CN109867822A - 一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶及其制备方法和应用。一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶的制备方法,包括以下步骤:(1)制备烷烃化壳聚糖;(2)制备烷烃化壳聚糖溶液、四臂聚乙二醇苯甲醛溶液;(3)烷烃化壳聚糖溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛溶液混合,室温下成胶。将烷烃链修饰到壳聚糖的氨基上制备烷烃化壳聚糖,疏水的烷烃链与疏水性的细胞膜可通过疏水作用力相互固定,从而将血细胞固定在壳聚糖的长链上,凝结血液,快速止血,再通过亚胺键交联聚乙二醇苯甲醛,形成功能更强、更稳定的自修复水凝胶,兼具水凝胶浓缩血液止血、吸收渗液、促进创面修复等功能。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域,涉及一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶及其制备方法和应用,尤其涉及一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
1.腹腔开放疗法是危重病救治的重要手段
腹腔开放疗法指危重症救治时主动打开腹腔或者在腹部手术后不缝合切口,使用临时关腹材料关闭腹腔的方法,能够减轻腹腔内压力、便于清除感染坏死组织、及时止血并且及时发现并处理肠外瘘等并发症,可分为三个阶段,分别为早期开放和临时关腹阶段、中期维持阶段以及后期消化道和腹壁重建阶段。该疗法贯彻损伤控制理念,目前已成为临床上救治严重创伤、重度腹腔感染以及腹腔间室综合征的重要治疗手段,在SurgicalInfection Society(SIS)和World Society of Emergency Surgery(WSES)等协会颁布的最新指南中给予强推荐。
2.腹腔开放后的裸露创面保护措施存在不足
腹腔开放虽然治疗效果显著,但是早期阶段腹腔内脏器裸露尤其是肠管外露,如果保护不当,易出现肠EAF,将面临着巨大的医疗工作量,甚至导致治疗失败,成为外科医生的“噩梦”。
为了有效减少肠管损伤、降低EAF的发生率,临床上通常采用临时关腹措施(temporaryabdominal closure,TAC),主要分为三大类:皮肤关闭法、筋膜关闭法、负压辅助关腹法,有研究对比了三类TAC技术的效果、死亡率及EAF的发生率,发现皮肤关闭法早期筋膜关闭率为12.2-82%,死亡率为19-58.4%,EAF的发生率为0-14.4%;筋膜关闭法早期筋膜关闭率为18-93%,死亡率为7.7-43%,EAF的发生率为0-26%;负压辅助关腹法早期筋膜关闭率为31-100%,死亡率为14-44%,EAF的发生率为1.2-15%。现有的TAC措施仍无法避免较高比例的EAF的发生,从而增加腹腔开放后的并发症,在开腹创面直接应用海绵或者聚丙烯网片传导负压,缺乏保护肠管的材料,虽可在一定程度上促进肠管间肉芽组织生长,但不能恢复正常的肠管微循环血流量,最终仍然导致肠管破裂、EAF发生、创面迟迟不能愈合。项目组前期研究发现聚丙烯网片直接与肠管接触,也会磨损肠管浆膜层,引起炎症水肿,大量炎性细胞浸润,肌层断裂,进而形成微小穿孔,演变成EAF。
由于负压辅助技术的种种弊端,美国食品药品监督管理局(FDA)禁止将其直接用于裸露脏器,以防造成出血、肠瘘等并发症。在腹腔开放治疗领域,改进为在裸露肠管表面覆盖一层塑料或硅胶薄膜,以避免负压装置中的海绵与肠管直接接触,但由于其生物相容性差、透气性差、不可降解、无抗菌性能,仅能起到简单的物理保护,无法促进肠管肉芽组织增生以及创面的修复,EAF的发生率仍然居高不下,保护作用十分有限。负压辅助关腹法后仍无法避免EAF的发生。
因此寻找到一种类细胞外基质、生物相容性好、透气性佳、可降解、抗菌、促修复的新型生物材料,来加强对腹腔开放早期裸露肠管的保护和修复,降低EAF的发生率成为重中之重。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,开发可注射、自修复、可降解、抗感染、止血、药物缓释等功能于一体的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶。
本发明的另一目的是提供该用于腹腔开放创面保护的载药烷烃化壳聚糖多功能水凝胶的制备方法。
本发明的又一目的是提供烷烃化壳聚糖多功能水凝胶的应用。
本发明的上述目的可通过以下技术方案实现:
一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备烷烃化壳聚糖、四臂聚乙二醇苯甲醛;
(2)制备烷烃化壳聚糖溶液、四臂聚乙二醇苯甲醛溶液;
(3)烷烃化壳聚糖溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛溶液混合,室温下成胶即为所述的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶。
所述的制备烷烃化壳聚糖优选包括如下步骤:配制0.1-3%的壳聚糖醋酸溶液,加入月桂醛,及过量的氢基硼氢化钠,混合溶液pH调至4.5-6.0,室温搅拌12-48h,再滴加氢氧化钠调节pH到6.5-8.0,烷烃化壳聚糖析出,过滤沉淀,用浓度70%-100%的乙醇溶液梯度冲洗,产物冻干得烷烃化壳聚糖。月桂醛:壳聚糖摩尔比为0.01-1:1,氢基硼氢化钠:壳聚糖摩尔比为1-6:1
所述的制备四臂聚乙二醇苯甲醛的优选包括如下步骤:2-8g氨基化四臂聚乙二醇(Mw:10000-40000)和1-2g 4-对羧基苯甲醛溶解在100-200ml的四氢呋喃中,搅拌均匀;待完全溶解后,加入1-4g二环己基碳二亚胺和1-4gN-羟基琥珀酰亚胺,并将整个体系置于氮气保护环境中进行反应,室温搅拌反应24h后,过滤白色的沉淀物;将白色沉淀物在溶于四氢呋喃,过滤得沉淀,即为目标聚合物四臂聚乙二醇苯甲醛;用甲醇润洗产物三遍,随后再用乙醇润洗两遍,风干得最终产物。
作为本发明制备方法的一种优选方式,所述的烷烃化壳聚糖溶液的溶剂为浓度为1-3%醋酸溶液,烷烃化壳聚糖在溶液中的浓度为0.1-3g/100mL。
作为本发明制备方法的一种优选方式,所述的四臂聚乙二醇苯甲醛溶液的溶剂为水,浓度为1-40g/100mL。
作为本发明制备方法的一种优选方式,按照烷烃化壳聚糖:四臂聚乙二醇苯甲醛摩尔比为0.5-4:1的比例将烷烃化壳聚糖溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛溶液混合成胶。
作为本发明制备方法的另一种优选方式,所述的烷烃化壳聚糖为负载血管内皮生长因子的烷烃化壳聚糖。
所述的制备负载血管内皮生长因子的烷烃化壳聚糖优选包括如下步骤:将血管内皮生长因子按0.001-10mg/mL的剂量溶解于上述烷烃化壳聚糖溶液中。
按照本发明所述的方法制备得到的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶。
本发明所述的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶在制备腹腔开放创面保护材料中的应用。
有益效果:
将烷烃链修饰到壳聚糖的氨基上制备烷烃化壳聚糖,疏水的烷烃链与疏水性的细胞膜可通过疏水作用力相互固定,从而将血细胞固定在壳聚糖的长链上,凝结血液,快速止血,烷烃化壳聚糖上的氨基再与四臂聚乙二醇苯甲醛上苯甲醛基交联形成芳香族席夫碱,制备成功能更强、更稳定的自修复、可注射水凝胶。氨基与苯甲醛基具备极强的抗菌效果,同时,加入VEGF后,集成了VEGF促进血管再生,进而进一步促进创面修复的功能。制备出兼具浓缩血液止血、吸收渗液、自修复、可注射、抗菌、药物缓释、促进创面修复等功能于一体的多功能水凝胶。
自修复性能。芳香族席夫碱反应为动态可逆反应,分离或者破碎的胶块之间能够继续反应,自我修复,重新形成一块整胶,自修复性能延长水凝胶的使用寿命,提高使用效果方面。
1.可注射性能。水凝胶成胶后装入针管,从针头挤出,可注射性能可使多功能水凝胶突破传统水凝胶的使用限制,且可自动适应凹凸不平的创面表面,使用方式更多元化。
2.降解性能。壳聚糖以及聚乙二醇都是生物可降解材料,体内应用后不用取出,无异物残留。
3.细胞生物相容性好。壳聚糖和聚乙二醇本身都已经通过FDA的批准,生物相容性好。
4.抗菌性能。腹腔开放疗法常用于治疗严重腹腔感染患者,而且裸露肠管也容易继发感染,多功能水凝胶中烷烃化壳聚糖上的氨基、四臂聚乙二醇苯甲醛的苯甲醛基能直接杀伤细菌,对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌杀菌率近乎100%。
5.止血性能。烷烃化壳聚糖上的烷烃链可直接固定血液中细胞膜,凝结血液。而且水凝胶可吸收血液中的渗液,浓缩血液,具备超强止血能力。
附图说明
图1:制备烷烃化壳聚糖及四臂聚乙二醇苯甲醛。a:烷烃化壳聚糖合成示意图。b:四臂聚乙二醇苯甲醛合成示意图。c:核磁共振图谱(1H-NMR)证明烷烃化壳聚糖合成成功。d:核磁共振图谱(1H-NMR)证明四臂聚乙二醇苯甲醛合成成功。
图2烷烃化壳聚糖多功能水凝胶制备。a:多功能水凝胶制备原理示意图。b:烷烃化壳聚糖与四臂聚乙二醇苯甲醛溶液混合后,室温下形成多功能水凝胶。
图3多功能水凝胶可注射和自修复性能。a:多功能水凝胶成胶后装入针管,可通过23G针头挤出,重新固化塑形。b:水凝胶切开后重新组合,室温放置二十分钟后,自修复成整体。
图4多功能水凝胶体外止血、抗菌实验。a:多功能水凝胶止血示意图,直接固定细胞膜。b:多功能水凝胶直接凝固肝素化血液。c:抗菌原理示意图,氨基带正点及苯甲醛基可破坏细菌膜。d,e:水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果,接近100%。
图5多功能水凝胶体内止血实验。a:肝脏剪切后未用胶,大量出血。b:肝脏剪切后用多功能复合水凝胶,无出血。
图6多功能水凝胶促进腹腔开放创面肉芽再生。a:多功能水凝胶载生长因子能促进肉芽组织再生,肉芽组织更厚。b:多功能水凝胶促进肉芽组织内血管再生。c-d:肉芽组织厚度及血管定量分析。
具体实施方式
以下结合附图,对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备合成烷烃化壳聚糖:首先准备1g壳聚糖(Mw:4×105)溶解于50mL 0.2M醋酸溶液,再加入月桂醛:烷烃化壳聚糖摩尔比为0.05:1的月桂醛及氢基硼氢化钠:烷烃化壳聚糖摩尔比为3:1的氢基硼氢化钠,混合溶液pH调至5.01,室温搅拌18h,再滴加氢氧化钠调节pH到7.0,烷烃化壳聚糖析出,沉淀过滤,用浓度70%-100%的乙醇溶液梯度冲洗,产物冻干。
(2)制备四臂聚乙二醇苯甲醛:0.978g氨基化四臂聚乙二醇(Mw:20000)和0.978g4-对羧基苯甲醛溶解在100ml的四氢呋喃中,搅拌均匀。待完全溶解后,加入1.68g二环己基碳二亚胺和1.93g N-羟基琥珀酰亚胺,并将整个体系置于氮气保护环境中进行反应。室温搅拌反应24h后,过滤白色的沉淀物。将白色沉淀物在溶于四氢呋喃,过滤得沉淀,即为目标聚合物。用甲醇润洗产物三遍,随后再用乙醇润洗两遍,风干得最终产物四臂聚乙二醇苯甲醛。
(3)制备烷烃化壳聚糖溶液:将1g烷烃化壳聚糖溶解于100mL 2%醋酸溶液,制备烷烃化壳聚糖溶液;制备四臂聚乙二醇苯甲醛溶液:将2g四臂聚乙二醇苯甲醛溶解于10mL纯水中制备烷烃化壳聚糖溶液。
(4)烷烃化壳聚糖溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛溶液按照烷烃化壳聚糖与四臂聚乙二醇苯甲醛的摩尔比2:1混合,室温下成胶即为所述的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶。
(5)多功能水凝胶自修复性能测试:将水凝胶在蝴蝶模具中成胶,制作成两个等大的蝴蝶,分别用台盼蓝染成蓝色和罗丹明B染成红色,用刀各自切成等大的两份,不同颜色拼接成两个颜色相间的蝴蝶,2h后,用镊子夹住一角提起。结果如图3a所示。
(6)多功能水凝胶可注射性能测试取1mL水凝胶胶块,挤压进2.5ml注射器,注射器接25G针头,推动注射器后,水凝胶从针头挤出,盘旋成圆盘,2h后观察是否重新愈合成整体,尝试用镊子提起。结果如图3b所示。
(7)多功能水凝胶抗菌性能测试:采用两种常见致病菌革兰氏阳性金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus(ATCC25923)和革兰氏阴性大肠杆菌Escherichia coli(ATCC25922)作为测试菌种,采用琼脂平皿扩散法测试表征抗菌纳米水凝胶的抗菌效果。称取200mg多功能水凝胶放入105CFU/mL(每毫升所形成的菌落单位)的细菌溶液试管中,37℃条件下在LB培养基中振荡培养。培养4、24和48小时后分别使用移液器取100μL培养基在营养琼脂平板上划板。琼脂培养基在37℃条件下过夜培养。计数培养皿上细菌的菌落并用CFU/mL来表示。结果如图4c-e所示。
(8)多功能水凝胶体外止血测试:取0.5ml加肝素钠的新鲜大鼠血液,向血液中加入0.5ml多功能水凝胶,20s后倒置,看血液是否凝固。结果如图4a、b所示。
(9)多功能水凝胶体内止血性能测试:6只250g左右8-12周龄SD大鼠,分为空白对照组及H-MOFs组,10%水合氯醛麻醉,固定在解剖台上,暴露肝脏,手术剪剪断肝脏下段,喷涂0.5mlH-MOFs,称重计算出血量。结果如图5所示。
(10)多功能水凝胶载VEGF促进腹腔开放创面愈合效果测试:所有的实验大鼠术前均禁食一晚,常规测体重后,通过腹腔注射***(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)混合溶液进行麻醉。成功麻醉后,取仰卧位将大鼠四肢固定于手术板上,全腹部备皮,然后用医用碘伏消毒手术野三遍,再用75%医用酒精擦洗一遍,随后铺上无菌单。在大鼠中腹部去除2×4cm全层腹壁构建腹壁缺损。随后,实验动物被随机分为三组:PBS对照组,多功能水凝胶组和搭载VEGF的多功能水凝胶组(1.5mg VEGF/ml水凝胶),每组8只大鼠。对于水凝胶组,1ml的胶体通过注射器(23号针头)注射到缺损部位,PBS组注射1mlPBS作为对照。随后,三组均用聚丙烯网片暂时性关闭腹腔,缺损边缘用4-0的线间断缝合10针。所有实验动物术后均单笼饲养,自由取食水。术后第7天,取腹壁缺损部位肉芽组织标本。用4%中性***固定,后续作组织学分析和免疫组化染色。结果如图6所示。
Claims (10)
1.一种烷烃化壳聚糖多功能水凝胶的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)制备烷烃化壳聚糖溶液、四臂聚乙二醇苯甲醛溶液;
(2)烷烃化壳聚糖溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛溶液混合,室温下成胶即为所述的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的烷烃化壳聚糖主要通过如下步骤制备:配制0.1-3%的壳聚糖醋酸溶液,加入月桂醛,及过量的氢基硼氢化钠,混合溶液pH调至4.5-6.0,室温搅拌12-48h,再滴加氢氧化钠调节pH到6.5-8.0,烷烃化壳聚糖析出,过滤沉淀,用浓度70%-100%的乙醇溶液梯度冲洗,产物冻干得烷烃化壳聚糖。月桂醛:壳聚糖摩尔比为0.01-1:1,氢基硼氢化钠:壳聚糖摩尔比为1-6:1。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(1)所述的烷烃化壳聚糖溶液的溶剂为浓度为1-3%醋酸溶液,烷烃化壳聚糖在溶液中的浓度为0.1-3g/100mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的四臂聚乙二醇苯甲醛的主要通过如下步骤制备:2-8g氨基化四臂聚乙二醇和1-2g 4-对羧基苯甲醛溶解在100-200ml的四氢呋喃中,搅拌均匀;待完全溶解后,加入1-4g二环己基碳二亚胺和1-4gN-羟基琥珀酰亚胺,并将整个体系置于氮气保护环境中进行反应,室温搅拌反应24h后,过滤白色的沉淀物;将白色沉淀物在溶于四氢呋喃,过滤得沉淀,即为目标聚合物四臂聚乙二醇苯甲醛;用甲醇润洗产物三遍,随后再用乙醇润洗两遍,风干得最终产物。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于步骤(1)所述的四臂聚乙二醇苯甲醛溶液的溶剂为水,浓度为1-40g/100mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(2)按照烷烃化壳聚糖:四臂聚乙二醇苯甲醛摩尔比为0.5-4:1的比例将烷烃化壳聚糖溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛溶液混合成胶。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的烷烃化壳聚糖为负载血管内皮生长因子的烷烃化壳聚糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于将血管内皮生长因子按0.001-10mg/mL的剂量溶解于烷烃化壳聚糖溶液中制备得到负载血管内皮生长因子的烷烃化壳聚糖。
9.按照权利要求1~8中所述的方法制备得到的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶。
10.权利要求9所述的烷烃化壳聚糖多功能水凝胶在制备腹腔开放创面保护材料中的应用。
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