CN109890416A - 工程化半胱氨酸帽的分布 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于从抗体中除去半胱氨酸帽并用半胱氨酸分子对所述抗体重新加帽的方法。所述方法特别地包括培养包含具有至少一个加帽工程化半胱氨酸残基的蛋白质分子的宿主细胞,以及使所述细胞培养物与胱氨酸接触。可以在所述细胞培养物中操作溶解氧水平以进一步增强所述除去和所述再加帽过程。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月7日提交的美国临时申请序列号62/418,572的权益,所述临时申请出于所有目的整体并入本文
发明背景
其中选定的氨基酸已突变为半胱氨酸的单克隆抗体(mAb)(即工程化半胱氨酸mAb或ecmAb)特别适用于缀合物(例如,抗体药物缀合物或ADC),因为包含ecmAb的缀合物具有有利的特性,包括药物与抗体比(DAR)的均一性;有利的药代动力学、稳定性和溶解性。半胱氨酸突变位于抗体中通常不形成链间或链内二硫键的氨基酸序列的位置,并且产生突变体mAb的细胞内的表达机制将半胱氨酸残基视为未配对的半胱氨酸。因此,工程化半胱氨酸通常以混合二硫化物的形式与非编码的半胱氨酸分子一起表达(即,工程化半胱氨酸被加帽剂(例如,半胱氨酸(cys-帽)、同型半胱氨酸(hcy-帽)、半胱氨酰甘氨酸(cysgly-帽)或谷胱甘肽(gsh-帽))“加帽”,形成工程化半胱氨酸帽(EC-帽))。
在任何批次的工程化半胱氨酸抗体中,工程化半胱氨酸的高反应性硫醇通常受一系列EC-帽物种的保护。虽然ecmAb不影响最终的mAb或ADC,但ecmAb上的EC-帽的不均匀性可能在成像毛细管等电聚焦(icIEF)曲线中表现为不同的峰,而具有相同EC-帽物种的ecmAb的icIEF曲线是一致的。icIEF曲线不一致可能导致无法通过良好生产规范(GMP)批次,因为icIEF是用于mAb和ADC生产期间中间抗体材料的常用抗体释放测定。通过延长细胞培养的持续时间,可以将不均匀EC-帽分布转化为单一EC-帽物种(cys-帽),但这具有限制性且费用昂贵,并且可能影响产物质量。本发明解决了这个问题和其他问题。
发明内容
本发明特别地提供了一种用于从蛋白质分子中除去半胱氨酸帽的方法,所述方法是通过培养包含具有至少一个加帽半胱氨酸残基的蛋白质分子的宿主细胞,并使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触,由此从所述蛋白质分子中除去所述半胱氨酸帽。在一个实施方案中,使宿主细胞培养物进一步与溶解氧(DO)接触。在另一个实施方案中,在使宿主细胞培养物与胱氨酸接触的同时或之后,使宿主细胞培养物与第一操作的DO在0%-50%DO的设定点下接触,并在使宿主细胞培养物与第一操作的DO接触之后,使宿主细胞培养物与第二操作的DO在20%-100%DO的设定点下接触。在一个实施方案中,使宿主细胞培养物与第一操作的DO接触0.5-8小时。在一个实施方案中,使宿主细胞培养物与第二操作的DO接触0.5-8小时。在一个实施方案中,第一操作的DO处于0%DO的设定点。在一个实施方案中,第二操作的DO处于100%DO的设定点。
在一个实施方案中,上述蛋白质是抗体。在另一个实施方案中,在足以形成抗体-药物缀合物的条件下使抗体与药物-接头化合物组合。在另一个实施方案中,抗体具有至少两个工程化半胱氨酸残基。在一个实施方案中,工程化半胱氨酸残基存在于抗体分子的重恒定区中。在另一个实施方案中,工程化半胱氨酸残基存在于抗体分子的重链或轻链可变区中。在一个实施方案中,半胱氨酸帽是工程化半胱氨酸帽(EC-帽)。
在一个实施方案中,在宿主细胞培养的第10天使宿主细胞培养物与胱氨酸接触。在另一个实施方案中,在整个宿主细胞培养持续时间内每天使宿主细胞培养物与胱氨酸接触。在另一个实施方案中,在宿主细胞培养持续时间的最后一天使宿主细胞培养物与胱氨酸接触。在一个实施方案中,以0.1mM与5M之间的浓度添加胱氨酸。在另一个实施方案中,以4mM的浓度添加胱氨酸。
附图说明
图1示出了具有一系列工程化半胱氨酸帽物种,包括半胱氨酸(-cys,或cys-帽)、同型半胱氨酸(-hcy,或hcy-帽)、半胱氨酰甘氨酸(-cysgly,或cysgly-帽)和谷胱甘肽(-gsh,或gsh-帽)的抗体。
图2示出了根据一个实施方案,在胱氨酸添加和溶解氧操作之后两个分子的EC-帽分布。第10天表示细胞培养的第10天,+CysCys代表胱氨酸添加,且0%或100%DO表示溶解氧设定点。
图3示出了根据一个实施方案,在不同条件下细胞培养物中ecmAb的icIEF曲线。
图4示出了根据一个实施方案,对照(虚线)以及从第6天开始每天添加胱氨酸条件下(实线)的EC-帽随时间的分布。
具体实施方式
I.总则
本发明特别地提供一种用于从细胞培养中的蛋白质中除去不同物种(例如,半胱氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和/或谷胱甘肽)的工程化半胱氨酸帽(EC-帽),由此然后用一致的所需帽物种(例如,半胱氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和谷胱甘肽中的一者)对蛋白质的工程化半胱氨酸重新加帽的方法。在一个实施方案中,所述方法包括在足以使工程化半胱氨酸残基脱帽并用cys-帽对残基重新加帽的条件下使包含ecmAb的细胞培养物与胱氨酸溶液接触。相比在收获抗体后添加胱氨酸溶液,将胱氨酸溶液添加到细胞培养物中更可取,因为这解决了中间mAb材料中EC-帽的潜在不均匀性问题并确保EC-帽分布在细胞培养过程水平上得到控制。在一些实施方案中,在细胞培养物中操作溶解氧(DO)水平以进一步增强脱帽/重新加帽过程。本发明的方法特别地提供了icIEF的一致性,以及其他基于电荷的测定、曲线,并实现了对当前制备mAb和ADC的制造实践的简化。
II.定义
如本文所用,术语“抗体”广泛地指代完整单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体),以及表现出所需生物活性(即特异性结合靶抗原)且具有至少一个天然链间二硫键的抗体片段。示例性片段包括例如Fab、微型抗体等等。完整抗体通常由四条多肽链(两条重链和两条轻链)组成,每条多肽主要具有两个区:可变区和恒定区。可变区特异性结合靶抗原并与靶抗原相互作用。可变区包括识别并结合特定抗原上的特异性结合位点的互补决定区(CDR)。恒定区可被免疫***识别并与免疫***相互作用(参见例如,Janeway等人,2001,Immuno.Biology,第5版,Garland Publishing,NewYork)。四条多肽链通过链间二硫键彼此共价连接。抗体可以是任何类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。抗体可以来源于任何合适的物种。在一些实施方案中,抗体是人或鼠来源的抗体。单克隆抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。根据上下文,术语“抗体”可以指单一抗体分子或抗体分子的集合,诸如呈抗体溶液。
如本文所用,术语“链间二硫键”是指抗体中相邻多肽链上的两个半胱氨酸残基之间的共价键。二硫键具有式R1-S-S-R2,其中硫原子存在于半胱氨酸侧链中并且R1和R2表示半胱氨酸残基的剩余部分和它们所在的多肽链。链间二硫键通常存在于抗体中的重链与轻链之间,或者存在于两条重链之间。
如本文所用,术语“工程化半胱氨酸残基”是指引入蛋白质(例如,抗体)的肽序列中的半胱氨酸残基。具有工程化半胱氨酸残基的单克隆抗体可称为“ecmAb”。工程化半胱氨酸残基通常不存在于蛋白质的天然(即天然存在的)肽序列中。工程化半胱氨酸残基可以取代天然存在于肽序列中给定位置的氨基酸,并且可以通过重组技术诸如定点诱变引入肽序列中。工程化半胱氨酸残基可以是加帽的或未加帽的。
如本文所用,术语“未加帽的半胱氨酸残基”是指其中α-侧链含有具有式R1-SH的游离硫醇部分的半胱氨酸残基。R1表示半胱氨酸残基的非硫醇部分。未加帽的半胱氨酸残基可以是未加帽的工程化半胱氨酸残基。
如本文所用,术语“加帽的半胱氨酸残基”是指其中α-侧链含有具有式R1-S-S-R3的二硫键部分的半胱氨酸残基。R1表示半胱氨酸残基的非硫醇部分,并且R3表示分子量小于或等于约500Da的加帽部分的非硫醇部分。帽可以是例如半胱氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸或谷胱甘肽(R3分别表示游离半胱氨酸的非硫醇部分、半胱氨酰甘氨酸的非硫醇部分或谷胱甘肽的非硫醇部分),或任何其他可用的单硫醇。加帽的半胱氨酸残基可以是加帽的工程化半胱氨酸残基。
如本文所用,从蛋白质中“除去”诸如EC-帽(或帽副产物)的物质是指从蛋白质中除去物质的任何部分,包括完整物质。
如本文所用,在蛋白质上“重新加上”诸如EC-帽(或帽副产物)的物质是指在蛋白质上重新形成物质的任何部分,包括完整物质。
如本文所用,术语“抗体-药物缀合物”和“ADC”是指任选地通过接头与治疗剂(即药物)缀合的抗体。
如本文所用,术语“药物-接头化合物”或“药物-接头”是指具有药物部分和与其连接的接头的分子,其中接头含有适于连接抗体中的氨基酸残基(诸如半胱氨酸残基)的反应性部分。
III.实施方案描述
本发明特别地提供一种用于从ecmAb中除去工程化半胱氨酸帽(EC-帽)并在ecmAb上重新形成所需帽物种的方法。在一个实施方案中,所述方法包括在足以使工程化半胱氨酸残基脱帽并以半胱氨酸对残基重新加帽的条件下使包含ecmAb的细胞培养物与胱氨酸溶液接触。
细胞培养条件
在一些实施方案中,从宿主细胞培养物中产生并收获ecmAb。图1示出了抗体的工程化半胱氨酸残基上的EC-帽的各种实例。在任何细胞培养物中,具有工程化半胱氨酸残基的抗体可以用图1中所示的任何或所有EC-帽物种加帽。本发明的方法可用于实现细胞培养物中ecmAb的EC-帽的一致性,例如除去EC-帽并用cys-帽对工程化半胱氨酸残基重新加帽。在一些这样的方面,工程化半胱氨酸残基将位于抗体重链的第239位(编号依照Kabat等人,"Sequences of proteins of immunological interest,第5版,公布号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NIH,Bethesda,M.D.,1991描述的EU索引)。细胞培养物可包含任何哺乳动物细胞系,包括CHO细胞。用于细胞培养的培养基可以是任何培养基,包括RPMI。在一些实施方案中,培养基已经含有低浓度的胱氨酸。然而,培养基中少量的胱氨酸通常不足以从ecmAb中除去EC-帽并对EC-帽重新加帽。
细胞培养物可包含任何合适量的ecmAb。通常,细胞培养物中蛋白质(无论是抗体还是非抗体蛋白质)的浓度范围为约0.01mg/mL至约150mg/mL或更高,更通常为约1mg/ml至约50mg/ml。细胞培养物可含有例如约0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.5、15、17.5、20、22.5、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或约150mg蛋白质(无论是抗体还是非抗体蛋白质)/mL细胞培养物。本领域技术人员将能够把基于质量的浓度(例如,mg/mL)转化为摩尔浓度(即,摩尔/L)。
为了从ecmAb中除去EC-帽并用半胱氨酸重新加帽,将胱氨酸溶液添加到细胞培养物中。胱氨酸溶液可以是任何种类的溶液,诸如酸性或碱性溶液,或者胱氨酸可以存在于细胞培养基(例如,补料培养基或基础培养基)中。可以通过任何方法将胱氨酸溶液添加到细胞培养物中,所述方法包括直接注射。在其他实施方案中,向细胞培养物中添加不同的溶液,诸如同型半胱氨酸二硫化物,或任何对称的二硫化物。在一些实施方案中,添加所需EC-帽的单体和二聚体以促进EC-帽交换,例如将半胱氨酸和胱氨酸添加到细胞培养物中。在一个实施方案中,用于对工程化半胱氨酸残基重新加帽的EC-帽物种取决于添加到细胞培养物中的对称二硫化物。例如,如果添加了胱氨酸,ecmAb将以半胱氨酸重新加帽;如果添加了同型半胱氨酸二硫化物,ecmAb将以同型半胱氨酸重新加帽。
任何合适量的胱氨酸溶液(或其他对称的二硫化物)均可用于本发明的方法中。通常,添加到细胞培养物中的对称二硫化物的浓度足够高以使抗体的工程化半胱氨酸残基脱帽并进行重新加帽。在一些实施方案中,以0.1mM与5M之间的浓度添加胱氨酸。在另外的实施方案中,以0.1mM与1M之间、0.1mM与100mM之间、1mM与100mM之间、1mM与10mM之间或1mM与5mM之间的浓度添加胱氨酸。在另外的实施方案中,以0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900mM,或1、2、3、4或5M的浓度添加胱氨酸。在一些实施方案中,可以增加或减少浓度。在一些实施方案中,胱氨酸的浓度将维持在大于总抗体浓度的浓度下。在某些方面,细胞培养物中的胱氨酸浓度将是细胞培养物中总抗体浓度的约5倍至约10,000倍、5倍至约5,000倍、5倍至约1,000倍、5倍至约500倍、5倍至约100倍、5比高约20倍、5倍至约15倍、或5倍至约10倍内的任何值。例如,在一些实施方案中,细胞培养物中胱氨酸与总抗体的浓度比将为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、50:1、100:1或更多。
在一些实施方案中,在细胞培养期间每天添加胱氨酸(或其他对称的二硫化物)。在其他实施方案中,仅在某些天,例如在细胞培养的第10天添加胱氨酸。在一些实施方案中,在细胞培养的以下日子中的任一者或全部中添加胱氨酸:第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或超出第15天的任何一天,诸如第20天、第25天、第30天、第35天、第60天、第90天或超出第90天的任何一天。在一个实施方案中,在细胞培养持续时间的最后一天添加胱氨酸。在整个细胞培养期间内,可以一次、两次、三次或四次或更多次添加胱氨酸。在一个实施方案中,在从细胞培养物中收获抗体的当天,将胱氨酸添加到细胞培养物中。
任何合适量的溶解氧均可用于本发明的方法中。在一些实施方案中,在添加胱氨酸后在细胞培养物中操作DO设定点。在其他实施方案中,在添加胱氨酸之前或在添加胱氨酸的同时操作DO设定点。在一个实施方案中,在添加胱氨酸之前、期间或之后,将DO降低至0%与99%之间的任何值(其中100%DO是100%空气饱和度,或~21%的氧气),以便产生低氧环境。例如,可将DO降低至0%-90%、0%-50%、0%-30%、0%-20%、0%-10%、10%-50%、10%-40%、10%-30%、10%-20%之间的设定点,或降低至0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的设定点。可以在添加胱氨酸后的任何持续时间内降低DO,包括0.5-10小时、0.5-4小时、0.5-2小时、0.5-8小时、0.5-10小时、1-10小时、1-4小时、1-2小时、5分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时或更长时间。在降低DO之后,可在任何持续时间内将DO增加至1%与500%之间的任何值。例如,可将DO增加至10%-500%、20%-500%、30%-500%、40%-500%、50%-500%、60%-500%、70%-500%、80%-500%、90%-500%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%之间的设定点,或增加至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的设定点。可以在任何持续时间内增加DO,包括0.5-10小时、0.5-4小时、0.5-2小时、1-10小时、1-4小时、1-2小时、5分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时或更长时间。可以通过任何方法添加DO,包括用空气和氧气和/或覆盖物喷射。
抗体缀合物
抗体上未加帽的工程化半胱氨酸残基可用作安装各种官能团的有用柄部,所述官能团包括成像剂(诸如发色团和荧光团)、诊断剂(诸如MRI造影试剂和放射性同位素)、稳定剂(诸如聚乙二醇聚合物)和治疗剂。在缀合过程期间,将除去ecmAb的不同EC-帽,产生未加帽的半胱氨酸残基。具有未加帽的半胱氨酸残基的抗体可以与功能剂缀合以形成抗体-功能剂-缀合物。功能剂(例如,药物、检测剂、稳定剂)与抗体在工程化半胱氨酸残基的位点处缀合(共价连接)。功能剂可以通过接头间接连接或通过功能剂上的硫醇反应性基团直接连接。
具有未加帽的半胱氨酸残基的抗体可以与药物缀合以形成抗体药物缀合物(ADC)。通常,ADC在药物与抗体之间含有接头。接头可以是可切割接头或不可切割接头。可切割接头通常易于在细胞内条件下被切割,由此接头切割使得药物在靶位点处从抗体释放。合适的可切割接头包括例如酶可切割接头,包括可被细胞内蛋白酶(诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割的含肽基的接头;或糖接头,例如可被葡糖醛酸酶切割的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可包括例如二肽,诸如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)或缬氨酸-丙氨酸(val-ala)。其他合适的可切割接头包括例如pH敏感性接头(例如,在pH小于5.5时可水解的接头,诸如腙接头)以及在还原条件下可切割的接头(例如,二硫接头)。不可切割的接头通常通过抗体的蛋白水解降解来释放药物。
在连接抗体之前,接头将具有与未加帽的工程化半胱氨酸残基反应的基团,并且将通过该反应基团进行连接。硫醇特异性反应性基团是优选的,且包括例如马来酰亚胺;卤代乙酰胺(例如,碘、溴或氯);卤代酯(例如,碘、溴或氯);卤代甲基酮(例如,碘、溴或氯);苄基卤化物(例如,碘化物、溴化物或氯化物);乙烯基砜;(吡啶基)二硫化物;二硫化物二氧化物衍生物;乙酸盐、氯化物或硝酸盐的抗衡离子的汞衍生物,诸如3,6-双-(汞甲基)二噁烷;以及聚亚甲基双甲烷硫代磺酸盐。接头可包括例如通过硫代-琥珀酰亚胺键连接至抗体的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性药物、细胞抑制药物或免疫抑制药物。在接头连接抗体和药物的实施方案中,药物具有可与接头形成键的官能团。例如,药物可以具有可与接头形成键的胺、羧酸、硫醇、羟基或酮。在药物直接连接至接头的方面,药物在连接至抗体之前将具有与未加帽的工程化半胱氨酸反应的基团。
可用的药物类别包括例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等等。可用的细胞毒性剂类别的具体实例包括例如DNA小沟结合剂、DNA烷化剂和微管蛋白抑制剂。示例性细胞毒性剂包括例如奥里斯他汀(auristatin)、喜树碱、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、美登素和美登木素(例如,DM1和DM4)、紫杉烷、苯并二氮杂卓或含苯并二氮杂卓的药物(例如,吡咯并[1,4]-苯并二氮杂卓(PBD)、吲哚并苯并二氮杂卓和噁唑烷基苯并二氮杂卓)和长春花生物碱。选定含苯并二氮杂卓的药物描述于WO2010/091150、WO 2012/112708、WO 2007/085930和WO 2011/023883中。
在一些典型的实施方案中,合适的细胞毒性剂包括例如DNA小沟结合剂(例如,烯二炔和来红菌素(lexitropsin)(一种CBI化合物);还可参见美国专利号6,130,237)、倍癌霉素(参见美国公布号20060024317)、紫杉烷(例如,紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、棘霉素、康普瑞汀(combretastatin)、纺锤菌素、埃博霉素A和B、雌莫司汀(estramustine)、隐球菌素(cryptophysin)、西马多丁(cemadotin)、美登木素、圆皮海绵内酯(discodermolide)、艾植塞洛素(eleutherobin)和米托蒽醌。
药物可以是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括但不限于紫杉烷(例如,(紫杉醇)、(多西他赛))、T67(Tularik)和长春花生物碱(例如,长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)。其他抗微管蛋白剂包括例如浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如,埃博霉素A和B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙素和秋水仙胺(colcimid)、雌莫司汀、隐球菌素、西马多丁、美登木素、康普瑞汀、圆皮海绵内酯、奥里斯他汀和艾植塞洛素。
药物可以是美登素或美登木素,即另一组别的抗微管蛋白剂。(ImmunoGen,Inc.;还可参见Chari等人,1992,Cancer Res.52:127-131和美国专利号8,163,888)。
药物可以是奥里斯他汀。奥里斯他汀包括但不限于AE、AFP、AEB、AEVB、MMAF和MMAE。奥里斯他汀的合成和结构描述于美国专利申请公布号2003-0083263和2009-0111756;国际专利公布号WO 04/010957;国际专利公布号WO 02/088172;美国专利号6,884,869;美国专利号7,659,241;美国专利号7,498,298;美国专利号8,343,928;和美国专利号8,609,105中;所述专利各自以引用方式整体并入并且用于所有目的。
在一些实施方案中,药物部分是选自由以下组成的组:抗微管蛋白剂、DNA结合剂和DNA烷化剂。在一些实施方案中,药物是选自由以下组成的组:奥里斯他汀、吡咯并苯并二氮杂卓、倍癌霉素、美登木素、紫杉烷、卡里奇霉素和蒽环霉素。
药物-接头可用于以单步方法形成ADC。在其他实施方案中,双官能接头化合物可用于以两步或多步方法形成ADC。
通常,选择接头上的官能团与药物部分中的合适反应基团进行特异性反应。作为非限制性实例,基于叠氮化物的部分可用于与药物部分中的反应性炔烃基团进行特异性反应。药物与接头通过叠氮化物和炔烃的1,3-偶极环加成反应共价结合。其他可用的官能团包括例如酮和醛(适合与酰肼和烷氧基胺反应);膦(适合与叠氮化物反应);异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺和醇反应);以及活化的酯诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺和醇反应)。这些和其他链接策略,例如如在Bioconjugate Techniques,第2版(Elsevier)中所述的,是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员将理解,当选择互补的反应性官能团对使药物部分与接头进行选择性反应时,该对的每个成员均可用于接头抑或药物上。
本发明的一些实施方案提供了用于在足以形成抗体-药物缀合物(ADC)的条件下将ecmAb与药物-接头化合物组合的方法。在一些实施方案中,所述方法包括在足以形成抗体-接头缀合物的条件下将ecmAb与双官能接头化合物组合。在此类实施方案中,本发明的方法可还包括在足以通过接头将药物部分与抗体共价连接的条件下将抗体-接头缀合物与药物部分组合。
在一些实施方案中,ADC具有下式:
其中
Ab是抗体,
LU是接头,
D是药物;
并且下标p是1至8的值。
药物负载量
每个抗体的药物-接头分子的平均数量(或平均药物负载量)是ADC组合物的重要特征,因为它是可以递送至靶细胞的药物量的主要决定因素。平均药物负载量包括与工程化半胱氨酸残基缀合的药物,以及与预期的工程化半胱氨酸残基以外的位点缀合的药物和组合物中未缀合的抗体的量。当目标是每个抗体约两个药物的平均药物负载量时,可使用具有两个工程化半胱氨酸残基(例如,每条重链上一个位点或每条轻链上一个位点)的抗体制备ADC组合物。当目标是每个抗体约四个药物的平均药物负载量时,可使用具有四个工程化半胱氨酸残基(例如,每条重链上两个位点,或每条轻链上两个位点,或者重链上一个位点且轻链上一个位点)的抗体制备ADC组合物。本领域技术人员将理解,取决于特定抗体或特定药物,其他药物负载水平可以是治疗上有用的(包括例如小于2的药物负载水平以及大于4的药物负载水平)。可通过将工程化半胱氨酸置于重链的多于一个位点或多于两个位点,或通过将工程化半胱氨酸置于轻链中,或这两者将药物缀合位点引入抗体中。
通常,用具有两个工程化半胱氨酸残基的抗体制备的ADC组合物具有每个抗体约1.5至2.5个药物的平均药物负载量。每个抗体的药物部分的平均数量可以是例如约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5。在一些实施方案中,用具有两个工程化半胱氨酸残基的抗体制备的ADC组合物的平均药物负载量为每个抗体约1.5至约2.2个药物部分,或每个抗体约1.8至约2个药物部分。通常,用具有四个工程化半胱氨酸残基的抗体制备的ADC组合物具有每个抗体约3.4至4.5个药物部分的平均药物负载量。每个抗体的药物部分的平均数量可以是例如约3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0。在一些实施方案中,用具有四个工程化半胱氨酸残基的抗体制备的ADC组合物的平均药物负载量为每个抗体约3.6至约4.2个药物部分,或每个抗体约3.8至约4个药物部分。
可以使用各种分析方法来确定缀合物的收率和异构体混合物。在将药物与抗体缀合后,可以分离缀合的药物-抗体物种。在一些实施方案中,可以基于抗体、药物和/或缀合物的特征分离缀合的抗体物种。可用于分析ADC组合物的其他技术包括但不限于反相色谱法、毛细管电泳和质谱法。可以例如通过LC/MS与蛋白水解消化相结合来分析ADC组合物,以确定ADC中药物部分的位置。
抗体
多种合适的抗体可用于本发明方法中。用于本发明方法的抗体可用于许多应用,包括用于与独特抗原相关的疾病和病症的体外或体内诊断、体内成像以及治疗。基于结构差异,诸如单个抗体分子中的免疫球蛋白单元的数量、各个单元的二硫桥结构以及链长和序列差异,识别出五种人抗体类别(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE),以及这些类别内的各种亚类(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体的类别和亚类被称为抗体的同种型。
抗体可以是完整抗体或抗原结合抗体片段,条件是抗体片段含有至少一个未配对的半胱氨酸(蛋白质内通常不形成链间或链内键的半胱氨酸),所述半胱氨酸为工程化的或天然的,在表达或产生期间被硫醇加帽。
通常,抗体是人、啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼科动物、马或鸡。抗体可以是例如通过本领域技术人员熟知的技术产生的鼠、嵌合、人源化或完全人抗体。可使用标准重组DNA技术制备的包含人和非人部分的重组抗体,诸如嵌合和人源化单克隆抗体,是可用的抗体。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子,诸如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。(参见例如,Cabilly等人,美国专利号4,816,567;和Boss等人,美国专利号4,816,397,这些专利以引用方式整体并入本文。)人源化抗体是来自非人物种的抗体分子,这些抗体分子具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。(参见例如,Queen,美国专利号5,585,089,其以引用方式整体并入本文。)这种嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。如本文所用,“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体,并且包括从人免疫球蛋白文库、从人B细胞或从一种或多种人免疫球蛋白转基因动物中分离的抗体,如例如美国专利号5,939,598和6,111,166中所述。
抗体可为单特异性、双特异性、三特异性或更高多特异性。
在某些情况下,恒定结构域具有效应子功能。如本文所用,术语抗体效应子功能是指由Ig的Fc结构域贡献的功能。这种功能可以通过例如Fc效应结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的Fc受体的结合或通过Fc效应结构域与补体***的组分的结合来实现。效应子功能可以是例如,“抗体依赖性细胞毒作用”或ADCC;“抗体依赖性细胞吞噬作用”或ADCP;“补体依赖性细胞毒作用”或CDC。在某些情况下,恒定结构域缺少一种或多种效应子功能。药物-接头化合物与位于效应子功能结合结构域中的工程化半胱氨酸残基的缀合可以调节效应子功能。
抗体可以针对任何目标抗原,诸如医学和/或治疗目标的抗原。例如,抗原可以是与病原体(诸如但不限于病毒、细菌、真菌和原生动物)、寄生虫、肿瘤细胞或特定医学病症相关的抗原。就肿瘤相关抗原(TAA)而言,癌症可以是免疫***癌症、肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、头部、颈癌、骨癌或任何其他解剖位置的癌症。目标抗原包括但不限于CD30、CD40、Lewis Y、CD70、CD2、CD20、CD22、CD33、CD38、CD40、CD52、HER2、EGFR、VEGF、CEA、HLA-DR、HLA-Dr10、CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis X、甲胎蛋白、CA 242、胎盘碱性磷酸酶、***特异性抗原、***酸性磷酸酶、表皮生长因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、抗运铁蛋白受体、p97、MUC1-KLH、gp100、MART1、IL-2受体、人绒毛膜***、粘蛋白、P21、MPG和Neu致癌基因产物。
一些可用的特异性抗体包括但不限于针对CD33抗原的抗体(例如,如在国际申请号WO 2013/173496中描述的人源化2H12抗体);针对CD70抗原的抗体(例如,如在国际申请号WO2006/113909中描述的人源化1F6抗体);针对CD30抗原的抗体(例如,如在国际申请号WO2008/025020中描述的人源化AC10抗体);针对CD19抗原的抗体(例如,如在国际申请号WO2009/052431中描述的人源化BU12抗体);针对LIV-1、CD123、NTBA或αVβ6的抗体。可以使用许多其他与肿瘤特异性抗原结合的内化抗体,并对这些抗体进行了综述(参见例如,Franke等人(2000),Cancer Biother Radiopharm.15:459-76;Murray(2000),Semin Oncol.27:64-70;Breitling等人,Recombinant Antibodies,John Wiley,and Sons,New York,1998)。这些参考文献和国际申请的公开内容以引用方式并入本文并用于所有目的。
在一些实施方案中,本发明提供用于制备包含至少三个链间二硫键的抗体的方法。在一些实施方案中,抗体包含至少四个链间二硫键。在一些实施方案中,抗体包含1、2、3、4或5个链间二硫键。在一些实施方案中,工程化半胱氨酸残基存在于抗体的重恒定区或轻恒定区中。
工程化半胱氨酸位点
工程化半胱氨酸的位点可能对所得ADC的特性产生影响。例如,完全埋藏在蛋白质结构中的工程化半胱氨酸由于难以触及溶剂而难以缀合,而抗体外表面上的工程化半胱氨酸由于长时间暴露于等离子体中的材料可能产生稳定性受损的ADC。此外,由具有高度暴露的表面工程化半胱氨酸的ecmAb制备的ADC可能对药物的疏水性敏感,而处于更受保护的位置中的工程化半胱氨酸可能对药物的特性不太敏感,因为对溶液中其他材料的触及受到限制。工程化半胱氨酸残基的位置还可用于调节特定ADC所需的效应子功能。例如,药物-接头与效应子功能结合结构域中的工程化半胱氨酸残基的缀合可用于阻断与效应子功能介导的受体的结合。
在一些实施方案中,工程化半胱氨酸位于重链恒定区、重链可变区、轻链可变区、轻链恒定区或它们的组合中。优选的工程化半胱氨酸残基是位于可缀合的位点并产生稳定的键的残基。可缀合的意指工程化半胱氨酸残基能够与功能剂(例如,成像剂、诊断剂、稳定剂或治疗剂)缀合而无需首先使抗体变性。选择用于引入随后可与功能剂缀合的半胱氨酸残基的位点的方法在本领域中是已知的(例如,参见Junutula等人,2008,NatureBiotechnology,26(8),925-932)。在一些实施方案中,抗体具有1至8个或2至8个或2至4个工程化半胱氨酸残基。
在一些方面,工程化半胱氨酸残基是具有10%或更高、20%或更高、30%或更高、40%或更高、或50%或更高的分数溶剂可及性的残基。在一些方面,半胱氨酸残基是具有约10%至约95%、约10%至约85%、约10%至约75%、约10%至约60%、约20%至约95%、约20%至约85%、约20%至约75%、约20%至约60%、或约40%至约95%、约40%至约85%、约40%至约75%、约40%至约60%的分数溶剂可及性的残基。用于确定特定位点的残基的分数溶剂可及性的方法在本领域中是已知的,并且可以例如使用利用Fraczkiewicz和Braun,1998,J.Comp.Chem.,19,319-333中所述的方法的在线服务器getarea(参见http://curie.utmb.edu/getarea.html)来确定。示例性残基包括在轻链上位点15、114、121、127、168、205处的那些残基(编号依照Kabat)或在重链上位点112、114或116处的那些残基(编号依照Kabat编号)。示例性残基包括IgG1抗体Fc区中的那些残基,诸如Fc区中位点239、326、327或269处的那些残基(编号依照EU索引)。在位点239、326和327处的残基的分数溶剂可及性分别为约50%、约94%和约23%。
非抗体蛋白质
本领域技术人员将理解,尽管本文描述的方法是就抗体进行例证,但它可以成功地用于具有未配对半胱氨酸(蛋白质内通常不形成链间或链内键的半胱氨酸)的任何蛋白质,所述半胱氨酸为工程化的或天然的,在表达或产生期间被硫醇加帽。本文所述的方法还可成功地用于含有游离硫醇作为蛋白质一部分的任何蛋白质。本方法对其特别有用的蛋白质是除了包含未配对的半胱氨酸外还含有形成链间二硫键(特别是可以被切割而不会立即导致蛋白质解折叠的键)的天然半胱氨酸的蛋白质。当提及非抗体蛋白质时,术语链间二硫键是指相邻多肽链上的两个半胱氨酸残基之间的共价键。候选非抗体蛋白质包括含有溶剂暴露的二硫键的那些蛋白质,这些蛋白质的天然折叠构象的稳定性与具有加帽硫醇的蛋白质的稳定性相当。如本文所用,工程化半胱氨酸蛋白质是蛋白质中选定的氨基酸已经突变为半胱氨酸的蛋白质。示例性蛋白质还包括Fc-融合蛋白,例如含有与为所需靶标提供特异性的蛋白质共价连接的抗体的Fc区的蛋白质。
IV.实施例
实施例1:细胞培养物制备
在本研究中使用工业相关的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。从二氢叶酸酯-(dhfr-)CHO宿主(Urlaub G,Chasin LA,Isolation of Chinese hamster cell mutantsdeficient in dihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220,1980)获得细胞系,并对这些细胞系进行基因工程化以分泌重组mAb,其中在每个Fc区中***工程化半胱氨酸残基(即S239C)。使用工业标准化学定义的基础培养基培养细胞并维持在摇瓶中。摇瓶培养条件为37℃,5%CO2和125RPM(19mm抛掷(throw))。在于3L生物反应器中开始生产阶段之前3至4天,将细胞培养体积按比例增大。
对于生物反应器实验使用补料分批细胞培养过程。生物反应器(Applikon,Inc.)配备有校准的DO(溶解氧)、pH和温度探针。通过加热毯实现温度控制。通过用空气和氧气喷射来在线控制DO,并通过添加CO2或液体基质来控制pH。使用工业标准的基础培养基和补料培养基培养细胞。工艺条件为pH 7.00,30%DO和200RPM(使用单斜叶片式叶轮)。初始温度设定点为37℃,并在培养第4天转变为33℃。初始工作体积为1.2L,并且从培养第1天至第9天向培养物中添加可变的补料体积。在整个培养过程中维持葡萄糖浓度。
实施例2:在细胞培养的第10天对工程化半胱氨酸残基进行脱帽和重新加帽
在第10天向细胞培养物中添加50mL的100mM胱氨酸溶液,使最终添加浓度为4mM。使细胞培养物在该条件下孵育2小时。加入胱氨酸2小时后,将DO降至0%,保持2小时,然后将DO再增加至100%再保持2小时。在每次操作之前和之后采集样品以评定对EC-帽分布的影响。
如图2所示,在胱氨酸添加步骤后,-cys ecmAb(用cys-帽重新加帽的ecmAb)从大约84%增加至93%,并且在100%DO操作后进一步增加至97%。通常,-cys ecmAb百分比指示icIEF曲线的一致性。对模型分子执行的研究表明,-cys ecmAb的增加对应于icIEF曲线增加的一致性。图3示出了在第10天未添加胱氨酸或未进行DO操作的icIEF曲线的实例。该曲线与第14天的阳性对照不一致(当细胞培养进行至第14天时,icIEF曲线通常是一致的)。然而,第10天加胱氨酸以及第10天加胱氨酸加0%和100%DO的icIEF曲线与该阳性对照一致。此方法被证明是控制不均匀的EC-帽分布而不损害过程和产物的有效方法。
实施例3:在整个细胞培养持续时间内对工程化半胱氨酸残基进行脱帽和重新加帽
在该实施例中,从培养第6天开始,每天向培养物中加入25mL的100mM胱氨酸溶液。从培养第6天至第10天采集样品以评定每日胱氨酸添加对EC-帽分布的影响。在培养第7天评定胱氨酸添加对培养第6天的影响。如图4所示,从培养第7天到第10天,每日胱氨酸添加条件下的-cys ecmAb(半胱氨酸加帽的重新加帽的ecmAb)超过90%。而对照条件下仅在培养第14天后-cys ecmAb才超过90%。
在培养第10天,对于对照和每日胱氨酸添加条件,-cys ecmAb分别为约85%和98%。此方法被证明是控制任何给定培养日的不均匀EC-帽分布而不损害过程和产物的有效方法。
尽管为了清晰和理解的目的已通过说明和举例详细描述了前述内容,但本领域技术人员将理解可在所附权利要求书的范围内实践某些变化和修改。另外,本文提供的每篇参考文献以引用方式整体并入本文,其程度如同每篇参考文献以引用方式单独并入。
Claims (23)
1.一种用于从蛋白质分子中除去半胱氨酸帽的方法,所述方法包括:
培养包含具有至少一个加帽半胱氨酸残基的蛋白质分子的宿主细胞;以及
使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触;
由此从所述蛋白质分子中除去所述半胱氨酸帽。
2.如权利要求1所述的方法,其还包括使所述宿主细胞培养物与溶解氧(DO)接触。
3.如权利要求1所述的方法,其还包括:
在使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触的同时或之后,使所述宿主细胞培养物与第一操作的DO在0%-50%DO的设定点下接触;
在使所述宿主细胞培养物与所述第一操作的DO接触之后,使所述宿主细胞培养物与第二操作的DO在20%-100%DO的设定点下接触。
4.如权利要求3所述的方法,其中使所述宿主细胞培养物与所述第一操作接触的持续时间为0.5-8小时。
5.如权利要求4所述的方法,其中使所述宿主细胞培养物与所述第一操作接触的持续时间为2小时。
6.如权利要求3所述的方法,其中使所述宿主细胞培养物与所述第二操作接触的持续时间为0.5-8小时。
7.如权利要求6所述的方法,其中使所述宿主细胞培养物与所述第二操作接触的持续时间为2小时。
8.如权利要求3所述的方法,其中所述第一操作的DO处于0%DO的设定点。
9.如权利要求3所述的方法,其中所述第二操作的DO处于100%DO的设定点。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述蛋白质是抗体。
11.如权利要求10所述的方法,其还包括在足以形成抗体-药物缀合物的条件下将所述抗体与药物-接头化合物组合。
12.如权利要求10所述的方法,其中所述抗体具有至少两个工程化半胱氨酸残基。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述工程化半胱氨酸残基存在于所述抗体分子的重恒定区中。
14.如权利要求12所述的方法,其中所述工程化半胱氨酸残基存在于所述抗体分子的重链或轻链可变区中。
15.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述蛋白质分子用半胱氨酸分子重新加帽。
16.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述半胱氨酸帽是工程化半胱氨酸帽(EC-帽)。
17.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中在所述宿主细胞培养的第10天使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触。
18.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中在整个所述宿主细胞培养持续时间内每天使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触。
19.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中在所述宿主细胞培养持续时间的最后一天使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触。
20.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中以0.1mM与5M之间的浓度添加所述胱氨酸。
21.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中以4mM的浓度添加所述胱氨酸。
22.一种用于从蛋白质分子中除去半胱氨酸帽并重新形成半胱氨酸帽的方法,所述方法包括:
培养包含具有至少一个加帽半胱氨酸残基的蛋白质分子的宿主细胞;以及
使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触;
在使所述宿主细胞培养物与胱氨酸接触的同时或之后,使所述宿主细胞培养物与第一操作的DO在0%-50%的设定点下接触;
在使所述宿主细胞培养物与DO在0%-50%的设定点下接触之后,使所述宿主细胞培养物与第二操作的DO在20%-100%的设定点下接触。
由此从所述蛋白质分子中除去所述半胱氨酸帽,并用半胱氨酸分子对所述蛋白质分子重新加帽。
23.一种用于从蛋白质分子中除去半胱氨酸帽的方法,所述方法包括:
培养包含具有至少一个加帽半胱氨酸残基的蛋白质分子的宿主细胞;以及
使所述宿主细胞培养物与对称的二硫化物接触;
由此从所述蛋白质分子中除去所述半胱氨酸帽。
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Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005286607A1 (en) * | 2004-09-23 | 2006-03-30 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
CN101237882A (zh) * | 2005-05-26 | 2008-08-06 | 西雅图基因公司 | 人源化的抗-cd40抗体及其使用方法 |
US20110033378A1 (en) * | 2008-01-18 | 2011-02-10 | Medlmmune, Llc. | Cysteine Engineered Antibodies For Site-Specific Conjugation |
WO2015085003A1 (en) * | 2013-12-04 | 2015-06-11 | Immunogen, Inc. | Compositions and methods for antibody production |
CA2938450A1 (en) * | 2014-02-11 | 2015-08-20 | Seattle Genetics, Inc. | Selective reduction of proteins |
WO2015157595A1 (en) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Medimmune, Llc | Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies |
CN105246510A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 细胞培养培养基和抗体生产方法 |
US20160040207A1 (en) * | 2011-04-21 | 2016-02-11 | Amgen Inc. | Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production |
US20160130624A1 (en) * | 2012-03-27 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Harvest operations for recombinant proteins |
US20160130358A1 (en) * | 2014-09-12 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
WO2016103146A1 (en) * | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Novartis Ag | Selective reduction of cysteine residues in il-17 antibodies |
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Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2357152T3 (es) | 2005-10-04 | 2011-04-19 | Zymogenetics, L.L.C. | Producción y purificación de il-29. |
EP2483412A1 (en) * | 2009-09-29 | 2012-08-08 | DSM IP Assets B.V. | Process for producing cysteine and/or glutathione from cystine employing yeast |
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US20150293382A1 (en) * | 2014-04-09 | 2015-10-15 | Pro Fit Optix, Inc. | Method and System for Virtual Try-On and Measurement |
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2019
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- 2019-04-23 IL IL266201A patent/IL266201A/en unknown
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005286607A1 (en) * | 2004-09-23 | 2006-03-30 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
CN101237882A (zh) * | 2005-05-26 | 2008-08-06 | 西雅图基因公司 | 人源化的抗-cd40抗体及其使用方法 |
US20110033378A1 (en) * | 2008-01-18 | 2011-02-10 | Medlmmune, Llc. | Cysteine Engineered Antibodies For Site-Specific Conjugation |
US20160040207A1 (en) * | 2011-04-21 | 2016-02-11 | Amgen Inc. | Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production |
US20160130624A1 (en) * | 2012-03-27 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Harvest operations for recombinant proteins |
CN105246510A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 细胞培养培养基和抗体生产方法 |
JP2016513478A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-16 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 細胞培養培地及び抗体を産生する方法 |
WO2015085003A1 (en) * | 2013-12-04 | 2015-06-11 | Immunogen, Inc. | Compositions and methods for antibody production |
WO2015123265A1 (en) * | 2014-02-11 | 2015-08-20 | Seattle Genetics, Inc. | Selective reduction of proteins |
CA2938450A1 (en) * | 2014-02-11 | 2015-08-20 | Seattle Genetics, Inc. | Selective reduction of proteins |
CN106456725A (zh) * | 2014-02-11 | 2017-02-22 | 西雅图基因公司 | 蛋白质的选择性还原 |
WO2015157595A1 (en) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Medimmune, Llc | Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies |
US20160130358A1 (en) * | 2014-09-12 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
WO2016103146A1 (en) * | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Novartis Ag | Selective reduction of cysteine residues in il-17 antibodies |
RU2019123839A3 (zh) * | 2017-02-08 | 2021-03-09 |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
ASOJO OA等: "Structural studies of human glioma pathogenesis-related protein 1", 《ACTA CRYSTALLOGR D BIOL CRYSTALLOGR》 * |
ASOJO OA等: "Structural studies of human glioma pathogenesis-related protein 1", 《ACTA CRYSTALLOGR D BIOL CRYSTALLOGR》, vol. 67, 31 October 2011 (2011-10-31), pages 847 - 55 * |
CHEN XN等: "Charge-based analysis of antibodies with engineered cysteines: from multiple peaks to a single main peak", 《MABS》 * |
CHEN XN等: "Charge-based analysis of antibodies with engineered cysteines: from multiple peaks to a single main peak", 《MABS》, vol. 1, no. 6, 12 November 2009 (2009-11-12), pages 563 - 71, XP002661117 * |
CHEN XN等: "Charge-based analysis of antibodies with engineered cysteines: from multiple peaks to a single main peak", MABS, vol. 1, no. 6, pages 563 - 571, XP002661117 * |
HILL BG等: "Protein S-glutathiolation: redox-sensitive regulation of protein function", 《J MOL CELL CARDIOL》 * |
HILL BG等: "Protein S-glutathiolation: redox-sensitive regulation of protein function", 《J MOL CELL CARDIOL》, vol. 52, no. 3, 20 July 2011 (2011-07-20), pages 559 - 67 * |
田辉凯等: "非洲爪蟾卵非细胞翻译体系的建立及应用", 《中国药理学通报》 * |
田辉凯等: "非洲爪蟾卵非细胞翻译体系的建立及应用", 《中国药理学通报》, vol. 19, no. 7, 31 December 2003 (2003-12-31), pages 768 - 771 * |
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