CN109856214B - 可放大电化学信号的电极修饰方法及其应用 - Google Patents
可放大电化学信号的电极修饰方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可放大电化学信号的电极修饰方法，包括：将miRNA‑21适配体溶液滴加到金电极表面，冲洗吹干；滴加巯基乙醇溶液，冲洗吹干；浸泡于信号促进液中，冲洗吹干；滴加亚甲基蓝，冲洗吹干，即得修饰电极；其中，信号促进液的制备方法为：将羧基化氧化石墨烯、铝钛合金、多颗磁珠加入到乙酸水溶液中，超声处理后，置于低压环境中，并同时通入H2和O2，取滤液干燥得粉末，粉末的饱和溶液为促进液。公开一种修饰电极检测miRNA‑21溶液的浓度的方法。本发明具有放大电化学信号，以提高检测灵敏度的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域。更具体地说，本发明涉及一种可放大电化学信号的电极修饰方法及其应用。
背景技术
电化学适配体传感器是指利用高特异性的核酸适配体作为识别元件，通过SELEX技术筛选出所需要的适配体。适配体能特异性结合多种类型的目标物，无论是大分子还是生物小分子。鉴于适配体具有特异性高、合成简单、成本低、易于末端修饰、作用范围广等众多优点，所以越来越多的电化学传感器以适配体作为识别元件。目前电化学适配体传感器已成功应用于食品安全、临床诊断、环境保护方面。然而电化学适配体传感器灵敏度较低，基于纳米材料的信号放大还需进一步研究。
纳米材料的采用能够有助于提高生物传感器的灵敏度，鉴于纳米材料结构层次的特殊性，生物相容性，较强的导电性及吸附能力，优异的定向性能，可以大大地提高生物识别分子的固载量，标记生物识别分子，催化反应，加快生物分子与电极表面的电子传递速率而实现对检测电流信号的放大，因此纳米粒子在化学工业、生命科学、环境保护等方面将都会有广阔的应用前景。碳元素是自然界中与人类最为密切相关的重要元素之一，其中石墨烯是指以sp2杂化轨道的碳原子之间组成六角型的二维蜂巢晶格平面薄膜。这种单层片状的纳米结构决定了它具有良好的生物及结构相容性，极高的电子传递速率，易于表面修饰。它不仅能和其它的纳米材料或者光电活性材料相结合形成纳米复合材料，而且也可以与部分生物识别分子结合。所以，近年来，石墨烯逐渐被用于负载基质，或者生物标记物，在生物传感平台中具有相当重要的使用价值。其次，石墨烯不仅作为基质固定生物识别分子，也能够作为标记物催化相应物质放大检测电流信号。基于表面具有大量功能性基团逐渐成为科研者十分关注的一种免疫标记催化物质，应用于设计生物传感器信号放大模式。
针对以上问题，我们研究了可以放大电化学信号的方法，该方法操作简单、有助于将电化学信号放大，从而提高检测准确率和扩大检测限。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种可放大电化学信号的电极修饰方法，在交流阻抗法和差分脉冲伏安法中的电化学信号均可显著放大，提供一种应用该电极修饰方法修饰得到的修饰电极检测miRNA-21的浓度的方法，可以提高miRNA-21的检测准确率和扩大其检测限。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种可放大电化学信号的电极修饰方法，包括以下步骤：
a、将浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液滴加到金电极表面，置于4℃环境中12h后，用PH为6.8的的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
b、将浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤a中的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中1h后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
c、将步骤b中的金电极表面浸泡于信号促进液中，于80℃下静置6h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，再用氮气吹干；
其中，信号促进液的制备方法为：将羧基化氧化石墨烯、铝钛合金、多颗磁珠加入到浓度为25mM的乙酸水溶液中，得到混合液，将混合液置于超声频率为60KHz下超声处理1h后，置于真空度为500Pa的环境中，并同时向混合液中每隔10min通入H2和O2 2min，一共处理4h，H2和O2流量均为2L/min，过滤去除滤渣，干燥得到粉末，将粉末加入到超纯水中，并于超声频率为100KHz下超声处理1h，得到粉末的饱和溶液，即为促进液；
d、将浓度为1mM的亚甲基蓝滴加到步骤c中的金电极表面，置于4℃环境中100min后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干，即得修饰电极。
优选的是，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：
将金电极置于KH2PO4浓度为3μM、KCl浓度为5μM的超纯水溶液中，且温度为65℃下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，且温度为80℃下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。
优选的是，羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。
电极修饰方法制备的修饰电极在检测miRNA-21溶液的浓度的应用。
提供一种电极修饰方法制备的修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法，包括：
步骤一、按照步骤a至步骤d制备多个修饰电极，分别向多个修饰电极表面滴加不同浓度的miRNA-21溶液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用氮气吹干，得到多个检测电极；
步骤二、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤一的检测电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；
步骤三、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液的浓度与阻抗值的线性关系；
步骤四、按照步骤a至步骤d制备多个修饰电极，向该修饰电极表面滴加10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用氮气吹干，得到多个检测电极；
步骤五、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤四中的检测电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤三中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。
优选的是，miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为：5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。
优选的是，步骤一中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10-12mol/L、5×10-12mol/L、1×10-11mol/L、2×10-11mol/L，向修饰电极表面滴加的miRNA-21溶液的体积为10μL。
优选的是，步骤二和步骤五中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)6 4-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol。
本发明至少包括以下有益效果：可以放大电化学信号，以提高miRNA-21的检测准确率和扩大其检测限。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为5种电极的电化学响应的交流阻抗曲线图；
图2为3种电极的电化学响应的差分脉冲伏安曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
可放大电化学信号的电极修饰方法，包括以下步骤：
a、将浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液滴加到金电极表面，置于4℃环境中12h后，用PH为6.8的的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
b、将浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤a中的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中1h后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
c、将步骤b中的金电极表面浸泡于信号促进液中，于80℃下静置6h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，再用氮气吹干；
其中，信号促进液的制备方法为：将羧基化氧化石墨烯、铝钛合金、多颗磁珠加入到浓度为25mM的乙酸水溶液中，得到混合液，将混合液置于超声频率为60KHz下超声处理1h后，置于真空度为500Pa的环境中，并同时向混合液中每隔10min通入H2和O2 2min，一共处理4h，H2和O2流量均为2L/min，过滤去除滤渣，干燥得到粉末，将粉末加入到超纯水中，并于超声频率为100KHz下超声处理1h，得到粉末的饱和溶液，即为促进液；
d、将浓度为1mM的亚甲基蓝滴加到步骤c中的金电极表面，置于4℃环境中100min后，用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干，即得修饰电极。
其中，羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。
miRNA-21适配体溶液是以TE缓冲液为溶剂，TE缓冲液为10mM Tris–HCl，包含1mMEDTA，PH为7.4。<实施例2>
可放大电化学信号的电极修饰方法同实施例1，其中，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：
将金电极置于KH2PO4浓度为3μM、KCl浓度为5μM的超纯水溶液中，且温度为65℃下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，且温度为80℃下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。
<实施例3>
应用实施例1的方法制备的修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法，包括：
步骤一、按照步骤a至步骤d制备多个修饰电极，分别向多个修饰电极表面滴加不同浓度的miRNA-21溶液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用氮气吹干，得到多个检测电极；
步骤二、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤一的修饰电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；
步骤三、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液的浓度与阻抗值的线性关系；
步骤四、按照步骤a至步骤d制备多个修饰电极，向该修饰电极表面滴加10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用氮气吹干，得到多个检测电极；
步骤五、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤四中的金电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤三中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。
miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为：5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。
步骤一中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10-12mol/L、5×10-12mol/L、1×10-11mol/L、2×10-11mol/L，向修饰电极表面滴加的miRNA-21溶液的体积为10μL。
步骤二和步骤五中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)6 4-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol。
<对比例1>
应用实施例1的方法制备的修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法同实施例3，其中，步骤d中的促进液采用羧基化氧化石墨烯饱和溶液代替，羧基化氧化石墨烯饱和溶液的制备方法具体为：将羧基化氧化石墨烯加入超纯水中，于超声频率为100KHz超声处理50min，得到羧基化氧化石墨烯饱和溶液。
<金电极电化学信号试验>
1、采用交流阻抗法测试各金电极，如图1所示，为裸金电极，及按实施例1中的步骤a、b、c、d制备的4个金电极，一共5个金电极，采用交流阻抗法扫描得到对应的多个交流阻抗曲线图，分别一一对应图1中的a、b、c、d、e 5条交流阻抗曲线；
由图1可以看出，通过与a曲线对比，不同物质修饰后的电极得到的阻值不一样，表明材料都成功修饰到电极表面，比较e曲线和a曲线，说明采用促进液修饰后的金电极可以显著放大电化学信号；
比较e曲线和d曲线，说明经过步骤a至d的修饰后，可以电化学信号得到放大的同时，稳定性也得以提高。
2、采用差分脉冲伏安法测试各金电极，如图2所示，曲线c对应对比例1中步骤a至d制备的修饰电极，曲线b对应实施例1中步骤a至步骤c制备的修饰电极，曲线a对应实施例1中步骤a至d制备的修饰电极，从图2可得知采用促进液和亚甲基蓝相结合修饰的电极具有更好的电化学响应，得到更大的电流强度。可以说放大电化学信号。
3、采用实施例3和对比例1的方法检测得到的miRNA-21溶液的浓度与阻抗值的线性关系的R2分别为0.9999和0.9722，说明实施例3的方法中修饰电极所引起的电化学信号更加稳定，可以提高检测的准确性。
4、采用实施例3和对比例1的方法，检测miRNA-2浓度为1×10-14mol/L、1×10- 13mol/L、1×10-12mol/L、1×10-11mol/L、1×10-10mol/L的miRNA-21溶液，计算得到的miRNA-21溶液中miRNA-21的浓度，如表1所示：
表1
| 组别 | 1×10<sup>-14</sup> | 1×10<sup>-13</sup> | 1×10<sup>-12</sup> | 1×10<sup>-11</sup> | 1×10<sup>-10</sup> |
| 实施例1 | - | 0.95×10<sup>-13</sup> | 0.99×10<sup>-12</sup> | 1.00×10<sup>-11</sup> | 1.00×10<sup>-10</sup> |
| 对比例1 | - | - | 0.87×10<sup>-12</sup> | 0.90×10<sup>-11</sup> | 0.88×10<sup>-10</sup> |
从表1中可以看出，实施例3可以精确检测出miRNA-21浓度低至为1×10-13的限值，高至1×10-10的限值，对比例1无法检出，且实施例3的同一浓度的检测准确度均比对比例1中的高，说明实施例1制备的活化电极有助于提高检测准确率和扩大检测限。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西师范学院
<120> 可放大电化学信号的电极修饰方法及其应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcaacatcag tctgataagc tattt 25
Claims (6)
1.应用修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法，其特征在于，电极修饰方法包括以下步骤：
a、将浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液滴加到金电极表面，置于4℃环境中12h后，用pH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
b、将浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤a中的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中1h后，用pH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；
c、将步骤b中的金电极表面浸泡于信号促进液中，于80℃下静置6h，再用pH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，再用氮气吹干；
其中，信号促进液的制备方法为：将羧基化氧化石墨烯、铝钛合金、多颗磁珠加入到浓度为25mM的乙酸水溶液中，得到混合液，将混合液置于超声频率为60KHz下超声处理1h后，置于真空度为500Pa的环境中，并同时向混合液中每隔10min通入H2和O2 2min，一共处理4h，H2和O2流量均为2L/min，过滤去除滤渣，干燥得到粉末，将粉末加入到超纯水中，并于超声频率为100KHz下超声处理1h，得到粉末的饱和溶液，即为促进液；
d、将浓度为1mM的亚甲基蓝滴加到步骤c中的金电极表面，置于4℃环境中100min后，用pH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干，即得修饰电极；
应用修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法，包括：
步骤一、按照步骤a至步骤d制备多个修饰电极，分别向多个修饰电极表面滴加不同浓度的miRNA-21溶液，置于37℃环境中60min，再用pH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用氮气吹干，得到多个检测电极；
步骤二、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤一的检测电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；
步骤三、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液的浓度与阻抗值的线性关系；
步骤四、按照步骤a至步骤d制备多个修饰电极，向该修饰电极表面滴加10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液，置于37℃环境中60min，再用pH为6.8的PBS溶液冲洗50s，用氮气吹干，得到多个检测电极；
步骤五、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤四中的检测电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤三中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。
2.如权利要求1所述的应用修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法，其特征在于，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：
将金电极置于KH2PO4浓度为3μM、KCl浓度为5μM的超纯水溶液中，且温度为65℃下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，且温度为80℃下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。
3.如权利要求1所述的应用修饰电极检测miRNA-21溶液的浓度的方法，其特征在于，羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。
4.如权利要求1所述的检测miRNA-21溶液的浓度的方法，其特征在于，miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为：5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。
5.如权利要求1所述的检测miRNA-21溶液的浓度的方法，其特征在于，步骤一中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10-12mol/L、5×10-12mol/L、1×10-11mol/L、2×10- 11mol/L，向修饰电极表面滴加的miRNA-21溶液的体积为10μL。
6.如权利要求1所述的检测miRNA-21溶液的浓度的方法，其特征在于，步骤二和步骤五中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)6 4-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol。
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