CN109897118A - 荧光标记的米糠多糖铁的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种荧光标记的米糠多糖铁的制备方法及应用，涉及示踪技术领域。所述荧光标记的米糠多糖铁的制备方法包括：将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，加入非质子溶剂，形成混合溶液；将混合溶液透析，得保留液；将无水乙醇加入保留液中，得沉淀；将沉淀洗涤，干燥后得荧光标记的米糠多糖铁。本发明利用米糠多糖铁分子中还原性末端与罗丹明B中活泼的氨基可以发生反应这一特性，制备出米糠多糖铁‑罗丹明B复合物，即荧光标记的米糠多糖铁，方法简单、可操作性好。并将制备的荧光标记的米糠多糖铁应用到示踪米糠多糖铁中，为示踪米糠多糖铁提供了快速、便捷的方法，解决了米糠多糖铁难以示踪的问题。

Description

荧光标记的米糠多糖铁的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及示踪技术领域，特别涉及一种荧光标记的米糠多糖铁的制备方法及应用。

背景技术

深入研究米糠多糖铁生物活性对加强我国农业资源深加工和高值化利用，推动米糠多糖铁在食品、药品中的应用和发展具有极其重要的现实意义。但由于大部米糠多糖铁分子结构中不含共发色基团，不能通过简单的紫外吸收光谱或荧光光谱进行示踪和检测，目前，在米糠多糖铁研究中，主要通过高效液相色谱仪(HPLC)与示差折光检测器(RID)、质谱检测器(MSD)或蒸发光散射检测器(ELSD)联用对多糖铁进行分析检测，但这类检测仪器价格昂贵，与液相色谱仪联用时运行成本高且操作复杂，严重限制了米糠多糖铁研究和开发的效率。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种荧光标记的米糠多糖铁的制备方法及应用，旨在解决难以示踪米糠多糖铁的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，所述荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，包括以下步骤：

将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液；

将所述混合溶液进行透析，得保留液；

将无水乙醇加入所述保留液中，静置、离心，得沉淀；

将所述沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤，再经过冷冻干燥后得荧光标记的米糠多糖铁。

优选地，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤中，所述米糠多糖铁和罗丹明B的质量比为(10～1)：1。

优选地，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤中，所述水和非质子溶剂的体积比为10：(1～2.5)。

优选地，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤中，所述非质子溶剂为吡啶或三乙胺。

优选地，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤包括：

精确称取米糠多糖铁和罗丹明B，并将所述米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，于室温下避光搅拌，反应22～24h后形成混合溶液。

优选地，所述将所述混合溶液进行透析，得保留液的步骤包括：

将所述混合溶液置于透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出；

其中，所述透析袋为截留分子量为1000Da的透析袋。

优选地，所述将无水乙醇加入所述保留液中，静置、离心，得沉淀的步骤中，

所述无水乙醇的加入量与所述保留液的体积比为(2.5～4)：1；和/或，

所述静置时，温度为0～4℃；和/或，

所述静置时间为12～24h。

优选地，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤之前，还包括：

向米糠多糖水溶液中加入氢氧化钠溶液至pH为8～9；

在pH为8～9的环境下，在60～70℃水浴中，将三氯化铁溶液加到所述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至所述反应溶液中出现红棕色沉淀；

将所述反应溶液离心，取上清液，向所述上清液中加入无水乙醇，经0～4℃静置12～14h后，离心取沉淀物；

将所述沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁；

其中，所述无水乙醇与所述上清液的体积比为(2.5～4)：1。

此外，本发明还涉及上述制备方法制备的荧光标记的米糠多糖铁在示踪米糠多糖中的应用。

本发明技术方案中，利用米糠多糖铁分子中还原性末端与罗丹明B中活泼的氨基可以发生反应这一特性，制备出米糠多糖铁-罗丹明B复合物，即荧光标记的米糠多糖铁，方法简单、可操作性好。且该荧光标记的米糠多糖铁在545±5nm处有紫外特征吸收峰，在575±5nm处有明显的荧光强度，具有荧光性，因此，本发明提出利用荧光标记的米糠多糖铁的这种特性，应用到示踪米糠多糖铁上，为示踪米糠多糖铁提供了解决方法，且应用荧光标记的米糠多糖铁示踪米糠多糖铁的方法快速、便捷，所要用到的检测设备常见且检测成本低廉，易于推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为本发明提供的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法的另一实施例的流程示意图；

图3为实施例1～4制得的产物及米糠多糖铁及罗丹明B的红外光谱图；

图4为实施例1～4制得的荧光标记的米糠多糖铁及罗丹明B的荧光光谱图；

图5为实施例1～4制得的荧光标记的米糠多糖铁及米糠多糖铁及罗丹明B的紫外吸收光谱图；

图6为实施例5中细胞摄取的荧光标记的米糠多糖铁的荧光光谱图；

图7为实施例5中摄取了荧光标记的米糠多糖铁的细胞的荧光成像图；

图8为实施例6中摄取了荧光标记的米糠多糖铁与DNA的复合物的细胞的荧光成像图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

由于大部米糠多糖铁分子结构中不含共发色基团，不能通过简单的紫外吸收光谱或荧光光谱进行示踪和定量分析，目前，在米糠多糖铁研究中，主要通过高效液相色谱仪(HPLC)与示差折光检测器(RID)、质谱检测器(MSD)或蒸发光散射检测器(ELSD)联用对多糖铁进行分析检测，但这类检测仪器价格昂贵，与液相色谱仪联用时运行成本高且操作复杂，严重限制了米糠多糖铁研究和开发的效率。

鉴于此，本发明提出了一种荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其利用米糠多糖铁分子中还原性末端与罗丹明B中活泼的氨基发生反应这一特性，制备出了一种可以荧光示踪的荧光标记的米糠多糖铁。现结合图1所示的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法的一实施例的流程示意图进行描述，所述荧光标记的米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：

步骤S110、将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液。

在本实施例中，所述米糠多糖铁和罗丹明B的质量比优选为(10～1)：1；所述水和非质子溶剂的体积比优选为10：(1～2.5)；所述非质子溶剂优选为吡啶或三乙胺。非质子溶剂可以提供碱性环境，并作为催化剂促进米糠多糖铁与罗丹明B的结合，其加入量不用过多，以溶剂，即水的量为准，水的量则只需保证米糠多糖铁和罗丹明B充分溶解即可。

在步骤S110实施时，需要注意各项实验条件的控制，以提高米糠多糖铁与罗丹明B的结合率，在本发明的其中一个实施例中，步骤S110包括：精确称取米糠多糖铁和罗丹明B，并将所述米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，于室温下避光搅拌，反应22～24h后形成混合溶液。罗丹明B及部分非质子溶剂对光敏感，易降解，避光搅拌可以提高反应产率，降低副产物含量。

此外，在步骤S110实施时，所使用的米糠多糖铁可以通过将米糠多糖与铁离子络合得到，在本发明的另一实施例中，请参阅图2，即步骤S110之前还包括：

步骤S110a、向米糠多糖水溶液中加入氢氧化钠溶液至pH为8～9；

步骤S110b、在pH为8～9的环境下，在60～70℃水浴中，将三氯化铁溶液加到所述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至所述反应溶液中出现红棕色沉淀；

步骤S110c、将所述反应溶液离心，取上清液，向所述上清液中加入无水乙醇，经0～4℃静置12～14h后，离心取沉淀物；

步骤S110d、将所述沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁。

其中，所述无水乙醇与所述上清液的体积比为(2.5～4)：1。

在碱性环境下，米糠多糖可以与铁盐发生络合反应生成米糠多糖-铁络合物，其中铁盐可以是铁的任意一种可溶性无机盐，在本实施例中，优选为三氯化铁溶液。米糠多糖-铁络合物难溶于有机醇，特别低温下的无水乙醇，利用这一特性，即可使其从溶液中沉淀并分离出来。

步骤S120、将所述混合溶液进行透析，得保留液。

在上述步骤S110中的反应结束后，混合溶液中除反应产物外，还存在一些小分子杂质和游离的罗丹明B，因此要进行除杂，除杂方式可以是层析、膜分离或者透析，相较而言，透析操作简便且价廉，在本实施例中，选用透析法。在具体实施时，步骤S120包括：将所述混合溶液置于透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出。其中，所述透析袋优选为截留分子量为1000Da的透析袋，以截留分子量大于1000Da的米糠多糖铁-罗丹明B复合物，小分子杂质和游离的罗丹明B则进入透析液中排出，故透析时间以透析液中无游离罗丹明B检出时为停止时间，其检测无游离罗丹明B的方法可以是荧光检测法，若透析液未出现荧光吸收峰，即说明透析液中无游离罗丹明B。

步骤S130、将无水乙醇加入所述保留液中，静置、离心，得沉淀。

步骤S140、将所述沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤，再经过冷冻干燥后得荧光标记的米糠多糖铁。

步骤S130中，所述无水乙醇的加入量与所述保留液的体积比为(2.5～4)：1；所述静置时，温度为0～4℃；所述静置时间为12～24h。

米糠多糖铁-罗丹明B复合物，即荧光标记的米糠多糖铁难溶于无水乙醇，且在0～4℃时溶解度更低，使用低温下的醇沉的方法即可使荧光标记的米糠多糖铁快速、充分地沉淀、分离、洗涤。

进一步地，本发明还涉及上述制备方法制备的荧光标记的米糠多糖铁在示踪米糠多糖中的应用。

研究表明，荧光标记的米糠多糖铁在545±5nm处有紫外特征吸收峰，在575±5nm处有明显的荧光吸收峰，具有荧光性。因此，通过紫外分光光度法和荧光检测，可以鉴别荧光标记的米糠多糖铁，从而确定其在细胞内的分布情况，示踪荧光标记的米糠多糖铁，进而达到示踪米糠多糖铁的目的。

在实际应用时，可以先将米糠多糖铁转化为荧光标记的米糠多糖铁，具体地，可通过上述制备方法，以米糠多糖铁为原料制备荧光标记的米糠多糖铁，然后将已经摄取了荧光标记的米糠多糖铁或者荧光标记的米糠多糖铁与DNA的复合物的细胞制成待测液，通过荧光检测法可以显示出荧光标记的米糠多糖铁或者荧光标记的米糠多糖铁与DNA的复合物在细胞内的分布情况。在具体实施时，可以按照下列步骤进行：

步骤S210、用完全培养基将荧光标记的米糠多糖铁溶解成样品溶液。

步骤S220、待细胞生长达到70-80％汇合度时，用胰酶消化处理后，均匀的铺于24孔板中，使得每孔细胞数约为5×10⁴个，然后置于37℃、5％CO₂的条件下培养24h。

步骤S230、将上述24孔板中的完全培养基用上述样品溶液替换，置于相同条件下继续培养一段时间后。选取两个孔，将其中的溶液吸出，用磷酸缓冲盐溶液润洗，再用胰酶消化处理，然后用完全培养基分散细胞，得待测液。

步骤S240、取上述待测液于酶标板中，以未加样品溶液的孔为空白对照，设定激发波长540nm，测定发射波长575nm处的荧光值。

也可以选取细胞摄取量最大的时间点，按照上述同样的方法制备细胞爬片，置于荧光显微镜下观察，在绿色激发光下，荧光标记的米糠多糖铁显红色。

当然，除了示踪被细胞摄取的米糠多糖铁外，也可以将荧光标记的米糠多糖铁应用于示踪米糠多糖铁在细胞外的其他溶液(例如混合溶液或者反应体系溶液)中的分布情况，即，将米糠多糖铁转化为荧光标记的米糠多糖铁后，通过荧光检测法或者紫外分光光度法对溶液进行检测。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

向米糠多糖水溶液中滴加10％氢氧化钠溶液至pH为8，并在pH为8～9的环境下，于70℃水浴条件下，将10％三氯化铁溶液滴加到上述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至反应溶液中出现红棕色沉淀。将反应溶液离心，向上清液中加入3倍上清液体积的无水乙醇，0℃下静置14h后，离心取沉淀物，将沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁，备用。

取上述米糠多糖铁20mg、罗丹明B20mg溶于10ml水中，然后加入2ml吡啶，于室温下避光搅拌反应，反应24h后形成混合溶液；将混合溶液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出后，停止透析，并取保留液；将3倍保留液体积的无水乙醇加入保留液中，于4℃下避光静置12h，离心，得暗红色沉淀；将暗红色沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤后，冷冻干燥得荧光标记的米糠多糖铁。

实施例2

向米糠多糖水溶液中滴加10％氢氧化钠溶液至pH为9，并在pH为8～9的环境下，于60℃水浴条件下，将10％三氯化铁溶液滴加到上述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至反应溶液中出现红棕色沉淀。将反应溶液离心，向上清液中加入4倍上清液体积的无水乙醇，4℃下静置12h后，离心取沉淀物，将沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁，备用。

取上述米糠多糖铁200mg、罗丹明B20mg溶于10ml水中，然后加入2.5ml吡啶，于室温下避光搅拌反应，反应22h后形成混合溶液；将混合溶液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出后，停止透析，并取保留液；将2.5倍保留液体积的无水乙醇加入保留液中，于0℃下避光静置24h，离心，得暗红色沉淀；将暗红色沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤后，冷冻干燥得荧光标记的米糠多糖铁。

实施例3

向米糠多糖水溶液中滴加10％氢氧化钠溶液至pH为8.6，并在pH为8～9的环境下，于65℃水浴条件下，将10％三氯化铁溶液滴加到上述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至反应溶液中出现红棕色沉淀。将反应溶液离心，向上清液中加入2.5倍上清液体积的无水乙醇，2℃下静置13h后，离心取沉淀物，将沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁，备用。

取上述米糠多糖铁100mg、罗丹明B20mg溶于10ml水中，然后加入1ml吡啶，于室温下避光搅拌反应，反应23h后形成混合溶液；将混合溶液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出后，停止透析，并取保留液；将4倍保留液体积的无水乙醇加入保留液中，于2℃下避光静置16h，离心，得暗红色沉淀；将暗红色沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤后，冷冻干燥得荧光标记的米糠多糖铁。

实施例4

向米糠多糖水溶液中滴加10％氢氧化钠溶液至pH为8，并在pH为8～9的环境下，于70℃水浴条件下，将10％三氯化铁溶液滴加到上述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至反应溶液中出现红棕色沉淀。将反应溶液离心，向上清液中加入3倍上清液体积的无水乙醇，4℃下静置12h后，离心取沉淀物，将沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁，备用。

取上述米糠多糖铁50mg、罗丹明B20mg溶于10ml水中，然后加入2ml三乙胺，于室温下避光搅拌反应，反应24h后形成混合溶液；将混合溶液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出后，停止透析，并取保留液；将3倍保留液体积的无水乙醇加入保留液中，于4℃下避光静置13h，离心，得暗红色沉淀；将暗红色沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤后，冷冻干燥得荧光标记的米糠多糖铁。

对实施例1～4制得的产物进行验证。

(一)表征

对米糠多糖铁、罗丹明B及实施例1～4制得的产物分别进行红外检测，记录红外图谱如图3所示。

从图3中可以看出，罗丹明B的红外特征吸收峰为1508cm^-1、1409cm^-1、1008cm^-1，米糠多糖铁在这些波长都没有出现红外特征吸收峰，而实施例1～4制得的产物在1504cm^-1、1410cm^-1、1008cm^-1处均出现红外特征吸收峰，说明了罗丹明B与米糠多糖铁已经成功结合，即本发明提出的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法合成成功。

(二)荧光光谱

对罗丹明B及实施例1～4制得的荧光标记的米糠多糖铁分别进行荧光检测，取一定浓度的罗丹明B和实施例1-4制得的荧光标记的米糠多糖铁溶液，用荧光分光光度计设定激发波长540nm，测定560-640nm处的荧光值，记录荧光光谱如图4所示。

从图4中可以看出，罗丹明B与实施例1～4制得的荧光标记的米糠多糖铁均在575nm附近处出现最大荧光强度，说明罗丹明B结合到米糠多糖铁上后仍然具有荧光性，即，荧光标记的米糠多糖铁可以通过荧光检测法进行分析。

(三)紫外检测

对米糠多糖铁、罗丹明B及实施例1～4制得的荧光标记的米糠多糖铁分别进行紫外检测。取一定浓度的米糠多糖铁、罗丹明B及实施例1-4制得的荧光标记的米糠多糖铁溶液，用紫外分光光度计测定500-600nm处的吸光度值。记录紫外吸收光谱如图5所示。

从图5中可以看出，罗丹明B在550nm处出现明显的特征吸收峰，实施例1～4制得的荧光标记的米糠多糖铁在550nm处同样出现微弱的特征吸收峰，而米糠多糖铁没有出现特征吸收峰，说明荧光标记的米糠多糖铁中罗丹明B与米糠多糖铁已经成功结合，且荧光标记的米糠多糖铁可以通过紫外分光光度法进行分析。

(四)细胞毒性检测

采用噻唑蓝(MTT)法测定同一浓度下实施例1～4中制备的荧光标记米糠多糖铁对Hela细胞存活率的影响。Hela细胞在96孔板中的铺板密度为1x10⁴/孔，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h，待细胞生长达到70-80％汇合度时，分别向各孔中加入浓度为0.5mg/mL的样品溶液100μL，相同条件下刺激细胞24h后，加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，相同条件下继续放置4h后，吸去细胞培养液，各孔中加入100μL二甲基亚砜溶解细胞生成的晶体，用酶标仪测定570nm处的吸光度值A1。以未加样品孔的细胞存活率为100％，吸光度值为A0。细胞存活率按公式1计算，结果如表1所示。

公式1：细胞存活率(％)＝A1/A0×100

表1实施例1-4中制得的荧光标记米糠多糖铁的细胞毒性

	Hela细胞存活率(％)
		实施例1	95.6
实施例2	97.7
		实施例3	96.2
实施例4	96.8

由表1可以看出，各实施例制备的荧光标记米糠多糖铁浓度为0.5mg/mL时，Hela细胞的细胞存活率均为95％以上，说明通过此方法制备的荧光标记米糠多糖铁的细胞毒性很低，非常利于米糠多糖铁进行细胞实验时对米糠多糖铁在细胞内部的示踪和观察。

实施例5

用完全培养基将实施例1-4中制备的荧光标记米糠多糖铁溶解成浓度为0.1mg/mL的样品溶液。待细胞生长达到70-80％汇合度时，用胰酶消化处理，并均匀地铺于24孔板中，使得每孔细胞数约为5×10⁴个，然后置于37℃、5％CO₂的条件下培养24h。

将上述24孔板中的完全培养基用样品溶液替换，置于相同条件下继续培养。分别在1、2、3、4、6、8、10、12h时，选取两个孔，并将培养液吸出，用磷酸缓冲盐溶液润洗3-5次，再用胰酶将细胞消化处理，然后用500μL完全培养基分散细胞，制得待测液。

取100μL待测液于酶标板中，以未加样品溶液测量的孔为空白对照，设定激发波长540nm，测定发射波长575nm处的荧光值。记录测定的荧光强度值如图6所示。同时，选取细胞摄取量最大的时间点，按照同样的方法制备细胞爬片，置于荧光显微镜(×100)下观察，在绿色激发光下，Hela细胞对荧光标记米糠多糖铁摄取的结果如图7所示。

由图6可以看出，实施例1-4制得的荧光标记米糠多糖铁均可以被Hela细胞摄取，且随着时间的增加呈现出摄取量逐渐增多的趋势，最终在8h时达到细胞摄取的最大值并保持稳定。

在荧光显微镜下的图片(图7)显示出同样的结果(图中白色亮点即为显示出荧光的荧光标记米糠多糖铁)，且通过图7可以看出荧光标记米糠多糖铁被Hela细胞摄取后主要位于细胞质中，说明米糠多糖铁进入细胞中主要集中在细胞质，细胞核中的存在量较少。

实施例6

用完全培养基将实施例1-4中制备的荧光标记米糠多糖铁溶解成浓度为0.5mg/mL的荧光标记米糠多糖铁溶液。待细胞生长达到70-80％汇合度时，用胰酶消化处理，均匀的铺于放有细胞爬片的24孔板中，使得每孔细胞数约为5×10⁴个，置于37℃、5％CO₂的条件下培养24h。取10μL上述荧光标记米糠多糖铁溶液于EP管中，加入1μg DNA溶液，混合均匀，室温放置30min得到复合物溶液。

取出24孔板，用复合物溶液替换完全培养基，置于相同条件下培养4h，然后向各孔中加入10μL浓度为100ng/mL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液，于相同条件下继续培养30min，吸出复合物溶液，用磷酸缓冲盐溶液清洗细胞表面2-3次，置于荧光显微镜(×100)下观察，在紫外激发光下，Hela细胞对荧光标记米糠多糖铁与DNA的复合物摄取的结果如图8所示。

从图8可以看出，在紫外激发光下，Hela细胞的细胞核被核染料DAPI染色后呈现蓝色，荧光标记米糠多糖***聚DNA后形成红色复合物(图中白色圆圈勾勒的部分)，且主要分布在细胞核周围。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液；

将所述混合溶液进行透析，得保留液；

将无水乙醇加入所述保留液中，静置、离心，得沉淀；

将所述沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤，再经过冷冻干燥后得荧光标记的米糠多糖铁。

2.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤中，所述米糠多糖铁和罗丹明B的质量比为(10～1)：1。

3.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤中，所述水和非质子溶剂的体积比为10：(1～2.5)。

4.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤中，所述非质子溶剂为吡啶或三乙胺。

5.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤包括：

精确称取米糠多糖铁和罗丹明B，并将所述米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，于室温下避光搅拌，反应22～24h后形成混合溶液。

6.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将所述混合溶液进行透析，得保留液的步骤包括：

将所述混合溶液置于透析袋中，在避光环境下，流水透析至透析液中无游离罗丹明B检出；

其中，所述透析袋为截留分子量为1000Da的透析袋。

7.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将无水乙醇加入所述保留液中，静置、离心，得沉淀的步骤中，

所述无水乙醇的加入量与所述保留液的体积比为(2.5～4)：1；和/或，

所述静置时，温度为0～4℃；和/或，

所述静置时间为12～24h。

8.如权利要求1所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将米糠多糖铁和罗丹明B溶于水中，再加入非质子溶剂，反应形成混合溶液的步骤之前，还包括：

向米糠多糖水溶液中加入氢氧化钠溶液至pH为8～9；

在pH为8～9的环境下，在60～70℃水浴中，将三氯化铁溶液加到所述米糠多糖水溶液中反应形成反应溶液，直至所述反应溶液中出现红棕色沉淀；

将所述反应溶液离心，取上清液，向所述上清液中加入无水乙醇，经0～4℃静置12～14h后，离心取沉淀物；

将所述沉淀物醇洗、干燥，得米糠多糖铁；

其中，所述无水乙醇与所述上清液的体积比为(2.5～4)：1。

9.如权利要求1～8任一项所述的荧光标记的米糠多糖铁的制备方法制备的荧光标记的米糠多糖铁在示踪米糠多糖铁中的应用。