价固定。用分子量约为100000的PAMAM(末端为羧基)配置10mg/mL的树枝状大分子溶液，加入羧基活化剂N-羟基琥珀酰亚胺在40℃条件下反应1h，将树枝状大分子端部的羧基活化后，立即将树枝状大分子溶液滴加至氨基化修饰的钛表面并在40℃下静置反应4h，最后用蒸馏水漂洗样品，干燥后即得载PAMAM的修饰表面。

(4)介导BSA形成蛋白层。将(3)步骤获得的样品浸没于45mg/ml的BSA溶液，在40℃条件下静置反应4h，PBS充分漂洗后即得目标物。

实施例3

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其包括以下步骤：

(1)碱活化。将纯钛经表面清洗处理后，浸没于3mol/L的NaOH溶液中，反应10小时。然后，经过RO水超声清洗后，浸没于UP水中，在85℃条件下静置10小时，用UP水超声清洗，再烘干备用。

(2)表面氨基化。将经碱活化后的样品浸没于浓度为2.5mg/mL的多聚左旋赖氨酸溶液中(平均分子量约为200KDa的多聚左旋赖氨酸溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液形成)，反应10h，然后用磷酸盐缓冲液清洗3遍后保存备用。

(3)PAMAM的共价固定。用分子量约为9000的PAMAM(末端为羧基)配置1mg/mL的树枝状大分子溶液，加入羧基活化剂N-羟基琥珀酰亚胺在37℃条件下反应0.8h，将树枝状大分子端部的羧基活化后，立即将树枝状大分子溶液滴加至氨基化修饰的的钛表面并在37℃下静置反应3h，最后用蒸馏水漂洗样品，干燥后即得载PAMAM的修饰表面。

(4)介导BSA形成蛋白层。将(3)步骤获得的样品浸没于40mg/ml的BSA溶液，在37℃条件下静置反应3h，PBS充分漂洗后即得目标物。

实施例4

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：树枝状大分子溶液的浓度为3mg/mL。

实施例5

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：将钛片替换为不锈钢片，多聚左旋赖氨酸溶液替换为等浓度的多巴胺溶液。

实施例6

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其包括以下步骤：

(1)碱活化。将纯钛经表面清洗处理后，浸没于3mol/L的NaOH溶液中，反应10小时。然后，经过RO水超声清洗后，浸没于UP水中，在85℃条件下静置10小时，用UP水超声清洗，再烘干备用。

(2)PAMAM的共价固定。用分子量约为9000的PAMAM(末端为氨基)配置4mg/mL的树枝状大分子溶液，将树枝状大分子溶液滴加至氨基化修饰的钛表面并在37℃下静置反应3h，最后用蒸馏水漂洗样品，干燥后即得载PAMAM的修饰表面。

(4)介导BSA形成蛋白层。将(3)步骤获得的样品浸没于40mg/ml的BSA溶液，在37℃条件下静置反应3h，PBS充分漂洗后即得目标物。

实施例7-14

本实施例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：实施例7-14中对应的树枝状大分子的浓度依次为：2mg/mL、4mg/mL、7mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、25mg/mL、40mg/mL、60mg/mL。

对比例1

本对比例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：树枝状大分子的浓度为0mg/mL。

对比例2

本对比例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：采用6mol/L的NaOH溶液进行碱活化。

对比例3

本对比例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：碱活化时间为24h。

对比例4

本对比例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：PAMAM的共价固定中，没有用羧基活化剂进行活化。

对比例5

本对比例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：多聚赖氨酸溶液的浓度为0.5mg/mL。

对比例6

本对比例提供一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：PAMAM溶液的浓度为10mg/mL。

试验例1

测试G3-PAMAM-COOH与白蛋白自发结合产生的荧光淬灭图(即图2)，以及G3-PAMAM-COOH与白蛋白自发结合所需的结合能，以及结合后产生的焓变、熵变、吉布斯自由能变结果(即图2中表格)，证明G3-PAMAM-COOH可以与白蛋白自发结合。

白蛋白中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基能在吸收能量后发射荧光，使得白蛋白具有内源性荧光，当G3-PAMAM-COOH与白蛋白有结合作用时，就会使得白蛋白的荧光产率减小，荧光的强度降低。通过这种荧光淬灭现象，可以计算G3-PAMAM-COOH与白蛋白的结合常数Kb，以及两者结合产生的熵变△S、焓变△H和吉布斯能变△G。

测试实施例7-14以及对比例1中不同浓度的树枝状大分子对应的白蛋白荧光强度的变化。具体测试方法如下：

首先使用Stern-Volmer方程计算淬灭常数K_sv与双分子淬灭速率常数K_q，

其中，F和F₀分别表示存在和不存在树枝状大分子时荧光物质的荧光强度；Kq是双分子猝灭速率常数；τ₀是不存在树枝状大分子时激发态荧光物质的荧光寿命，约为10^-8s；[Q]为树枝状大分子的浓度；Ksv为Sterm-Volmer猝灭常数，是双分子猝灭速率和单分子衰变速率的比值，可以由F₀/F与[Q]所作线性回归方程的斜率得到。通过K_q、K_sv值可判断此淬灭过程为静态淬灭，故使用静态淬灭公式：

计算出树枝状大分子与白蛋白的结合位点n与结合常数K_b。

在温度变化不大的情况下，即在蛋白质分子稳定的温度范围内，反应的焓变△H的变化小可以认定为常数，此时熵变△S和焓变△H就可以通过Van’t Hoff方程求出：

其中：Kb：温度为T时药物-蛋白质的结合常数R：温度为T时的气体常数，再以lnK_b对1/T作图，由斜率和截距可以分别求出△H和△S，最后由如下公式计算树枝状大分子与白蛋白结合的自由能变△G。

ΔG＝ΔH-TΔS

通过图2的荧光光谱图可以看到，随着加入树枝状大分子浓度的增大，白蛋白的荧光强度逐渐减低；表格为通过荧光数据计算得到的结合常数Kb、熵变△S、焓变△H和吉布斯能变△G。结果显示，负的ΔH说明树枝状大分子与白蛋白的结合为放热过程；负的ΔH和正的ΔS说明了在两者结合过程中，疏水和H-键起主要的作用；负的ΔG表面两者的结合过程为自发进行。

试验例2

测试实施例3中经过碱活化后的样品TiOH、经过多聚左旋赖氨酸修饰后的样品TiOHP、固定G3-PAMAM-COOH后的样品TiOHPP的红外谱图，结果见图3(A)。对上述三个样品中的羧基进行定量检测，测试方法甲苯胺蓝羧基定量法。结果见图3(B)。

图3(A)的红外结果显示，经碱活化后的样品TiOH在3296cm^-1处出现了明显的-OH震动吸收峰，说明碱活化后Ti表面出现了羟基(-OH)；经多聚赖氨酸PLL修饰后的样品TiOHP，在1654cm^-1和1556cm^-1处分别出现了酰胺I带的C＝O伸缩振动峰和酰胺II带的C-N、N-H面内弯曲振动吸收峰；固定了G3-PAMAM-COOH后的样品TiOHPP，C-N对应的吸收峰变得明显，这是因为PAMAM含有大量的C-N结构，由此产生了明显的酰胺三带吸收峰。

由于每个G3-PAMAM-COOH分子末端含有32个羧基基团，故可以通过测定样品表面羧基含量反映样品表面固定的G3-PAMAM-COOH含量。通过图3(B)的羧基定量结果可以看到，未经处理的Ti样品不含有羧基；碱活化后的样品TiOH会呈现一定假阳性，是因为TiOH样品表面含有较多的带负电荷的羟基，会通过静电作用吸附甲苯胺蓝试剂导致实验结果的假阳性；引入多聚左旋赖氨酸后的样品TiOHP，其表面富含带正电的氨基基团，而数据显示依然呈现假阳性的原因可能是多聚左旋赖氨酸也会吸附少量的甲苯胺蓝试剂使得结果呈假阳性；对于表面固定G3-PAMAM-COOH后的样品TiOHPP，其羧基含量达到了25.3nmol/cm²，表明了G3-PAMAM-COOH成功固定在材料表面。

试验例3

测试实施例3中钛片Ti、碱活化后的样品TiOH、经过多聚左旋赖氨酸修饰后的样品TiOHP、固定G3-PAMAM-COOH后的样品TiOHPP分别浸泡在实施例3中提供的白蛋白溶液中反应后，测试样品表面白蛋白的含量。并采用等浓度的食盐水浸泡进行对比，测试结果见图4。

图4显示了Ti表面接枝BSA前后的MicroBCA蛋白定量结果，BSA为经白蛋白溶液浸泡后的样品组，NaCl为浸泡在生理盐水的对照组。可以看出，样品Ti只吸附了少量的蛋白；经碱活化后的样品TiOH，由于样品表面腐蚀导致样品粗糙度较大，且样品含有活性较高的羟基，使得样品吸附了较多的白蛋白；接枝PLL后的样品TiOHP，蛋白吸附量相对减少；固定了树枝状大分子后的样品TiOHPP，表面白蛋白含量为12.6μg/cm²，说明了可以通过G3-PAMAMA-COOH介导白蛋白在材料表面形成蛋白层。

试验例4

测试实施例3中得到产品的扫描电镜图，结果见图5，其中图A为纯钛样品表面形貌，图B为构建形成蛋白层后样品表面形貌。

图5显示了在放大四千倍数后，样品表面构建蛋白层前后的形貌变化，通过观察可以看到，纯钛样品Ti表面(图A)较为光滑平整，而经过构建形成白蛋白层后的样品表面(图B)出现了网状结构，样品表面的粗糙度明显增大，且有明显的蛋白层覆盖在材料表面。

试验例5

测试实施例3-5和对比例2-6中得到材料的性能，包括由于树枝状大分子的引入带来羧基基团含量，通过树枝状大分子的介导引入的BSA蛋白含量以及材料的血液相容性评价，测试结果见表1。测试方法：(1)PAMAM末端羧基含量：甲苯胺蓝羧基定量分析。(2)BSA蛋白含量：MicroBCA蛋白定量分析；(3)血液相容性评价：血小板粘附与激活检测。

表1材料性能检测结果

由表1可知，影响树枝状大分子固定量的因素有：树枝状大分子的浓度、树枝状大分子的代数、羧基活化剂的使用、碱活化过程中NaOH浓度与时间的控制等，并且树枝状大分子的固定量、碱活化程度也影响着白蛋白的接枝量与蛋白的功能。

通过对比实施例3与对比例2、对比例3可以发现，当NaOH浓度过高或碱活化时间过长时，虽然蛋白固定量较多，但会因材料过度碱活化而导致血液相容性较差；通过对比实施例3、实施例4与对比例4、对比例5可以发现，当树枝状大分子的固定量不足时，会使得蛋白的接枝量减少，材料的血液相容性较差；通过对比实施例3、实施例4与对比例6可以发现，随着树枝状大分子浓度的增大，其固定量在增大，且蛋白接枝量也在增大，当树枝状大分子的浓度大于3mg/ml后，材料的羧基含量趋于稳定，说明材料表面的树枝状大分子固定量趋于饱和，且白蛋白的接枝量也不再增加；通过对比实施例3、实施例4与实施例5可以发现，对比于不锈钢基底修饰的材料，使用钛作为基底修饰的材料，其固定的树枝状大分子含量、蛋白含量较高，且材料的血液相容性也更优。综上可以得出，通过控制材料修饰过程中的工艺，可以实现对树枝状大分子固定含量、白蛋白的接枝量、材料的功能进行调节，并且以上工艺参数控制在本发明实施例提供的优选范围内为宜。

综上所述，本发明提供的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其通过在待负载材料浸没于碱性溶液中进行碱活化后，再于碱活化材料表面固定聚酰胺-胺型树枝状大分子，利用聚酰胺-胺型树枝状大分子与白蛋白通过疏水作用及氢键作用而结合，进而达到介导白蛋白形成蛋白层的目的。

本发明实施例还提供一种生物材料，其在待负载材料表面形成PAMAM层和白蛋白层，进而介导白蛋白形成蛋白层，将该生物材料用于制备心血管植入材料，可以减少血小板的粘附起到抗凝作用，提高材料生物相容性。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (17)

1.一种在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将待负载材料在碱性溶液中静置后得到碱活化材料；

通过在所述碱活化材料表面固定树枝状大分子的方式对所述碱活化材料进行修饰，然后将修饰后的材料浸没于白蛋白溶液中静置反应；

所述树枝状大分子为聚酰胺-胺型树枝状大分子PAMAM；

所述PAMAM的分子量为6000-10000；

所述PAMAM的末端为羧基，在所述碱活化材料表面固定PAMAM的过程包括：对所述碱活化材料表面进行氨基化处理，然后将PAMAM溶液均匀铺展在材料表面，在30-40℃的温度条件下静置2-4h。

2.根据权利要求1所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，在将所述PAMAM溶液均匀铺展在材料表面之前，将所述PAMAM溶液与羧基活化剂在30-40℃的温度条件下反应0.5-1h；其中，所述羧基活化剂选自二氯甲烷和/或N-羟基琥珀酰亚胺。

3.根据权利要求2所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述PAMAM溶液的浓度为0.5-10mg/mL。

4.根据权利要求2所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述PAMAM溶液的浓度为1-3mg/mL。

5.根据权利要求1所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述氨基化处理过程是将碱活化材料浸没于氨基溶液中，静置反应8-12h；

其中，所述氨基溶液选自多聚左旋赖氨酸溶液、没食子酸溶液、多巴胺溶液、多巴胺与己二胺共混液和硅烷偶联剂溶液中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述氨基溶液为多聚左旋赖氨酸溶液。

7.根据权利要求6所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述多聚左旋赖氨酸溶液是将多聚左旋赖氨酸溶于磷酸盐缓冲液形成的混合液，且所述磷酸盐缓冲液的pH为7-8，所述多聚左旋赖氨酸的分子量为150-300kDa，所述氨基溶液中多聚左旋赖氨酸的浓度为2-3mg/mL。

8.根据权利要求7所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，在所述碱活化材料与所述氨基溶液反应后，采用磷酸缓冲液对材料表面进行清洗。

9.根据权利要求1所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，将所述白蛋白引入材料表面的过程是在30-40℃的温度条件下反应2-4h，并用磷酸盐缓冲液漂洗；

其中，所述白蛋白溶液选自牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

10.根据权利要求9所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述白蛋白溶液为牛血清白蛋白。

11.根据权利要求9所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述白蛋白溶液的浓度为35-45mg/mL。

12.根据权利要求1所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述碱活化材料的制备过程是将待负载材料在2.5-3.5mol/L的碱性溶液中静置8-12h，然后进行清洗、干燥；

其中，待负载材料选自钛片、硅片、载玻片和不锈钢中的任意一种。

13.根据权利要求12所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法，其特征在于，所述待负载材料为钛。

14.一种生物材料，由权利要求1-13中任一项所述的在材料表面介导白蛋白形成蛋白层的方法制备而得，其特征在于，在待负载材料表面沉积有树枝状大分子层，所述树枝状大分子层上负载有白蛋白层；

树枝状大分子为PAMAM。

15.根据权利要求14所述的生物材料，其特征在于，所述白蛋白层中的白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白，所述待负载材料选自钛片、硅片、载玻片和不锈钢中的任意一种。

16.根据权利要求14所述的生物材料，其特征在于，所述待负载材料为钛片。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的生物材料在制备心血管植入材料中的应用。

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