TW201819407A - 工程化半胱胺酸帽之分佈 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於自抗體移除半胱胺酸帽且用半胱胺酸分子再加帽該等抗體之方法。該等方法尤其包括培養宿主細胞，該宿主細胞包含具有至少一個工程化加帽半胱胺酸殘基之蛋白質分子，以及使該細胞培養物與胱胺酸接觸。可操控細胞培養物中之溶解氧水準以進一步促進該移除及再加帽製程。

Description

工程化半胱胺酸帽之分佈
在其中所選擇的胺基酸已突變成半胱胺酸之單株抗體(mAb) (亦即工程化半胱胺酸mAb或ecmAb)尤其適用於結合物(例如抗體藥結合物或ADC)，因為包括ecmAb之結合物具有包括藥物對抗體比率(DAR)之均勻性、有利的藥代動力學、穩定性及溶解度之有利性質。半胱胺酸突變置於抗體胺基酸序列之通常並不形成鏈間或鏈內二硫鍵的位置中，且產生突變mAb之細胞內的表現機制將半胱胺酸殘基作為不成對半胱胺酸處理。因此，工程化半胱胺酸通常以具有非編碼半胱胺酸分子之混合二硫化物形式表現(亦即工程化半胱胺酸用加帽劑「加帽」，例如半胱胺酸(cys-帽)、高半胱胺酸(hcy-帽)、半胱胺醯基甘胺酸(cysgly-帽)或麩胱甘肽(gsh-帽)，以形成工程化半胱胺酸帽(EC-帽))。 在任何批次之工程化半胱胺酸抗體中，工程化半胱胺酸之高反應性硫醇通常藉由一系列EC-帽種類來保護。雖然ecmAb不影響最終mAb或ADC，在ecmAb上之EC-帽的不均勻性可呈現為成像毛細管等電聚焦(icIEF)曲線中不同的峰值，而具有相同EC-帽種類之ecmAb的icIEF曲線為一致的。不一致的icIEF曲線可導致拒絕良好生產規範(GMP)批次，因為icIEF為在mAb及ADC生產期間用於中間產物抗體材料之常用抗體釋放分析。不均勻的EC-帽分佈可藉由延長細胞培養之持續時間來轉化為單一EC-帽種類(cys-帽)，但此為限制性及高成本的，且可影響產物品質。本發明解決此問題及其他問題。
本發明尤其提供一種用於自蛋白質分子移除半胱胺酸帽之方法，其藉由培養包含具有至少一個加帽半胱胺酸殘基之蛋白質分子的宿主細胞，及使該宿主細胞培養物與胱胺酸接觸，藉此自蛋白質分子移除半胱胺酸帽來達成。在一個實施例中，宿主細胞培養物進一步與溶解氧(DO)接觸。在另一實施例中，在宿主細胞培養物與胱胺酸接觸的同時或之後，使宿主細胞培養物在0%-50% DO之設定值下與第一次操控之DO接觸，且在宿主細胞培養物與第一次操控之DO接觸之後，使宿主細胞培養物在20%-100% DO之設定值下與第二次操控之DO接觸。在一個實施例中，宿主細胞培養物與第一次操控之DO接觸0.5-8小時。在一個實施例中，宿主細胞培養物與第二次操控之DO接觸0.5-8小時。在一個實施例中，第一次操控之DO處於0% DO之設定值。在一個實施例中，第二次操控之DO處於100% DO之設定值。 在一個實施例中，上文所述之蛋白質為抗體。在另一實施例中，該抗體在足以形成抗體-藥物結合物之條件下與藥物-連接子化合物組合。在另一實施例中，抗體具有至少兩個工程化半胱胺酸殘基。在一個實施例中，工程化半胱胺酸殘基存在於抗體分子之重鏈恆定區中。在另一實施例中，工程化半胱胺酸殘基存在於抗體分子之重鏈或輕鏈可變區中。在一個實施例中，半胱胺酸帽為工程化半胱胺酸帽(EC-帽)。 在一個實施例中，宿主細胞培養物在宿主細胞培養的第10天與胱胺酸接觸。在另一實施例中，宿主細胞培養物在整個宿主細胞培養期間每天與胱胺酸接觸。在另一實施例中，宿主細胞培養物在宿主細胞培養期間的最後一天與胱胺酸接觸。在一個實施例中，胱胺酸以0.1 mM與5 M之間的濃度添加。在另一實施例中，胱胺酸以4 mM的濃度添加。
I. 綜述 本發明尤其提供一種用於在細胞培養中自蛋白質移除不同物種(例如半胱胺酸、高半胱胺酸、半胱胺醯基甘胺酸及/或麩胱甘肽)之工程化半胱胺酸帽(EC-帽)的方法，藉此隨後用一致的所需帽種類(例如半胱胺酸、高半胱胺酸、半胱胺醯基甘胺酸及麩胱甘肽中之一者)再加帽該等蛋白質之工程化半胱胺酸。在一個實施例中，該方法包括使包含ecmAb之細胞培養物與胱胺酸溶液在足以使工程化半胱胺酸殘基脫帽且用cys-帽再加帽該等殘基之條件下接觸。添加胱胺酸溶液至細胞培養物可較佳在已收集抗體之後添加胱胺酸溶液，因為其解決中間產物mAb材料中EC-帽之潛在的不均勻性且確保在細胞培養製程水準下控制EC-帽分佈。在一些實施例中，在細胞培養物中操控溶解氧(DO)水準以進一步促進脫帽/再加帽製程。本發明之方法尤其提供整個icIEF曲線及其他基於電荷之分析曲線中的一致性，且簡化用於製備mAb及ADC之當前製造規範。 II. 定義 如本文所用，術語「抗體」概括地指完整單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及展現所需生物活性(亦即結合至靶抗原之特異性)且具有至少一個天然鏈間二硫鍵的抗體片段。示例性的片段包括例如Fab、微型抗體及類似者。完整抗體通常由四條多肽鏈(兩條重鏈及兩條輕鏈)構成，各多肽主要具有兩個區域：可變區及恆定區。可變區與靶抗原特異性結合且與其相互作用。可變區包括識別特定抗原上的特異性結合位點且與特異性結合位點結合的互補決定區(CDR)。恆定區可由免疫系統識別且與其相互作用(參見例如Janeway等人, 2001,Immuno . Biology , 第5版, Garland Publishing, New York)。四條多肽鏈經由鏈間二硫鍵彼此共價連接。抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。抗體可源自任何適合物種。在一些實施例中，抗體來源為人類或鼠類。單株抗體可為例如人類、人類化或嵌合單株抗體。視上下文而定，術語「抗體」可指單個抗體分子或抗體分子之集合(諸如在抗體溶液中)。 如本文所用，術語「鏈間二硫鍵」係指抗體中相鄰多肽鏈上兩個半胱胺酸殘基之間的共價鍵。二硫鍵具有式R1 -S-S-R2 ，其中硫原子存在於半胱胺酸側鏈中且R1 及R2 表示半胱胺酸殘基及其駐存之多肽鏈的其餘部分。鏈間二硫鍵通常存在於抗體中之重鏈與輕鏈之間，或在兩條重鏈之間。 如本文所用，術語「工程化半胱胺酸殘基」係指引入至蛋白質(例如抗體)之肽序列中的半胱胺酸殘基。具有工程化半胱胺酸殘基之單株抗體可稱作「ecmAb」。工程化半胱胺酸殘基通常不存在於蛋白質之天然(亦即天然存在之)肽序列中。工程化半胱胺酸殘基可取代在肽序列中指定位置處天然存在的胺基酸，且可經由重組技術(諸如定點突變誘發)引入至肽序列中。工程化半胱胺酸殘基可加帽或脫帽。 如本文所用，術語「脫帽半胱胺酸殘基」係指其中α-側鏈含有具有式R1 -SH之游離硫醇部分的半胱胺酸殘基。R1 表示半胱胺酸殘基之非硫醇部分。脫帽半胱胺酸殘基可為脫帽工程化半胱胺酸殘基。 如本文所用，術語「加帽半胱胺酸殘基」係指其中α-側鏈含有具有式R1 -S-S-R3 之二硫鍵部分的半胱胺酸殘基。R1 表示半胱胺酸殘基之非硫醇部分，且R3 表示分子量為小於或等於約500 Da之加帽部分的非硫醇部分。帽可為例如半胱胺酸、高半胱胺酸、半胱胺醯基甘胺酸或麩胱甘肽(其中R3 分別表示游離半胱胺酸、半胱胺醯基甘胺酸之非硫醇部分或麩胱甘肽之非硫醇部分)或任何其他可獲得的單硫醇。加帽半胱胺酸殘基可為加帽工程化半胱胺酸殘基。 如本文所用，自蛋白質「移除」物質(諸如EC-帽(或帽副產物))係指自蛋白質移除物質之任何部分(包括物質之全部)。 如本文所用，在蛋白質上「再加帽」物質(諸如EC-帽(或帽副產物))係指在蛋白質上再形成物質之任何部分(包括物質之全部)。 如本文所用，術語「抗體-藥物結合物」及「ADC」係指視情況經由連接子與治療劑(亦即藥物)結合之抗體。 如本文所用，術語「藥物-連接子化合物」或「藥物-連接子」係指具有藥物部分及附接至其上之連接子的分子，其中連接子含有適合於在抗體中附接至胺基酸殘基(諸如半胱胺酸殘基)的反應性部分。 III. 實施例之描述 本發明尤其提供一種用於自ecmAb移除工程化半胱胺酸帽(EC-帽)且在ecmAb上再形成所需帽種類之方法。在一個實施例中，該方法包括使包含ecmAb之細胞培養物與胱胺酸溶液在足以使工程化半胱胺酸殘基脫帽且用半胱胺酸再加帽該等殘基之條件下接觸。 細胞培養條件 在一些實施例中，自宿主細胞培養物產生及收集ecmAb。圖1展示在抗體之工程化半胱胺酸殘基上之EC-帽的各種實例。在任何細胞培養物中，具有工程化半胱胺酸殘基的抗體可用圖1中展示的任何或所有EC-帽種類加帽。本發明之方法可用以在細胞培養物中建立ecmAb之EC-帽之間的一致性，例如以移除EC-帽且用cys-帽對工程化半胱胺酸殘基再加帽。在一些此類態樣中，工程化半胱胺酸殘基應處於抗體重鏈之位置239處(根據由Kabat等人所述之EU索引編號，「Sequences of proteins of immunological interest」，第5版，公開案第91-3242號, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, M.D., 1991)。細胞培養物可包含任何哺乳動物細胞株，包括CHO細胞。用於細胞培養物之培養基可為任何培養基，包括RPMI。在一些實施例中，培養基已含有低濃度之胱胺酸。然而，培養基中低含量之胱胺酸通常不足以自ecmAb移除EC-帽且再加帽EC-帽。 細胞培養物可包括任何適合量之ecmAb。通常，細胞培養物中蛋白質(無論抗體蛋白或非抗體蛋白)之濃度在約0.01 mg/ml至約150 mg/ml或超過150 mg/ml之範圍內，更典型地在約1 mg/ml至約50 mg/ml範圍內。細胞培養物可含有每ml細胞培養物例如約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.5、15、17.5、20、22.5、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或約150 mg之蛋白質(無論抗體或非抗體蛋白)。熟習此項技術者應能夠將基於質量的濃度(例如 mg/ml)轉換成莫耳濃度(亦即莫耳/L)。 為了自ecmAb移除EC-帽且用半胱胺酸再加帽，將胱胺酸溶液添加至細胞培養物中。胱胺酸溶液可為任何種類之溶液，諸如酸性或鹼性溶液，或胱胺酸可存在於細胞培養基(例如進料培養基或基礎培養基)中。可藉由任何方法將胱胺酸溶液添加至細胞培養物中，包括直接注入。在其他實施例中，將不同的溶液添加至細胞培養物中，諸如二硫化高半胱胺酸或任何對稱二硫化物。在一些實施例中，添加所需EC-帽之單體及二聚體兩者以促進EC-帽交換，例如將半胱胺酸及胱胺酸添加至細胞培養物中。在一個實施例中，用以再加帽工程化半胱胺酸殘基之EC-帽種類視添加至細胞培養物中的對稱二硫化物而定。舉例而言，若添加胱胺酸，則ecmAb會用半胱胺酸再加帽；若添加二硫化高半胱胺酸，則ecmAb會用高半胱胺酸再加帽。 任何適合量之胱胺酸溶液(或其他對稱二硫化物)可用於本發明之方法。大體而言，添加至細胞培養物中的對稱二硫化濃度足夠高，以脫帽及再加帽抗體之工程化半胱胺酸殘基。在一些實施例中，以0.1 mM與5 M之間的濃度添加胱胺酸。在其他實施例中，以0.1 mM與1 M、0.1 mM與100 mM、1 mM與100 mM、1 mM與10 mM或1 mM與5 mM之間的濃度添加胱胺酸。在其他實施例中，以0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900 mM，或1、2、3、4或5 M之濃度添加胱胺酸。在一些實施例中，濃度可增加或降低。在一些實施例中，胱胺酸之濃度應保持為高於總抗體之濃度的濃度。細胞培養物中胱胺酸的濃度在一些態樣中應大約為高於細胞培養物中總抗體濃度的約5倍至約10,000倍、5倍至約5,000倍、5倍至約1,000倍、5倍至約500倍、5倍至約100倍、5倍至約20倍、5倍至約15倍或5倍至約10倍。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養物中胱胺酸對總抗體之濃度比應為約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、50:1、100:1或更多。 在一些實施例中，在細胞培養期間每天添加胱胺酸(或其他對稱二硫化物)。在其他實施例中，僅在某些天(例如細胞培養的第10天)添加胱胺酸。在一些實施例中，在細胞培養之以下任何或所有天數添加胱胺酸：第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或超過第15天之任何天數，諸如第20天、第25天、第30天、第35天、第60天、第90天或超過第90天的任何天數。在一個實施例中，在細胞培養期間的最後一天添加胱胺酸。在整個細胞培養期間，胱胺酸可添加一次、兩次、三次或四次或超過四次。在一個實施例中，在自細胞培養物收集抗體的那天將胱胺酸添加至細胞培養物中。 任何適合量之溶解氧可用於本發明之方法。在一些實施例中，在添加胱胺酸之後在細胞培養物中操控DO設定值。在其他實施例中，在添加胱胺酸之前或與添加胱胺酸同時操控DO設定值。在一個實施例中，在添加胱胺酸之前、在添加胱胺酸期間或在添加胱胺酸之後將DO減少至大約0%與99%之間(其中100% DO 為100%空氣飽和度，或約21%氧)，以便建立減少之環境。舉例而言，可將DO減少至在0%-90%、0%-50%、0%-30%、0%-20%、0%-10%、10%-50%、10%-40%、10%-30%、10%-20%之間的設定值，或0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之設定值。可在添加胱胺酸之後減少DO維持任何持續時間，包括0.5-10小時、0.5-4小時、0.5-2小時、0.5-8小時、0.5-10小時、1-10小時、1-4小時、1-2小時、5分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時或10小時或超過10小時。在DO減少之後，隨後將DO增加至大約1%與500%之間，維持任何持續時間。舉例而言，可將DO增加至10%-500%、20%-500%、30%-500%、40%-500%、50%-500%、60%-500%、70%-500%、80%-500%、90%-500%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%之間的設定值，或10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之設定值。可增加DO維持任何持續時間，包括0.5-10小時、0.5-4小時、0.5-2小時、1-10小時、1-4小時、1-2小時、5分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時或10小時或超過10小時。可藉由任何方法添加DO，包括用空氣及氧氣鼓泡及/或覆蓋。 抗體結合物 抗體上的脫帽工程化半胱胺酸殘基充當安置多種官能基之適用柄，包括成像劑(諸如發色團及螢光團)、診斷劑(諸如MRI對比試劑及放射性同位素)、穩定劑(諸如聚乙二醇聚合物)及治療劑。在結合製程期間，將會移除ecmAb之不同EC-帽，得到脫帽半胱胺酸殘基。具有脫帽半胱胺酸殘基之抗體可與功能劑結合以形成抗體-功能劑結合物。功能劑(例如藥物、偵測劑、穩定劑)在工程化半胱胺酸殘基之位點處與抗體結合(共價連接)。功能劑可經由連接子間接附接或經由功能劑上的硫醇反應性基團直接附接。 具有脫帽半胱胺酸殘基之抗體可與藥物結合以形成抗體藥結合物(ADC)。通常，ADC在藥物與抗體之間含有連接子。連接子可為可裂解連接子或不可裂解連接子。可裂解連接子通常在細胞內條件下對裂解敏感，使得連接子之裂解在靶點處自抗體釋放藥物。適合之可裂解連接子包括例如酶可裂解連接子，其包括含有可藉由細胞內蛋白酶(諸如溶酶體蛋白酶或內體蛋白酶)裂解之連接子的肽基，或糖連接子，例如可藉由葡糖苷酸酶裂解之含有葡萄糖苷酸的連接子。肽基連接子可包括例如二肽，諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、***酸-離胺酸(phe-lys)或纈胺酸-丙胺酸(val-ala)。其他適合之可裂解連接子包括例如pH敏感連接子(例如在pH值小於5.5下可水解的連接子，諸如腙連接子)及在還原條件下可裂解的連接子(例如二硫化物連接子)。不可裂解連接子通常藉由抗體之蛋白水解降解來釋放藥物。 在附接至抗體之前，連接子應具有可與脫帽工程化半胱胺酸殘基反應之基團且將會經由該反應性基團附接。硫醇特異性反應基係較佳的且包括例如順丁烯二醯亞胺；鹵乙醯胺(例如碘、溴或氯)；鹵酯(例如碘、溴或氯)；鹵甲基酮(例如碘、溴或氯)；苯甲基鹵化物(例如碘化物、溴化物或氯化物)；乙烯碸；(吡啶基)二硫化物；二硫化物二氧化物衍生物；汞衍生物諸如3,6-雙-(汞甲基)二噁烷，其中相對離子為乙酸根、氯離子或硝酸根；及聚亞甲基雙甲烷硫基磺酸鹽。連接子可包括例如經由硫基-丁二醯亞胺鍵附接至抗體的順丁烯二醯亞胺。 藥物可為任何細胞毒性藥物、細胞增殖抑制藥物或免疫抑制藥物。在連接子連接抗體與藥物之實施例中，該藥物具有可與該連接子形成鍵的官能基。舉例而言，藥物可具有可與連接子形成鍵的胺、羧酸、硫醇、羥基或酮。在其中藥物直接附接至連接子的態樣中，在附接至抗體之前，藥物應具有可與脫帽工程化半胱胺酸反應的基團。 適用類別之藥物包括例如抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化劑、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學療法敏化劑、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼或其類似物。適用類別之細胞毒性劑之實例尤其包括例如DNA小溝結合劑、DNA烷基化劑及微管蛋白抑制劑。示例性細胞毒性劑包括例如奧瑞他汀(auristatin)、喜樹鹼、倍癌黴素(duocarmycin)、依讬泊苷(etoposide)、美登素(maytansine)及類美登素(例如DM1及DM4)、紫杉烷、苯并二氮呯或含有苯并二氮呯之藥物(例如吡咯并[1,4]-苯并二氮呯(PBD)、吲哚啉并苯并二氮呯及噁唑啶并苯并二氮呯)及長春花生物鹼。所選含有苯并二氮呯之藥物描述於WO 2010/091150、WO 2012/112708、WO 2007/085930及WO 2011/023883中。 在一些典型實施例中，適合細胞毒性劑包括例如DNA小溝結合劑(例如烯二炔及萊克希托普森(lexitropsin)、CBI化合物；亦參見美國專利第6,130,237號)、倍癌黴素(參見美國公開案第20060024317號)、紫杉烷(例如太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)、嘌呤黴素、長春花生物鹼、CC-1065、SN-38、拓朴替康、(N-嗎啉基)-小紅莓、根黴素、氰基(N-嗎啉基)-小紅莓、棘黴素、考布他汀(combretastatin)、紡錘菌素、埃坡黴素(epothilone) A及B、雌莫司汀(estramustine)、克瑞普托非森(cryptophysin)、西馬多丁(cemadotin)、類美登素、迪斯德莫來(discodermolide)、艾榴素(eleutherobin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。 藥物可為抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑之實例包括但不限於紫杉烷(例如Taxol® (太平洋紫杉醇)、Taxotere® (多烯紫杉醇))、T67 (Tularik)及長春花生物鹼(例如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞賓(vinorelbine))。其他抗微管蛋白劑包括例如漿果赤黴素衍生物、紫杉烷類似物(例如埃坡黴素A及B)、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙鹼及秋水醯胺(colcimid)、雌莫司汀、克瑞普托非森、西馬多丁、類美登素、風車子抑素(combretastatin)、迪斯德莫來、奧瑞他汀及艾榴素。 藥物可為美登素或類美登素，另一組抗微管蛋白劑。(ImmunoGen公司；亦參見Chari等人, 1992, Cancer Res. 52:127-131及美國專利第8,163,888號)。 藥物可為奧瑞他汀。奧瑞他汀包括但不限於AE、AFP、AEB、AEVB、MMAF及MMAE。奧瑞他汀之合成及結構描述於美國專利申請公開案第2003-0083263號及第2009-0111756號；國際專利公開案第WO 04/010957號；國際專利公開案第WO 02/088172號；美國專利第6,884,869號；美國專利第7,659,241號；美國專利第7,498,298號；美國專利第8,343,928號及美國專利第8,609,105號中；其各以全文引用的方式併入本文中且用於所有目的。 在一些實施例中，藥物部分選自由以下各者組成之群：抗微管蛋白劑、DNA結合劑及DNA烷化劑。在一些實施例中，藥物選自由以下各者組成之群：奧瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯、倍癌黴素、類美登素、紫杉烷、卡奇黴素及蒽環黴素。 藥物-連接子可用以在單一步驟中形成ADC。在其他實施例中，雙官能連接子化合物可用以在兩步驟或多步驟製程中形成ADC。 通常，選擇連接子上的官能基用於與藥物部分中適合之反應性基團的特異性反應。作為非限制性實例，基於疊氮化合物之部分可用於與藥物部分中反應性炔基的特異性反應。藥物經由疊氮化合物與炔的1,3-偶極環加成共價結合至連接子。其他適用官能基包括例如酮及醛(適合於與醯肼及烷氧胺之反應)；膦(適合於與疊氮化合物之反應)；異氰酸酯及異硫氰酸酯(適合於與胺及醇之反應)；及活化酯，諸如N - 羥基丁二醯亞胺酯(適合於與胺及醇之反應)。此等及其他連接策略(如例如Bioconjugate Techniques , 第2版. (Elsevier)中所述)已為熟習此項技術者所熟知。熟習此項技術者應瞭解在選擇用於藥物部分對連接子之選擇性反應的互補對反應性官能基時，該對之各成員可在連接子或藥物任一者上使用。 本發明之一些實施例提供用於使ecmAb與藥物-連接子化合物在足以形成抗體-藥物結合物(ADC)之條件下組合的方法。在一些實施例中，該等方法包括使ecmAb與雙官能連接子化合物在足以形成抗體-連接子結合物之條件下組合。在此類實施例中，本發明之方法可另外包括使抗體-連接子結合物與藥物部分在足以使藥物部分經由連接子共價連接至抗體之條件下組合。 在一些實施例中，ADC具有下式：其中 Ab為抗體， LU為連接子， D為藥物； 且下標p為1至8之數值。 藥物載荷 每抗體藥物-連接子分子之平均數量(或平均藥物負荷)係ADC組合物之重要特徵，因為其係可傳遞至靶細胞之藥物量的主要決定因素。平均藥物負荷包括與工程化半胱胺酸殘基結合之藥物，以及與除預期工程化半胱胺酸殘基之外的位點結合之藥物及組合物中非結合抗體之量。當靶向每抗體約兩個藥物之平均藥物載荷時，具有兩個工程化半胱胺酸殘基之抗體(例如各重鏈上一個位點或各輕鏈上一個位點)可用以製備ADC組合物。當靶向每抗體約四個藥物之平均藥物載荷時，具有四個工程化半胱胺酸殘基之抗體(例如在各重鏈上兩個位點或在各輕鏈上兩個位點，或重鏈上一個位點及輕鏈上一個位點)可用以製備ADC組合物。熟習此項技術者應瞭解視特定抗體或特定藥物而定，其他水準之藥物載荷可為治療上適用的(包括例如小於2之藥物載荷以及超過4之藥物載荷)。可藉由在重鏈中超過一個位點或超過兩個位點處置放工程化半胱胺酸，或藉由在輕鏈中置放工程化半胱胺酸或兩者在抗體中引入用於藥物結合之位點。 通常，用具有兩個工程化半胱胺酸殘基之抗體製備的ADC組合物之平均藥物載荷為每抗體約1.5至2.5個藥物。每抗體藥物部分之平均數量可為例如約1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5。在一些實施例中，用具有兩個工程化半胱胺酸殘基之抗體製備的ADC組合物的平均藥物載荷為每抗體約1.5至約2.2個藥物部分，或每抗體約1.8至約2個藥物部分。通常，用具有四個工程化半胱胺酸殘基之抗體製備的ADC組合物之平均藥物載荷為每抗體約3.4至4.5個藥物部分。每抗體藥物部分之平均數量可為例如約3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0。在一些實施例中，用具有四個工程化半胱胺酸殘基之抗體製備的ADC組合物之平均藥物載荷為每抗體約3.6至約4.2個藥物部分，或每抗體約3.8至約4個藥物部分。 可使用各種分析方法以測定結合物之產率及異構混合物。在藥物與抗體結合之後，結合之藥物-抗體種類可經分離。在一些實施例中，可基於抗體、藥物及/或結合物之特徵來分離結合之抗體種類。適用於對ADC組合物進行分析的其他技術包括但不限於逆相層析、毛細電泳法及質譜法。可例如藉由與蛋白水解分解配合的LC/MS分析ADC組合物，以測定藥物部分在ADC中之位置。 抗體 多種適合之抗體可用於本發明之方法。本發明之方法中所使用的抗體適用於多種應用，包括活體外或活體內診斷、活體內成像及對於與獨特抗原有關之疾病和病況的療法。五種人類抗體類別(IgG、IgA、IgM、IgD及IgE)以及此等類別中之各種子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)係基於結構差異(諸如在單一抗體分子中免疫球蛋白單元之數目、單獨單元之二硫橋鍵結構及鏈長及序列之差異)來識別。抗體之類別及子類別稱為該抗體之同型。 抗體可為完整抗體或抗原結合之抗體片段，其限制條件為抗體片段含有至少一個工程化或天然未配對半胱胺酸(通常不在蛋白質內形成鏈間鍵或鏈內鍵之半胱胺酸)，其在表現或產生期間用硫醇加帽。 通常，抗體為人類、嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞。抗體可為例如藉由熟習此項技術者所熟知之技術產生的鼠、嵌合、人類化或完全人類抗體。可使用標準重組DNA技術製備的包含人類與非人類部分兩者之重組抗體(諸如嵌合及人類化單株抗體)為適用抗體。嵌合抗體為不同部分係源自不同動物物種之分子，諸如具有源自鼠類單株之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之彼等分子。(參見例如Cabilly等人, 美國專利第4,816,567號；及Boss等人, 美國專利第4,816,397號，其以全文引用之方式併入本文中。)人類化抗體為來自非人類物種之抗體分子，其具有一或多個來自非人類物種之互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區。(參見例如，Queen, 美國專利第5,585,089號，其以全文引用的方式併入本文中。) 此類嵌合及人類化單株抗體可藉由所屬領域中已知的重組DNA技術產生。如本文所用，「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體且包括自人類免疫球蛋白庫、自人類B細胞或自針對一或多個人類免疫球蛋白進行基因轉殖之動物所分離的抗體，如例如美國專利第5,939,598號及第6,111,166號中所述。 抗體可為單特異性、雙特異性、三特異性或更高的多特異性。 在某些個例中，恆定域具有效應功能。如本文中所用，術語抗體效應功能係指由Ig之Fc域提供的功能。此類功能可由例如使Fc效應子結構域與Fc受體在具有吞噬性或溶解活性之免疫細胞上結合或藉由Fc效應子結構域與補體系統之組分結合來實現。效應功能可為例如「抗體依賴性細胞毒性」或ADCC、「抗體依賴性細胞吞噬作用」或ADCP、「補體依賴性細胞毒性」或CDC。在某些個例中，恆定域不具有一或多種效應功能。藥物-連接子化合物與位於效應功能結合結構域中之工程化半胱胺酸殘基結合可調節效應功能。 抗體可針對任何相關抗原，諸如醫療及/或治療性相關。舉例而言，抗原可為與病原體(諸如但不限於病毒、細菌、真菌及原蟲)、寄生蟲、腫瘤細胞或特定醫學病況有關之抗原。在腫瘤相關抗原(TAA)之情況下，癌症可屬於免疫系統、肺、結腸、直腸、***、卵巢、***、頭、頸、骨或任何其他解剖學位置。相關抗原包括但不限於CD30、CD40、Lewis Y、CD70、CD2、CD20、CD22、CD33、CD38、CD40、CD52、HER2、EGFR、VEGF、CEA、HLA-DR、HLA-Dr10、CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis X、α胎蛋白、CA 242，胎盤鹼性磷酸酶、***特異性抗原、***酸性磷酸酶、表皮生長因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、抗運鐵蛋白受體、p97、MUC1-KLH、gp100、MART1、IL-2受體、人絨毛膜***、黏蛋白、P21、MPG及Neu癌基因產物。 一些特異性適用抗體包括但不限於抗CD33抗原之抗體(例如，如國際申請案第WO 2013/173496號中所描述之人類化2H12抗體)、抗CD70抗原之抗體(例如，如國際申請案第WO2006/113909號中所描述之人類化1F6抗體)、抗CD30抗原之抗體(例如，如國際申請案第WO2008/025020號中所描述之人類化AC10抗體)、抗CD19抗原之抗體(例如，如國際申請案第WO 2009/052431號中所描述之人類化BU12抗體)、抗LIV-1、CD123、NTBA或αVβ6之抗體。可使用與腫瘤特異性抗原結合的多種其他內化抗體，且已進行綜述(參見例如Franke等人(2000), Cancer Biother Radiopharm. 15:459-76; Murray (2000), Semin Oncol. 27:64-70; Breitling等人, Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, 紐約, 1998)。此等文獻及國際申請案之揭露內容以引用的方式併入本文中且用於所有目的。 在一些實施例中，本發明提供用於製備包含至少三個鏈間二硫鍵之抗體的方法。在一些實施例中，抗體包含至少四個鏈間二硫鍵。在一些實施例中，抗體包含1、2、3，4或5個鏈間二硫鍵。在一些實施例中，工程化半胱胺酸殘基存在於抗體之重鏈恆定區或輕鏈恆定區中。工程化半胱胺酸位點 工程化半胱胺酸之位點可對所得ADC之性質具有影響。舉例而言，完全埋入蛋白質結構中之工程化半胱胺酸可難以結合，因為不易進入溶劑，而在抗體外表面上之工程化半胱胺酸因為長時間暴露於血漿中之物質可導致ADC穩定性減弱。自具有高度暴露表面之工程化半胱胺酸的ecmAb製備的ADC可對藥物之疏水性敏感，而在更受保護之位置中的工程化半胱胺酸可對藥物之該等性質較不敏感，因為與溶液中之其他物質接近的機會受限。工程化半胱胺酸殘基之位置亦可用以調節如特定ADC所需的效應功能。舉例而言，藥物-連接子與工程化半胱胺酸殘基在效應功能結合結構域中之結合可用以阻擋與效應功能介導之受體的結合。 在一些實施例中，工程化半胱胺酸位於重鏈恆定區、重鏈可變區、輕鏈可變區、輕鏈恆定區或其組合中。較佳之工程化半胱胺酸殘基為位於可結合位點處且產生穩定鍵之殘基。可結合意味著工程化半胱胺酸殘基能夠與功能劑(例如成像劑、診斷劑、穩定劑或治療劑)結合而非首先使抗體變性。選擇用於引入可隨後與功能劑結合之半胱胺酸殘基的位點的方法為此項技術中已知的(例如，參見例如Junutula等人, 2008, Nature Biotechnology, 26(8), 925-932)。在一些實施例中，抗體具有1至8個或2至8個或2至4個工程化半胱胺酸殘基。 在一些態樣中，工程化半胱胺酸殘基係分數溶劑可接近性為10%或超過10%、20%或超過20%、30%或超過30%、40%或超過40%、或50%或超過50%之殘基。在一些態樣中，半胱胺酸殘基係分數溶劑可接近性為約10%至約95%、約10%至約85%、約10%至約75%、約10%至約60%、約20%至約95%、約20%至約85%、約20%至約75%、約20%至約60%或約40%至約95%、約40%至約85%、約40%至約75%、約40%至約60%之殘基。用於測定在特定位點處殘基之分數溶劑可接近性的方法為此項技術中已知的且可例如使用線上伺服器getarea來測定，其使用描述於Fraczkiewicz及Braun, 1998, J.Comp.Chem., 19, 319-333中之方法(參見http://curie.utmb.edu/getarea.html)。示例性的殘基包括處於輕鏈上之位點15、114、121、127、168、205(根據Kabat編號)的彼等殘基或重鏈上之位點112、114或116(根據Kabat編號來編號)的彼等殘基。示例性的殘基包括在IgG1抗體之Fc區中的彼等殘基，諸如處於Fc區中之位點239、326、327或269(根據EU索引編號)的彼等殘基。處於位點239、326及327之殘基的分數溶劑可接近性分別為約50%、約94%及約23%。非抗體蛋白 熟習此項技術者應瞭解儘管本文所述之方法係關於抗體例示，其可成功地用於任何具有工程化或天然不成對半胱胺酸(通常在蛋白質內不形成鏈間鍵或鏈內鍵的半胱胺酸)的蛋白質，該等半胱胺酸在表現或產生期間用硫醇加帽。本文所述之方法亦可成功地用於任何含有游離硫醇作為該蛋白質之一部分的蛋白質。對於此方法尤其有用的蛋白質為除包含不成對的半胱胺酸以外含有形成鏈間二硫鍵(尤其可裂解而不會緊接著導致蛋白質伸展之鍵)之天然半胱胺酸的蛋白質。當提及非抗體蛋白時，術語鏈間二硫鍵係指在相鄰多肽鏈上兩個半胱胺酸殘基之間的共價鍵。候選非抗體蛋白包括含有暴露於溶劑之二硫鍵的彼等蛋白質，該等呈天然摺疊構形之蛋白質的穩定性與具有加帽硫醇之彼等蛋白質類似。如本文所用，工程化半胱胺酸蛋白質係其中在蛋白質中之所選擇的胺基酸已突變成半胱胺酸之蛋白質。例示性蛋白質亦包括Fc融合蛋白，例如含有抗體之Fc區的蛋白質，該抗體與提供對所需標靶之特異性的蛋白質共價連接。 IV. 實例實例 1 ：細胞培養製備 工業相關之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株用於此研究中。細胞株來源於減去二氫葉酸(dhfr-)之CHO宿主(Urlaub G, Chasin LA, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220, 1980)，且經基因工程改造以分泌具有***於各Fc區(亦即S239C)中之工程化半胱胺酸殘基的重組mAb。使用工業標準化學成分確定之基礎培養基在搖瓶中培養及維持細胞。搖瓶培養條件為37℃，5% CO2 及125 RPM及19 mm擺幅。在生產階段開始之前在3 L生物反應器中細胞培養物體積按比例放大3至4天。 分批進料細胞培養製程用於生物反應器實驗。生物反應器(Applikon公司)配備有經校準之DO (溶解氧)、pH及溫度探測器。經由加熱毯實現溫度控制。藉由用空氣及氧氣鼓泡來在線控制DO，且藉由添加CO2 或液體鹼控制pH值。工業標準基礎培養基及進料培養基用以培養細胞。製程條件為pH 7.00，30% DO及200 RPM及一個傾斜葉片葉輪。初始溫度設定值為37℃且在培養第4天轉變為33℃。初始工作體積為1.2 L，且在第1天至第9天將可變進料體積添加至培養物中。在整個培養中保持葡萄糖濃度。實例 2 ：在細胞培養第 10 天脫帽及再加帽工程化半胱胺酸殘基 在第10天將50 mL 100 mM胱胺酸溶液添加至細胞培養物中，以使最終添加濃度為4 mM。使細胞培養物在此條件下培育2小時。在胱胺酸添加2小時之後，DO減少至0%持續2小時，且DO隨後增加至100%再持續2小時。在每次操控之前及之後採集樣品以評估對EC-帽分佈之影響。 如圖2中所示，在胱胺酸添加步驟之後-cys ecmAb (用cys-帽再加帽之ecmAb)自約84%增加至93%，且在100% DO操控之後進一步增加至97%。通常， -cys ecmAbs%係icIEF曲線中一致性之指示。對模型分子進行之研究表明-cys ecmAb之增加對應於icIEF曲線之一致性增加。圖3展示在無胱胺酸添加或DO操控之情況下第10天的icIEF曲線之實例。此曲線與第14天之陽性對照不一致(當細胞培養進行至第14天時，icIEF曲線通常為一致的)。然而，第10天加胱胺酸及第10天加胱胺酸加0%及100% DO的icIEF曲線與此陽性對照一致。此方法經證明為在不損害製程及產物之情況下控制非均勻EC-帽分佈的有效方式。實例 3 ： 在整個細胞培養期間之脫帽及再加帽工程化半胱胺酸殘基 在此實例中，在培養第6天開始每天將25 mL 100 mM胱胺酸溶液添加至培養物中。在培養第6天至第10天採集樣品以評估每天添加胱胺酸對EC-帽分佈之影響。在培養第7天評估培養第6天添加胱胺酸之影響。如圖4中所說明，對於每天添加胱胺酸之條件-cys ecmAb(半胱胺酸加帽之再加帽ecmAb) 自培養第7天至第10天大於90%。對於對照組條件-cys ecmAb僅在培養第14天之後大於90%。 在培養第10天，對於對照組及每天添加胱胺酸之條件，-cys ecmAb分別為約85%及98%。此方法提供在不損害製程及產物之情況下在任何指定培養天數下控制非均勻EC-帽分佈之有效方式。 儘管出於清楚及理解之目的已藉助於說明及實例相當詳細地描述前述發明，但熟習此項技術者應瞭解，可在所附申請專利範圍之範疇內實踐某些改變及修改。此外，本文中所提供之各參考文獻以全文引用的方式併入本文中，其併入程度如同各參考文獻單獨地以引用的方式併入一般。
圖1展示具有一系列工程化半胱胺酸帽種類(包括半胱胺酸(-cys，或cys-帽)、高半胱胺酸(-hcy，或hcy-帽)、半胱胺醯甘胺酸(-cysgly，或cysgly-帽)及麩胱甘肽(-gsh，或gsh-帽)之抗體。 圖2展示根據一個實施例在對於兩個分子進行胱胺酸添加及溶解氧操控之後的EC-帽分佈。第10天表示細胞培養的第10天，+CysCys表示胱胺酸添加，且0%或100% DO表示溶解氧設定值。 圖3展示根據一個實施例在不同條件下之細胞培養物中ecmAb之icIEF曲線。 圖4展示對照組(虛線)及根據一個實施例從第6天開始每天添加胱胺酸之情況下(實線)EC-帽隨時間之分佈。

Claims (23)

  1. 一種用於自蛋白質分子移除半胱胺酸帽之方法，該方法包含： 培養包含具有至少一個加帽半胱胺酸殘基之蛋白質分子的宿主細胞；且 使該宿主細胞培養物與胱胺酸接觸； 藉此自該蛋白質分子移除該半胱胺酸帽。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含使該宿主細胞培養物與溶解氧(DO)接觸。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包含： 在該宿主細胞培養物與胱胺酸接觸的同時或之後，使該宿主細胞培養物在0%-50% DO之設定值下與第一次操控之DO接觸； 在該宿主細胞培養物與該第一次操控之DO接觸之後，使該宿主細胞培養物在20%-100% DO之設定值下與第二次操控之DO接觸。
  4. 如請求項3之方法，其中該宿主細胞培養物與該第一操控之該接觸進行0.5-8小時之持續時間。
  5. 如請求項4之方法，其中該宿主細胞培養物與該第一操控之該接觸進行2小時之持續時間。
  6. 如請求項3之方法，其中該宿主細胞培養物與該第二操控之接觸進行0.5-8小時之持續時間。
  7. 如請求項6之方法，其中該宿主細胞培養物與該第二操控之接觸進行2小時之持續時間。
  8. 如請求項3之方法，其中該第一次操控之DO係處於0% DO之設定值。
  9. 如請求項3之方法，其中該第二次操控之DO係處於100% DO之設定值。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體。
  11. 如請求項10之方法，其進一步包含使該抗體與藥物-連接子化合物在足以形成抗體-藥物結合物之條件下組合。
  12. 如請求項10之方法，其中該抗體具有至少兩個工程化半胱胺酸殘基。
  13. 如請求項12之方法，其中該等工程化半胱胺酸殘基存在於該抗體分子之重鏈恆定區中。
  14. 如請求項12之方法，其中該等工程化半胱胺酸殘基存在於該抗體分子之重鏈或輕鏈可變區中。
  15. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該蛋白質分子用半胱胺酸分子再加帽。
  16. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該半胱胺酸帽係工程化半胱胺酸帽(EC-帽)。
  17. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該宿主細胞培養物係在宿主細胞培養的第10天與胱胺酸接觸。
  18. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該宿主細胞培養物在整個宿主細胞培養期間每天與胱胺酸接觸。
  19. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該宿主細胞培養物在宿主細胞培養期間的最後一天與胱胺酸接觸。
  20. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該胱胺酸以0.1 mM與5 M之間的濃度添加。
  21. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該胱胺酸以4 mM之濃度添加。
  22. 一種用於自蛋白質分子移除及再形成半胱胺酸帽之方法，該方法包含： 培養包含具有至少一個加帽半胱胺酸殘基之蛋白質分子的宿主細胞；及 使該宿主細胞培養物與胱胺酸接觸； 在該宿主細胞培養物與胱胺酸接觸的同時或之後，使該宿主細胞培養物在0%-50%之設定值下與第一次操控之DO接觸； 在該宿主細胞培養物在0%-50%之設定值下與DO接觸之後，使該宿主細胞培養物在20%-100%之設定值下與第二次操控之DO接觸， 藉此自該蛋白質分子移除該半胱胺酸帽且用半胱胺酸分子再加帽該蛋白質分子。
  23. 一種用於自蛋白質分子移除半胱胺酸帽之方法，該方法包含： 培養包含具有至少一個加帽半胱胺酸殘基之蛋白質分子的宿主細胞；及 使該宿主細胞培養物與對稱二硫化物接觸； 藉此自該蛋白質分子移除該半胱胺酸帽。
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