CN107174657A - 制备靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物的方法以及含有该抗原组合物的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供制备靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物的方法，所述方法包括：(1)提供分离的含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群；(2)扩增所述细胞群中的胶质瘤干细胞；(3)对上述扩增之后的细胞群进行冻融裂解处理；从而得到含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物。本发明还提供含有由上述方法制备的抗原组合物、树突状细胞以及CpG寡核苷酸的疫苗，该疫苗在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。本发明的抗原组合物和疫苗能够同时靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞，从而能够有效杀伤残留的胶质瘤干细胞及胶质瘤细胞，抑制胶质瘤复发。

Description

制备靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物的方法以及含有该抗原组合物 的疫苗

技术领域

本发明涉及含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物，制备该抗原组合物的方法，含有该抗原组合物的疫苗，以及该抗原组合物在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。

背景技术

目前脑胶质瘤的主要治疗方法为手术切除，辅以放化疗，但由于胶质瘤浸润性生长的特点，肿瘤组织难于全部清除，由于病灶位置特殊，放射治疗和化疗也效果不佳。肿瘤干细胞的理论及胶质瘤干细胞的分离和鉴定指出了胶质瘤治疗后易复发、生存率低的罪魁祸首是因为胶质瘤干细胞可自我更新，具有高度的分化潜能以及对放化疗不敏感等生物特性，残留在病灶内的少量胶质瘤干细胞，在放化疗后，依旧可迅速促进胶质瘤的发生发展，因此脑胶质瘤干细胞作为是脑胶质瘤发生和发展的元凶，同时也是治疗的重要靶标。

免疫治疗已经成为胶质瘤治疗中最有希望的手段之一，目前针对胶质瘤进入临床试验阶段的免疫治疗策略主要集中为：提供胶质瘤抗原(主要为各种蛋白裂解物)，提供抗原提呈细胞(主要为树突状细胞)，通过体外将抗原负载于抗原提呈细胞后，将抗原提呈细胞回输给肿瘤患者，在患者体内激活特异性效应性T细胞，进而有效杀伤肿瘤。例如：CN1705489A中公开了将肿瘤细胞制备得到的抗原负载到树突状细胞上，并用所得树突状细胞治疗癌症的方法。

现有技术仅公开了如何通过分离分选得到脑胶质瘤干细胞，但由于无法通过胶质瘤干细胞标志性蛋白(如CD133等)分选获得全部胶质瘤干细胞，术后组织获得胶质瘤细胞经过分选后获得细胞数量极少，并不能获得大量可知和未知的胶质瘤干细胞来源的抗原；现有技术仅公开了通过胶质瘤干细胞裂解物与树突状细胞接触进行抗原提呈，该方法并不能有效的模拟体内抗原提呈过程，仍然存在其他抗原提呈细胞(如B细胞)未参与抗原提呈，抗原提呈细胞无法快速识别激活效应细胞等的问题。

发明内容

一方面，本发明提供制备靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物的方法，所述方法包括：

(1)提供分离的含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群；

(2)扩增所述细胞群中的胶质瘤干细胞；

(3)对上述扩增之后的细胞群进行冻融裂解处理；从而得到含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物。

在一种实施方式中，所述含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群通过对胶质瘤组织进行切碎、过滤、分离和裂解红细胞得到，所述胶质瘤组织选自：星形细胞瘤组织、胶质母细胞瘤组织、多形性胶质母细胞瘤组织、转移性脑胶质瘤组织和复发性脑胶质瘤组织。所述含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群也可来源于商品化的胶质瘤细胞系。所述扩增在无血清培养基中进行，使所述细胞群中的胶质瘤干细胞所占的比例增加5％至30％。优选地，所述无血清培养基是补充有0.5×N2、0.5×B27、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF、1×的非必须氨基酸、10mM Hepes和1％青链霉素的DMEM-F12培养基，在该培养基中，胶质瘤干细胞因其可自我更新而存活并扩增，而其他细胞因缺少血清或生长必须营养物质不断死亡，经过20-40天的扩增培养后，所获得的细胞群中胶质瘤干细胞所占的比例增加5％至30％。所获得的含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群中胶质瘤干细胞的鉴定通常通过流式细胞术检测干性相关蛋白Nestin、CD133、Sox2等。所述冻融裂解处理包括将扩增之后的细胞群冻存于液氮中，随后在15至37℃下解冻至全部融化；优选地，所述冻存持续10分钟至1小时；所述解冻在20℃至30℃下持续20分钟至1小时，并且，所述冻融裂解处理重复4至6次，以在显微镜下观测到裂解物中无活细胞为宜。

在一种优选的实施方式中，在进行所述扩增之后，用磷酸盐缓冲液洗涤含有脑胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群，细胞计数后，根据一定细胞密度用磷酸盐缓冲液重悬细胞，其中，所述磷酸盐缓冲液为经过0.22μM滤膜过滤，无菌，无内毒素，pH在7.2-7.4之间的市售磷酸盐缓冲液溶液。洗涤体积和次数，优选为5倍于培养体系的磷酸盐缓冲液，以3-4次为宜。优选地，可通过测定洗出液中残留培养基组分来决定洗涤次数，主要检测指标为洗出液中残留细胞因子EGF、FGF和IL-6浓度不高于100pg/ml即可。

在一种优选的实施方式中，在所述冻融裂解处理之后，进一步进行离心和过滤处理，从而除去过大的碎片，所述离心处理在离心转数为400-1000g条件下持续3-10分钟，优选地，在800g条件下离心处理5分钟，离心后采用0.20-0.45μm的滤膜进行过滤，从而得到含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物。

另一方面，本发明提供由上述方法制备得到的抗原组合物，该抗原组合物中包含肿瘤干细胞裂解物和肿瘤细胞裂解物，因此，该抗原组合物能够同时靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞。

再一方面，本发明提供包含由上述方法制备的抗原组合物、树突状细胞和CpG寡核苷酸的疫苗；其中，由本发明的上述方法制备的抗原组合物的含量为500-1000μg/毫升疫苗，树突状细胞的含量为2×10⁶-10⁸个/毫升疫苗，CpG寡核苷酸的含量为1-10％重量/体积，优选地为3-5％重量/体积。所述树突状细胞为外周血中分离的外周血单个核细胞，经过短时贴壁，富集单核细胞后经过白介素4(IL-4)和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导，脂多糖(LPS)激活后得到的树突状细胞。优选地，疫苗所用树突状细胞与制备本发明的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物所使用的组织细胞来自同一个体，由此可避免异体免疫排斥反应的发生，更优选地，所述树突状细胞用生理盐水或磷酸盐缓冲液洗涤3次之后用于疫苗，其中，洗涤次数可以通过测定洗出液中内毒素浓度而定。所述CpG寡核苷酸是B型CpG寡核苷酸或C型CpG寡核苷酸。

又一方面，本发明提供使用本发明的抗原组合物或疫苗治疗胶质瘤的方法，所述方法包括给术后1-2个月的胶质瘤患者施用本发明的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物或者本发明的上述疫苗。所述抗原组合物或所述疫苗可采用皮下注射或皮内注射的方式给药。在一种优选的实施方式中，在靠近颈部***的腋下或背部多点皮内注射或皮下注射所述抗原组合物，所述抗原组合物的给药剂量为每次施用500-1000μg，每周注射一次，每个疗程注射3次，首次注射后3-7天起效，一个疗程结束后可间隔1个月再次给药进行治疗，在抗原组合物的量足够的前提下，3个疗程的治疗完成6个月至1年后可再次给与治疗。在另一优选的实施方式中，在靠近颈部***的腋下或背部皮内注射或皮下注射本发明的疫苗，注射前将本发明的抗原组合物、树突状细胞和CpG寡核苷酸混合配置成疫苗，配置后为保证树突状细胞活力，应在4小时内完成注射，其中，利用患者外周血单核细胞诱导培养获得人树突状细胞，经过激活后，用生理盐水充分洗涤，生理盐水调整细胞密度备用。所述疫苗的每次给药剂量为0.5-3ml，每周注射一次，每个疗程注射3次，首次注射后3-7天起效，一个疗程结束后可间隔1个月再次给药进行治疗，在抗原组合物的量足够的前提下，3个疗程的治疗完成6个月至1年后可再次给与治疗。

本发明的用于制备靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物的方法无需对来自胶质瘤组织的细胞群进行复杂分选，可直接使用从胶质瘤组织中分离的含有胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞的细胞群进行扩增，从而得到的抗原组合物即含有胶质瘤细胞裂解物还含有胶质瘤干细胞裂解物，由此，所述抗原组合物能够同时靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞。

也正是因为本发明的抗原组合物能够同时靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞，因此，包含该抗原组合物的疫苗能够有效杀伤残留的胶质瘤干细胞以及胶质瘤细胞，抑制胶质瘤复发。

进一步而言，本发明的疫苗中含有作为免疫增强剂的CpG寡核苷酸，使抗原组合物的免疫原性进一步提高，增强免疫应答强度，从而使疫苗在抑制胶质瘤生长方面更好地发挥作用。另一方面，本发明的疫苗中所包含的树突状细胞与其中所包含的抗原组合物在将疫苗注射给患者之前进行混合，因此，与仅回输抗原负载的树突状细胞相比，将本发明的抗原组合物和树突状细胞一同给药于体内，所述抗原组合物还可被体内其他抗原提呈细胞提呈，从而大大提高了本发明的疫苗中抗原组合物的体内利用率，极大地提高了本发明的疫苗在抑制胶质瘤生长方面的作用。

附图说明

图1是实施例1制备得到的富含胶质瘤干细胞的胶质瘤细胞群的流式细胞仪检测结果。

图2显示了分别注射了阴性对照PBS、对比疫苗1和、对比疫苗2和本发明的疫苗的小鼠的生存曲线。

图3显示了分别注射了阴性对照PBS、实验组疫苗和对照组疫苗的小鼠的生存曲线。

具体实施方式

实施例l：含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物的制备

(1)获得含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群

脑胶质瘤组织来自患有IV级脑胶质瘤的患者。在手术切除肿瘤组织之后，将脑胶质瘤组织迅速放入含有5μg/ml庆大霉素、0.9μg/ml左旋霉素、50ng/mlEGF和50ng/ml FGF的Neurobasal(NB)培养基中，随后将其放入低温保存箱，快速转移至GMP实验室，用于后续处理。在生物安全柜中，将肿瘤组织转移到新的含有5μg/ml庆大霉素、0.9μg/ml左旋霉素、50ng/ml EGF和50ng/ml FGF的Neurobasal(NB)培养基中，将肿瘤组织切成小块，去除结蹄组织和坏死组织，随后，进一步将肿瘤组织切碎成约1mm³的小块，向所得的碎块组织中加入无菌生理盐水，形成组织细胞悬液，通过无菌100μm组织筛网去除大片组织和细胞碎片，获得含有胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞的细胞悬液，在离心转速为400-500g的条件下进行离心处理，收集细胞，去除上清，细胞沉淀用无菌生理盐水充分洗涤2次，所得离心沉淀用无菌红细胞裂解液(BD公司)5-10ml悬起，冰上裂解3-5分钟。然后用无菌生理盐水充分稀释红细胞裂解液，随后在离心转速为300-400g的条件下离心收集细胞，去除上清，细胞沉淀用无菌生理盐水充分洗涤2次，进行细胞计数，以2-5×10⁵/ml的细胞浓度用干细胞培养完全培养基重悬。该干细胞完全培养基以DMEM-F12培养基为主，补充有0.5×N2、0.5×B27、20ng/ml人EGF、20ng/ml人FGF、1×的非必须氨基酸、10mMHepes和1％青链霉素。

(2)扩增含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群

将10-15ml上述得到的稀释的细胞悬液转移至10cm灭菌悬浮细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂和5％O₂三气培养箱中培养，每2天半换液。培养10天后，每3天半换液，培养过程中，胶质瘤干细胞在补充基本生长因子的条件下可自我更新得以存活并缓慢扩增，形成肿瘤球，而其他细胞因缺少血清或生长必须营养物质不断衰亡。

得到的肿瘤球在开始培养的10天缓慢增大，待肿瘤球直径大于100μm时，换液时用ACCUTASE酶(美国西格玛)处理将其分散。具体方法如下：300-400g下离心5分钟收集肿瘤球细胞悬液，离心沉淀用无菌磷酸盐缓冲液悬起，并充分混匀，300-400g下离心5分钟去上清，去除干细胞完全培养基对ACCUTASE酶的抑制作用。用ACCUTASE酶2-5ml悬起沉淀，在37℃下消化5分钟，然后吹打细胞1-2分钟充分分散细胞，待细胞分散形成单细胞悬液后，加入干细胞完全培养基终止酶的消化作用，然后在300-400g下离心5分钟去上清，移除ACCUTASE酶的作用，离心沉淀用无菌磷酸盐缓冲液悬起，充分洗涤1次后，用完全培养基悬起细胞沉淀，继续培养。

经过30天的扩增培养后，细胞群中胶质瘤干细胞所占的比例增加5％至30％，从而得到富含胶质瘤干细胞同时含有胶质瘤细胞的细胞群。取1个细胞培养皿的细胞，经ACCUTASE酶分散处理，将单个细胞在干细胞完全培养基中继续培养6小时恢复细胞表面蛋白的表达，离心收细胞，细胞沉淀用无菌磷酸盐缓冲液悬起，计数，并充分洗涤一次，离心后，用无菌磷酸盐缓冲液悬起，调整细胞密度，以每个样100μl(5×10⁵个细胞)转移到流式上样管中，并在不同的流式上样管中加入CD133、Nestin和Sox2等荧光标记流式检测抗体，4℃染色20-30分钟(抗体用量和染色孵育时间根据抗体说明书而定)。然后，用3ml磷酸盐缓冲液洗涤2次，最后用0.3ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测。结果如图1所示，CD133阳性细胞比例为53％、Nestin阳性细胞比例81.9％和Sox2阳性细胞比例85.4％，从脑胶质瘤组织中获得的含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群经过扩增培养之后，胶质瘤干细胞的数量显著增加。

(3)富含胶质瘤干细胞且含有胶质瘤细胞的细胞群的裂解

取如上制备的富含胶质瘤干细胞且含有胶质瘤细胞的细胞群，细胞计数后，用磷酸盐缓冲液调整细胞密度为5×10 ⁶细胞/1ml/管加入2ml细胞冻存管中，直接冻存于液氮中，1小时后立刻将冻存管转移无菌室温环境中，溶解时间30分钟，以全部融化，达到室温为宜。反复冻融4次，所得裂解液在800g条件下离心处理5分钟。离心后取上清，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。所述滤液即含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物，经过蛋白浓度检测后-80℃中保存。

实施例2：利用小鼠胶质瘤细胞系GL261制备含有小鼠胶质瘤干细胞裂解物和小鼠胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物

将冻存于本实验室的小鼠胶质瘤癌细胞系GL261细胞(美国明尼苏达大学陈卫教授赠送)复苏，培养至对数生长期，获得细胞悬液，用无菌磷酸盐缓冲液充分洗涤2次，细胞计数，用小鼠胶质瘤干细胞完全培养基重悬细胞，调整细胞密度0.5-1×10⁶/ml，每10-15ml转移到10cm灭菌悬浮细胞培养皿中在37℃、5％CO₂和5％O₂三气培养箱中培养，每2天半换液。培养10天后每3天半换液。按照上述培养方式，得到肿瘤球。换液时，待肿瘤球直径大于100μm时，换液时可吹打使肿瘤球分散成单个细胞，如吹打不开，可使用ACCUTASE酶进行分散处理。

以上所述小鼠胶质瘤干细胞完全培养基以DMEM-F12培养基为主，补充有0.5×N2、0.5×B27、20ng/ml小鼠EGF、20ng/ml小鼠FGF、1×的非必须氨基酸、10mM Hepes和1％青链霉素混合液溶液。

经过30天的富集培养后，可获得富含小鼠胶质瘤干细胞并含有小鼠胶质瘤细胞的细胞群。取1个细胞培养皿的细胞，经吹打(如吹打不开可用ACCUTASE酶)分散处理，将单个细胞在干细胞完全培养基中继续培养6小时恢复细胞表面蛋白的表达，离心收集细胞，细胞沉淀用无菌磷酸盐缓冲液悬起，计数，并充分洗涤一次，离心后，用无菌磷酸盐缓冲液悬起，调整细胞密度，以每个样100μl(5×10⁵个细胞)转移到流式上样管中，并在不同的流式上样管中加入小鼠CD133、Nestin和干性相关蛋白A2B5的抗体，4℃染色20-30分钟(抗体用量和染色孵育时间根据抗体说明书而定)。然后，用3ml磷酸盐缓冲液洗涤2次，最后用0.3ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测CD133、Nestin和A2B5阳性细胞比例。

上述方法重复三次分别制备得到三组富含小鼠胶质瘤干细胞并含有小鼠胶质瘤细胞的细胞群，GL261GSC-1、GL261GSC-2和GL261GSC-3，这三组细胞群的流式细胞仪检测的CD133、Nestin和A2B5阳性细胞比例在下表1中列出。

表1

从上表1中可以看出，小鼠胶质瘤癌细胞系GL261经过扩增培养之后，胶质瘤干细胞的数量显著增加。

接下来，取如上制备的富含脑胶质瘤干细胞且含有胶质瘤细胞的细胞群GL261GSC-1，细胞计数后，用磷酸盐缓冲液调整细胞密度5×10⁶细胞/1ml/管加入2ml细胞冻存管中，直接冻存于液氮中，1小时后立刻将冻存管转移无菌室温环境中，溶解时间30分钟，以全部融化，达到室温为宜。反复冻融4次，所得裂解液在800g条件下离心处理5分钟。离心后取上清，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。所述滤液即含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物，经过蛋白浓度检测后-80℃中保存。

实施例3：本发明的疫苗的体内效能检测

本实施例中示例性地采用包含实施例2制备得到的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物、树突细胞和C型CpG寡核苷酸(CpG2395，购自Invivogen)的疫苗进行体内效能检测；其中，树突状细胞为分离C57BL/6小鼠骨髓细胞经过白介素4(IL-4)和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导，脂多糖(LPS)激活后得到的树突状细胞。本实施例中使用的疫苗每毫升包含1000μg实施例2制备的抗原组合物、4×10⁶个树突状细胞和200μg C型CpG寡核苷酸。每只荷瘤小鼠注射250μl疫苗，分别在两侧肩甲部皮下注射125μl。

健康6周雌性SPF级C57BL/6小鼠50只(购自北京维通利华实验动物有限公司)，购回后一周内密切观察小鼠生长状况，第二周选取生长状态良好的45只小鼠，随机分成4组，每组10只，将表达荧光素基因的GL261-GFP-Luc制成单细胞悬液，在C57BL/6小鼠前囟内以1.5×10⁴/只的剂量注射GL261-GFP-Luc单细胞悬液，建模24小时后将荧光素酶底物以150mg/kg剂量腹腔注射到小鼠腹腔，注射体积为100μl，注射5分钟后在小动物活体成像***中通过活体荧光成像观察记录肿瘤细胞增殖的情况。建模后第3天、10天和17天，分别向各组荷瘤小鼠肩甲处皮下注射阴性对照PBS缓冲液、对比疫苗1、对比疫苗2以及本发明的疫苗(对比疫苗1、对比疫苗2以及本发明的疫苗的具体组成请参见下表2)。荷瘤后第7天、14天、21天、28天和35天通过小动物活体成像仪观察记录肿瘤大小，同时记录小鼠死亡时间，绘制小鼠生存曲线，结果详见表3和图2。

表2疫苗组成

CpG-C：C型CpG寡核苷酸(CpG2395)；

DC：小鼠树突状细胞

抗原组合物：实施例2制备得到的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物

表3

CpG-C：C型CpG寡核苷酸(CpG2395)；

DC：小鼠树突状细胞

抗原组合物：实施例2制备得到的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物

上表3中比较了不同组成的疫苗对荷瘤小鼠颅内肿瘤生长的抑制情况，从表3中可以看出，含有本发明的抗原组合物、树突状细胞和CpG寡核苷酸的疫苗可很好的抑制肿瘤的增殖，延长小鼠生存期，具有很好的胶质瘤治疗效果。同时，图2显示了小鼠生存曲线，与注射阴性对照PBS、对比疫苗1和对比疫苗2相比，注射包含本发明的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物和树突状细胞以及CpG寡核苷酸的疫苗可有效延长荷瘤小鼠存活期。通过上表3和图2的结果可以看出，正是由于本发明的抗原组合物含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物而可以同时靶向胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞，起到标本兼治的作用，同时，本发明的疫苗中抗原组合物与树突状细胞同时皮下注射，可以诱导高效的细胞免疫应答从而更好地抑制肿瘤增殖，延长荷瘤小鼠生存期；进一步，由于本发明的疫苗中使用了CpG寡核苷酸作为免疫增强剂活化淋巴细胞而进一步增强了疫苗的效力。

实施例4：含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物的疫苗在小鼠体内抗肿瘤效力的评价

小鼠荷瘤方法按照实施例3中的方法进行。实验组的疫苗包含含有实施例2制备的胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物、C型CpG寡核苷酸(CpG2395)和树突状细胞，对照组疫苗包含小鼠胶质瘤细胞GL261细胞裂解物、树突状细胞以及C型CpG寡核苷酸。具体各组疫苗的组成列于下表4。每只荷瘤小鼠注射250μl疫苗，分别在两侧肩甲部皮下注射125μl。在小鼠荷瘤后第7天、14天、21天、28天和35天通过小动物活体成像仪观察记录肿瘤大小，同时记录小鼠死亡时间，绘制小鼠生存曲线，结果详见表5和图3。

表4疫苗组成

表5

CpG-C：C型CpG寡核苷酸(CpG2395)；

DC：小鼠树突状细胞

抗原组合物：实施例2制备得到的含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物

根据图3和上表5的结果显示，本发明的包含含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物的疫苗的抗肿瘤能力远远好于仅含有胶质瘤细胞裂解物(GL261Lysate)的疫苗，由此可见，本发明的疫苗由于含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物而同时靶向胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞，从而在抑制小鼠颅内肿瘤细胞增殖方面效果更好，使小鼠生存期更长。

Claims (12)

1.制备靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物的方法，所述方法包括：

(1)提供分离的含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群；

(2)扩增所述细胞群中的胶质瘤干细胞；

(3)对上述扩增之后的细胞群进行冻融裂解处理；从而得到含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述扩增使所述细胞群中的胶质瘤干细胞所占的比例增加5％至30％。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述扩增在无血清培养基中进行。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述无血清培养基是补充有0.5×N2、0.5×B27、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF、1×的非必须氨基酸、10mM Hepes和1％青链霉素的DMEM-F12培养基。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述含有胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的细胞群通过对胶质瘤组织进行切碎、过滤和裂解红细胞得到。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述胶质瘤组织选自：星形细胞瘤组织、胶质母细胞瘤组织、多形性胶质母细胞瘤组织、转移性脑胶质瘤组织和复发性脑胶质瘤组织。

7.由权利要求1至6中任一项所述的方法制备的靶向胶质瘤和胶质瘤干细胞的抗原组合物，该抗原组合物含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物。

8.包含权利要求1至6中任一项所述的方法制备的抗原组合物、树突状细胞和CpG寡核苷酸的疫苗，其中，所述含有胶质瘤干细胞裂解物和胶质瘤细胞裂解物的抗原组合物的含量为500-1000μg/毫升疫苗，树突状细胞的含量为2×10⁶-10⁸个/毫升疫苗，CpG寡核苷酸的含量为1-20％重量/体积。

9.如权利要求8所述的疫苗，其中，所述树突状细胞为通过对外周血单核细胞进行白介素4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导、脂多糖激活后得到的树突状细胞。

10.如权利要求8所述的疫苗，其中，所述CpG寡核苷酸是B型CpG寡核苷酸或C型CpG寡核苷酸。

11.权利要求1至6中任一项所述的方法制备的抗原组合物在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。

12.权利要求8至10中任一项所述的疫苗在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。