CN105021680A - 基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,包括:制备以石墨烯为沟道的石墨烯场效应晶体管,作为石墨烯传感器;根据待测的MicroRNA序列,对石墨烯进行表面改性,将能与待测的MicroRNA相结合的DNA探针结合到石墨烯表面的官能团上;将石墨烯表面未与DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来;利用改性过的石墨烯场传感器对待测的MicroRNA进行检测,通过石墨烯上的DNA探针与待测的MicroRNA结合前后的电流信号的差异来检测出待测MicroRNA;本发明无需进行标记就可以实现对MicroRNA的检测;并且,检测的灵敏度较高,制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。
Description
技术领域
本发明涉及生物学技术领域,具体涉及一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法。
背景技术
微小RNA(microRNAs,miRNA)是一类长约为17-25nt,高度保守的单链非编码RNA。miRNA通过与mRNA的3’非翻译区(3’UTR)或编码区(CDS)的结合降解或抑制mRNA,主要在转录后水平调控基因表达。自从1993年第一个microRNA被揭示以来,已经有超过30000种miRNA被发现,诸多研究已经表明,miRNA参与了不同的生理和病理过程,例如的细胞的分化、增殖和凋亡,肿瘤发生等。高达30%的人类基因被miRNA调节,miRNA含量的异常会引起心血管疾病、癌症等疾病。长期以来研究者都是从调控因子和生物标记物两方面对miRNA进行研究,迄今已经有上万篇的论文报道了miRNA在分子和临床研究中的作用。尽管miRNA作为潜在分子标记物的研究仍处于探索期,但已经有研究对该方面进行了报道,并证明miRNA含量的异常与癌症、心血管疾病、神经性和代谢性疾病、免疫反应等相关,同时也达成了共识:miRNA作为潜在的生物标记物对于临床诊断和预后具有重要意义。
目前miRNA检测的技术基本分为两类:一类是以扩增为基础的(amplification-based),即逆转录后进行PCR扩增来检测,主要有qPCR和酶联荧光miRNA检测法;另一类是以杂交为基础的(hybridization-based),即通过互补序列的探针与待测的miRNA杂交来检测,包括Northern blotting,ISH和Microarray。现有的这两类技术包含的扩增或标记过程中操作较复杂、耗时较长、对反应体系要求较高.
2014年,英国曼彻斯特大学的Andre Geim教授与Kostya Novaselov博士采用一种简单的微机械剥离法制备了一种单原子厚度的碳膜,即石墨烯薄膜,并因此获得2010年的诺贝尔物理奖,受到了全世界研究人员的关注.
石墨烯(Graphene)是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的一种碳质新材料,是构建其它维度碳质新材料(如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨)的基本单元。作为一种新型的二维碳纳米材料,石墨烯以其独特而优异的电学、热学、力学等方面的性能而成为目前研究的热点。由于石墨烯独特的二维结构,石墨烯具有表面活性高、比表面积大、电子迁移率高、与生物分子相容性好等特点。
因此,如果能够将石墨烯的上述特点应用于检测MicroRNA中,将提高检测的响应速度、选择准确度和灵敏度。
发明内容
为了克服以上问题,本发明旨在提供一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,能够快速灵敏的检测MicroRNA。
本发明提供了一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其包括:
步骤01:制备以石墨烯为沟道的石墨烯场效应晶体管,作为石墨烯传感器;
步骤02:根据待测的MicroRNA序列,对所述石墨烯进行表面改性,将能与所述待测的MicroRNA相结合的DNA探针结合到所述石墨烯表面的官能团上;
步骤03:将所述石墨烯表面未与所述DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来;
步骤04:利用改性过的所述石墨烯场传感器对所述待测的MicroRNA进行检测,通过所述石墨烯上的所述DNA探针与所述待测的MicroRNA结合前后的电流信号的差异来检测出所述待测的MicroRNA。
优选地,所述步骤02包括:
步骤021:将所述石墨烯场传感器浸入N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液,于室温下反应,通过π堆叠效应,N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸自组装到所述石墨烯表面的官能团上;
步骤022:采用甲醇和去离子水冲洗所述石墨烯传感器;
步骤023:再将所述石墨烯传感器浸入溶解有末端修饰氨基的所述DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液中,于室温下反应,所述DNA探针末端的氨基与所述N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸发生化学反应,形成酰胺键,从而把所述DNA探针结合到所述石墨烯表面;
步骤024:用去离子水冲洗所述石墨烯传感器。
优选地,所述步骤021中,所述N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液的浓度为4.5~5.5mM,所述于室温下反应所采用的反应时间为1.5~2.5小时;
所述步骤023中,所述溶解有末端修饰氨基的所述DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液的浓度为90~110nM,所述于室温下反应所采用的反应时间为11~13小时。
优选地,所述步骤03中,采用乙醇胺将所述石墨烯表面未与所述DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来。
优选地,所述乙醇胺的浓度为0.05~0.15M。
优选地,所述步骤04包括:
步骤041:测试得到未与所述待测的MicroRNA相结合的所述改性过的所述石墨烯传感器的第一电流信号;
步骤042:将所述改性过的所述石墨烯传感器浸入待测的MicroRNA样本中,于室温下反应;
步骤043:用去离子水冲洗所述改性过的所述石墨烯传感器,并自然干燥;
步骤044:测试得到完成所述步骤042之后的所述改性过的所述石墨烯传感器的第二电流信号;
步骤045:通过比较得到所述第一电流信号和所述第二电流信号存在的差异,从而探测出所述待测的MicroRNA。
优选地,所述步骤01包括:
步骤011:制备出石墨烯薄膜;
步骤012:将所述石墨烯薄膜转移至硅衬底上;
步骤013:在所述石墨烯上形成源极、漏极、栅极以及所述源极和所述漏极之间的导电沟道,所述导电沟道为部分所述石墨烯薄膜。
优选地,所述步骤011包括:以铜箔为衬底,采用甲烷为碳源前驱体,在常压下采用化学气相沉积法制备出所述石墨烯薄膜。
优选地,所述步骤012包括:利用PMMA高分子膜作为载体,在所述已生长了所述石墨烯薄膜的所述铜箔上旋涂PMMA胶体;然后,进行烘烤,使所述PMMA胶体与所述石墨烯薄膜牢固结合,同时所述PMMA胶体中的有机溶剂挥发掉,从而在所述铜箔上形成均匀的PMMA膜;接着,采用化学腐蚀法将所述铜箔腐蚀掉,并将载有所述石墨烯薄膜的所述PMMA膜转移至所述硅衬底上;通过烘烤,使所述石墨烯薄膜与所述硅衬底紧密接触;最后,采用热丙酮去除所述PMMA膜,得到位于所述硅衬底上的所述石墨烯薄膜。
优选地,所述步骤013包括:
步骤0131:在所述石墨烯薄膜上形成金属对准标记;
步骤0132:利用所述金属对准标记,经光刻和刻蚀工艺,使所述石墨烯薄膜形成带状石墨烯,所述带状石墨烯作为所述导电沟道;
步骤0133:利用所述金属对准标记,在所述带状石墨烯上形成所述源极、所述漏极和所述栅极。
本发明的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,将MicroRNA通过连接分子自组装在石墨烯表面,无需进行标记就可以实现对MicroRNA的检测;并且,石墨烯传感器对MicroRNA的检测的灵敏度较高,制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。
附图说明
图1为本发明的一个较佳实施例的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法的流程示意图
图2为本发明的一个较佳实施例的对石墨烯进行改性过程的流程示意图、
图3为本发明的一个较佳实施例的利用改性过的石墨烯传感器对待测的MicroRNA进行检测过程的流程示意图
具体实施方式
为使本发明的内容更加清楚易懂,以下结合说明书附图,对本发明的内容作进一步说明。当然本发明并不局限于该具体实施例,本领域内的技术人员所熟知的一般替换也涵盖在本发明的保护范围内。
以下结合附图1-3和具体实施例对本发明的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法作进一步详细说明。其中,图1为本发明的一个较佳实施例的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法的流程示意图,图2为本发明的一个较佳实施例的对石墨烯进行改性过程的流程示意图,图3为本发明的一个较佳实施例的利用改性过的石墨烯传感器对待测的MicroRNA进行检测过程的流程示意图。需说明的是,附图均采用非常简化的形式、使用非精准的比例,且仅用以方便、清晰地达到辅助说明本实施例的目的。
请参阅图1,本实施例中,基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,,包括:
步骤01:制备以石墨烯为沟道的石墨烯场效应晶体管,作为石墨烯传感器;
具体的,该步骤01包括:
步骤011:制备出石墨烯薄膜;
这里,以铜箔为衬底,采用甲烷为碳源前驱体,在常压下采用化学气相沉积法制备出石墨烯薄膜。举例来说,该步骤011可以但不限于为以下过程:
将铜箔清洗后放入石英管腔体中,通入30sccm的H2流量,保持腔内压强约80pa,将腔体温度升至1000℃进行退火处理20min,通入5sccm的CH4开始在铜箔表面生长石墨烯,生长时间为20min,在生长过程完成后,在保持CH4与H2流量不变情况下进行快速降温,直至腔体内温度降至室温。
步骤012:将石墨烯薄膜转移至硅衬底上;
具体的,利用PMMA高分子膜作为载体,在已生长了石墨烯薄膜的铜箔上旋涂PMMA胶体;然后,进行烘烤,使PMMA胶体与石墨烯薄膜牢固结合,同时PMMA胶体中的有机溶剂挥发掉,从而在铜箔上形成均匀的PMMA膜;接着,采用化学腐蚀法将铜箔腐蚀掉,并将载有石墨烯薄膜的PMMA膜转移至硅衬底上;通过烘烤,使所述石墨烯薄膜与硅衬底紧密接触;最后,采用热丙酮去除PMMA膜,得到位于硅衬底上的石墨烯薄膜。
举例来说,该步骤012可以但不限于为以下过程:在已生长石墨烯的铜箔上旋涂PMMA有机胶体,在热板上于50℃烘烤10min,使PMMA胶体与石墨烯薄膜结合紧密并使胶体中有机溶剂挥发,形成均匀的胶膜,然后将烘烤完的铜箔置于5wt%的硝酸铁溶液中,对铜箔进行腐蚀,待铜箔腐蚀完后,将载有石墨烯的PMMA胶膜转移至去离子水中清洗10次,用SiO2/Si基片将其打捞起来,在热板上于50℃下烘烤,直至水干,继续升温至100℃下烘烤10min,然后在180℃下烘烤10min,使石墨烯与SiO2/Si基片紧密接触,最后将基片放置于热丙酮中去除PMMA胶体,得到位于SiO2/Si基片表面的石墨烯薄膜。
步骤013:在石墨烯上形成源极、漏极、栅极以及源极和漏极之间的导电沟道,导电沟道为部分石墨烯薄膜。
具体的,包括:
步骤0131:在石墨烯薄膜上形成金属对准标记;
这里,首先,在石墨烯薄膜上涂覆光刻胶;
其次,经光刻工艺,在光刻胶中形成对准标记图案;
然后,在对准标记图案中蒸镀沉积金属;
接着,经剥离工艺,去除光刻胶和多余的金属,从而在石墨烯薄膜上形成金属对准标记。
举例来说,该步骤0131可以但不限于为以下过程:在石墨烯薄膜上旋涂AZ SLD2530光刻胶,转速3000rpm,旋涂30s后放在热板上110℃烘烤90s,使光刻胶中的有机溶剂充分挥发,利用紫外曝光把对准标记图案刻写在光刻胶中,用AZ 300MIF显影液显影60s,得到对准标记图案,接着利用电子束蒸发设备依次蒸镀厚度为1-50nm(如5nm)Ti层、10-100nm(如30nm)Au层,通过剥离工艺,采用丙酮轻微超声处理去除光刻胶和多余的金属,即可在石墨烯薄膜上留下蒸镀的金属对准标记。
步骤0132:利用金属对准标记,经光刻和刻蚀工艺,使石墨烯薄膜形成带状石墨烯,带状石墨烯作为导电沟道;
这里,举例来说,该步骤0132可以但不限于为以下过程:在得到的有金属对准标记的石墨烯薄膜上旋涂AZ SLD2530光刻胶,转速3000rpm,旋涂30s后放在热板上110℃烘烤90s,通过金属对准标记定位,紫外曝光,留下条带状的光刻胶,以条带状的光刻胶为掩膜对所需要的石墨烯薄膜进行保护,其余部分用AZ 300MIF显影液进行显影,用氧等离子体刻蚀掉光刻胶未保护的部分石墨烯薄膜,刻蚀完成后使用丙酮和酒精去除光刻胶,用氮气吹干,得到带状石墨烯,作为源极、漏极之间的导电沟道。这里需要说明的是,在硅衬底上可以含有多条带状石墨烯。
步骤0133:利用金属对准标记,在带状石墨烯上形成源极、漏极和栅极。
这里,举例来说,利用金属对准标记,在对栅极进行制备的光刻工艺中,用于定位带状石墨烯;栅极的制备可以包括以下过程:经光刻工艺,利用金属对准标记定位带状石墨烯,在带状石墨烯上的光刻胶中形成栅极图案;在栅极图案中沉积金属;去除光刻胶和多余金属;该步骤0133中源极和漏极的制备可以但不限于为以下过程:在整个硅衬底上旋涂AZ SLD2530光刻胶,转速3000rpm,旋涂30s后放在热板上110℃烘烤90s,通过金属对准标记对带状石墨烯进行定位,利用紫外曝光把源、漏极图案刻写在带状石墨烯上的光刻胶中,用AZ 300MIF显影液显影60s,得到源、漏电极图案;源极和漏极之间的间距为1-100μm,接着利用电子束蒸发设备在源极图案和漏极图案中依次蒸镀厚度为1-50nm(如10nm)Ti层、10-100nm(如100nm)Au层作为器件的源极和漏极;最后,采用剥离工艺,将硅片放进丙酮,轻微超声处理去除光刻胶和多余的金属,即可得到石墨烯晶体管。
步骤02:根据待测的MicroRNA序列,对石墨烯进行表面改性,将能与待测的MicroRNA相结合的DNA探针结合到石墨烯表面的官能团上;
具体的,请参阅图2,包括:
步骤021:将石墨烯传感器浸入N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液,于室温下反应,通过π堆叠效应,N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸自组装到石墨烯表面的官能团上;N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液的浓度为4.5~5.5mM,反应时间为1.5~2.5小时;
步骤022:采用甲醇和去离子水冲洗石墨烯传感器;
步骤023:再将石墨烯传感器浸入溶解有末端修饰氨基的DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液中,于室温下反应,DNA探针末端的氨基与N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸发生化学反应,形成酰胺键,从而把DNA探针结合到石墨烯表面;溶解有末端修饰氨基的DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液的浓度为90~110nM,反应时间为11~13小时。
步骤024:用去离子水冲洗石墨烯传感器。
举例来说,该步骤02可以但不限于包括以下过程:将步骤01所制备的石墨烯传感器浸入5mM N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液室温下反应2h,通过π堆积(π-stacking)效应自组装到石墨烯表面,用甲醇和去离子水冲洗石墨烯传感器3次后,再浸入溶解有100nM末端修饰氨基的DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液中,在室温反应12h后,再用去离子水冲洗3次,最后用0.1M乙醇胺封阻石墨烯表面多余的官能团。
步骤03:将石墨烯表面未与DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来;
具体的,采用乙醇胺将石墨烯表面未与DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来;乙醇胺的浓度为0.05~0.15M。例如,根据待测的MicroRNA序列,合成一条检测用的3’端修饰有氨基的let-7b探针,探针序列为:5’-AACCACACAACCTACTACCTCA-3’。
步骤04:利用改性过的石墨烯传感器对待测的MicroRNA进行检测,通过石墨烯上的DNA探针与待测的MicroRNA结合前后的电流信号的差异来检测出待测的MicroRNA。
具体的,请参阅图3,包括:
步骤041:测试得到未与待测的MicroRNA相结合的改性过的石墨烯传感器的第一电流信号;
步骤042:将改性过的石墨烯传感器浸入待测的MicroRNA样本中,于室温下反应;
步骤043:用去离子水冲洗改性过的石墨烯传感器,并自然干燥;
步骤044:测试得到完成步骤042之后的改性过的石墨烯传感器的第二电流信号;
步骤045:通过比较得到第一电流信号和第二电流信号存在的差异,从而探测出待测的MicroRNA。
这里,举例来说,该步骤04可以但不限于包括以下过程:将步骤03中经表面改性后的石墨烯传感器浸入待检测的MicroRNA样本中,室温下反应1h,去离子水冲洗,自然干燥后,用Cascade探针台和安捷伦半导体精密测试仪检测,通过探针结合前后,石墨烯场效应晶体管电流信号的差异来实现对MicroRNA的检测。
综上所述,本发明的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,将MicroRNA通过连接分子自组装在石墨烯表面,无需进行标记就可以实现对MicroRNA的检测;并且,石墨烯传感器对MicroRNA的检测的灵敏度较高,制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然所述实施例仅为了便于说明而举例而已,并非用以限定本发明,本领域的技术人员在不脱离本发明精神和范围的前提下可作若干的更动与润饰,本发明所主张的保护范围应以权利要求书所述为准。
Claims (10)
1.一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,包括:
步骤01:制备以石墨烯为沟道的石墨烯场效应晶体管,作为石墨烯传感器;
步骤02:根据待测的MicroRNA序列,对所述石墨烯进行表面改性,将能与所述待测的MicroRNA相结合的DNA探针结合到所述石墨烯表面的官能团上;
步骤03:将所述石墨烯表面未与所述DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来;
步骤04:利用改性过的所述石墨烯场传感器对所述待测的MicroRNA进行检测,通过所述石墨烯上的所述DNA探针与所述待测的MicroRNA结合前后的电流信号的差异来检测出所述待测的MicroRNA。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤02包括:
步骤021:将所述石墨烯场传感器浸入N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液,于室温下反应,通过π堆叠效应,N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸自组装到所述石墨烯表面的官能团上;
步骤022:采用甲醇和去离子水冲洗所述石墨烯传感器;
步骤023:再将所述石墨烯传感器浸入溶解有末端修饰氨基的所述DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液中,于室温下反应,所述DNA探针末端的氨基与所述N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸发生化学反应,形成酰胺键,从而把所述DNA探针结合到所述石墨烯表面;
步骤024:用去离子水冲洗所述石墨烯传感器。
3.根据权利要求2所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤021中,所述N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液的浓度为4.5~5.5mM,所述于室温下反应所采用的反应时间为1.5~2.5小时;
所述步骤023中,所述溶解有末端修饰氨基的所述DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液的浓度为90~110nM,所述于室温下反应所采用的反应时间为11~13小时。
4.根据权利要求1所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤03中,采用乙醇胺将所述石墨烯表面未与所述DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来。
5.根据权利要求4所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述乙醇胺的浓度为0.05~0.15M。
6.根据权利要求1所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤04包括:
步骤041:测试得到未与所述待测的MicroRNA相结合的所述改性过的所述石墨烯传感器的第一电流信号;
步骤042:将所述改性过的所述石墨烯传感器浸入待测的MicroRNA样本中,于室温下反应;
步骤043:用去离子水冲洗所述改性过的所述石墨烯传感器,并自然干燥;
步骤044:测试得到完成所述步骤042之后的所述改性过的所述石墨烯传感器的第二电流信号;
步骤045:通过比较得到所述第一电流信号和所述第二电流信号存在的差异,从而探测出所述待测的MicroRNA。
7.根据权利要求1所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤01包括:
步骤011:制备出石墨烯薄膜;
步骤012:将所述石墨烯薄膜转移至硅衬底上;
步骤013:在所述石墨烯上形成源极、漏极、栅极以及所述源极和所述漏极之间的导电沟道,所述导电沟道为部分所述石墨烯薄膜。
8.根据权利要求7所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤011包括:以铜箔为衬底,采用甲烷为碳源前驱体,在常压下采用化学气相沉积法制备出所述石墨烯薄膜。
9.根据权利要求7所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤012包括:利用PMMA高分子膜作为载体,在所述已生长了所述石墨烯薄膜的所述铜箔上旋涂PMMA胶体;然后,进行烘烤,使所述PMMA胶体与所述石墨烯薄膜牢固结合,同时所述PMMA胶体中的有机溶剂挥发掉,从而在所述铜箔上形成均匀的PMMA膜;接着,采用化学腐蚀法将所述铜箔腐蚀掉,并将载有所述石墨烯薄膜的所述PMMA膜转移至所述硅衬底上;通过烘烤,使所述石墨烯薄膜与所述硅衬底紧密接触;最后,采用热丙酮去除所述PMMA膜,得到位于所述硅衬底上的所述石墨烯薄膜。
10.根据权利要求7所述的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法,其特征在于,所述步骤013包括:
步骤0131:在所述石墨烯薄膜上形成金属对准标记;
步骤0132:利用所述金属对准标记,经光刻和刻蚀工艺,使所述石墨烯薄膜形成带状石墨烯,所述带状石墨烯作为所述导电沟道;
步骤0133:利用所述金属对准标记,在所述带状石墨烯上形成所述源极、所述漏极和所述栅极。
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Application publication date: 20151104 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |