CN109837335A - 一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种联合ATAC‑seq和RNA‑seq筛选食药用菌功能基因的方法，利用ATAC‑seq方法测试出食药用菌在环境因子诱导前后的菌丝培养阶段的菌丝和经过环境因子诱导原基分化后原基的开放染色质区域并分析开放区域编码基因，利用RNA‑seq方法测试出食药用菌在菌丝阶段的菌丝和经过原基分化后的原基的mRNA序列，并利用Venn图寻找经过ATAC‑seq方法和RNA‑seq方法获得的基因序列之间的共有差异基因，最终通过生物学分析在共有差异基因中寻找影响食药用菌原基分化的关键功能性基因序列。

Description

一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法

技术领域

本发明属于生物学技术领域，尤其是涉及一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法。

背景技术

食药用菌是一大类有大型子实体的高等真菌，俗称蘑菇或蕈，目前我国约有1000多种食用菌，大部分属于担子菌，小部分属于子囊菌。食药用菌含有丰富的多糖、蛋白质、三萜类、多肽、膳食纤维、牛磺酸、甘露醇、不饱和脂肪酸、腺嘌呤核苷、内脂、矿物质和维生素等，同时具有低盐、低脂、低糖和高蛋白质的特点，被营养学家推荐为十大健康食品之一，具有巨大的市场前景和开发潜力。其中，绣球菌是一种名贵的食药用菌，主要分布在东亚亚热带和温带地区，包括我国吉林、黑龙江、云南等地，绣球菌子实体中含有蛋白质、必需氨基酸和维生素等多种功能性成分，其主要活性成分β-葡聚糖含量丰富，日本食品分析化验所测定其含量为43.6％，是灵芝、姬松茸的2倍以上，为菇类之最，且具有较高的药用、保健功能，在日本有“梦幻之菇”之称。现代研究证实绣球菌具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节、造血等生理生化活性。作为一种珍稀的食药两用菌，绣球菌由于其良好的营养价值和保健功效，受到了学者和消费者的广泛关注。

近年来，随着我国食药用菌产值比重的上升以及在国际市场占有率的提高，关于食药用菌栽培和增产技术的研究备受关注。目前，各研究机构大多将对食药用菌的研究集中在人工栽培方面或者是栽培生理、生化活性的研究，着重攻克具有良好的营养价值和保健功效且野生资源少，采集困难的食药用菌的人工驯化工作。但是，关于食药用菌的栽培技术仍不够成熟，无法实现大规模栽培。随着基因工程不断的发展，将遗传育种技术引入到食药用菌的培养中将成为一个食药用菌人工栽培和增产的重要途径。目前应用于食用菌遗传育种的方式主要包括人工选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种和基因工程育种。其中，人工选育、诱变育种和杂交育种三种方法在分子生物学发展初期较为常用，虽然能选育处性状优良的菌株，但是筛选较为盲目，而且耗费人工和时间；原生质体融合育种的过程中融合子增强的性状仅限于两个亲本已经具有的性状，难以获得新的性状。而基因工程育种是在基因水平上的遗传操作，可以将任意一个有功能的基因导入受体细胞中复制表达，从而选育出新品种。基因工程育种为选育更优良性状的食药用菌菌种带来了曙光。

在基因育种的全过程中最为重要的就是从食药用菌中筛选出对食药用菌生长起到关键作用的功能性基因。功能性基因筛选技术主要是通过蛋白质组学、功能基因组学等生物组学技术进行筛选，其研究的基本策略是：(1)通过表达谱差异分析、生物信息学分析和基因克隆等途径获得候选基因：(2)对候选基因进行功能性评价，确诊其所要筛选的功能基因。这些研究目前局限于生物、医药和疾病治疗等领域，在食药用菌中还不具有普遍适用性。关于食药用菌的基因筛选仅限于利用转录组测序、蛋白质组学技术等单一的技术来筛选，但是通过这样单一的技术筛选出食药用菌原基分化过程中差异表达基因的方法通常会找到大量的差异基因，导致后续基因功能鉴定和验证的工作量很大，而且单一技术找出的特异基因的特异性较低，容易出现较多的假阳性，无法高效的筛选出食药用菌原基分化阶段的关键基因。通过多种组合的生物学技术进行基因筛选和功能鉴定，进而找到能够影响食药用菌原基分化阶段的关键功能性基因，提高食药用菌人工栽培效率、稳定和新品种的培育是未来食药用菌栽培技术发展的趋势。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法，其中联合了ATAC-seq和RNA-seq两种基因测序方法，利用ATAC-seq可以获得开放染色质区域的信息，再配合RNA-seq以获得相应的转录本信息，找到相关基因的上游调控序列，整体分析特定时空下的调控网络，并且相互验证，同时结合原基分化的关键环境因子，高效的筛选出原基分化的关键基因。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法，利用ATAC-seq方法测试出食药用菌在环境因子诱导前后的菌丝培养阶段的菌丝和经过环境因子诱导原基分化后原基的开放染色质区域并分析开放区域编码基因，利用RNA-seq方法测试出食药用菌在菌丝阶段的菌丝和经过原基分化后的原基的mRNA序列，并利用Venn图寻找经过ATAC-seq方法和RNA-seq方法获得的基因序列之间的共有差异基因，最终通过生物学分析在共有差异基因中寻找影响食药用菌原基分化的关键功能性基因。

一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用。

进一步的，所述绣球菌的菌丝培养阶段的菌丝取用在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝。

进一步的，联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，具体步骤如下：

S1、将绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝、在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基分别经过ATAC实验获得纯化DNA进行Illumina HiSeq测序、经过RNA-seq实验获得mRNA进行Illumina HiSeq测序；

S2、经过ATAC-seq方法测序后分别获得绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组以及在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调和上调的基因数量，同时经过RNA-seq方法测序后分别获得在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组以及在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调和上调的基因数量；

S3、利用Venn图分析经过光照诱导但还未出原基的菌丝和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq联合方法测序后共同表达下调的基因数量以及共同表达上调的基因数量；同样利用Venn图分析经过光照诱导后的原基和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq联合方法测序后共同表达下调的基因数量，共同表达上调的基因数量；

S4、综合分析经过步骤S3中获得的两对比组中共同表达下调和上调的基因数量，并利用Venn图分析寻找两对比组的共有差异基因；

S5、对共有差异基因进行生物信息学分析筛选出光照诱导绣球菌原基分化的关键功能性基因。

进一步的，所述ATAC实验具体操作步骤如下：

A1、样品制备：取绣球菌栽培中的黑暗条件下的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝、经过光照诱导后的原基，用液氮速冻，超低温保存；将样品放入预先冷却含有匀浆缓冲液的匀浆器中，让冷冻的组织解冻并将组织研磨，预冷离心，取上清液，利用碘克沙醇梯度法分离细胞核，计数细胞核，每50000个细胞核核分装保存；

A2、转座反应与纯化：将50000个细胞核转移到含有1ml ATAC-RSB和0.1％Tween-20的管中，离心取上清液，加入Omni-ATAC ATAC-seq反应混合物，在37℃下孵育30min纯化DNA，用10μl elution buffer洗脱DNA；

A3、PCR扩增：取10μl经过步骤(2)转座纯化后的DNA、10μl无核酸酶的水、2.5μl浓度为25μM的PCR引物1、2.5μl浓度为25μM的PCR引物2和25μl NEB Next High-Fidelity 2×PCR Master Mix；

A4、测序和基因数据分析进而获得不同样品表达下调和上调的基因数量。

进一步的，所述RNA实验依次经过样品制备、mRNA提取、文库构建以及测序与数据分析进而获得表达下调和上调的基因序列。

进一步的，所述RNA实验中绣球菌菌丝和原基样品需在液氮中研磨，利用TrizolRNA提取试剂提取mRNA。

进一步的，所述RNA实验中文库构建的步骤如下：

B1、用带有Oligo的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入NEB FragmentationBuffer使其片断化成为短片段；

B2、以片断化后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链，经过QIAQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱；

B3、洗脱纯化后的双链cDNA再进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段并进行PCR扩增，完成文库构建工作。

进一步的，所述步骤S5中生物信息学分析包括对共有差异基因进行GO分析、KEGG分析、GSEA分析和信号网络分析。

本发明的有益效果：

1、本发明中采用联合ATAC-seq和RNA-seq的方法进行食药用菌在原基分化阶段的关键功能性基因进行筛选，相较于现有技术中利用单一技术筛选功能性基因具有更高的效率，更好的特异性和准确性，克服了单一技术筛选过程中出现的差异基因数量大，后续基因验证工作量大、效率低、容易出现假阳性等问题，ATAC-seq和RNA-seq两种测序方法用于食药用菌基因筛选能够将影响食药用菌生长的环境因素考虑在内，进而获得特定时空下的遗传信息；ATAC-seq获得特定时空下的食药用菌开放染色质区域的信息，所有在该特定时空下发生转录的基因以及顺式调控元件均可以检测到，同时结合RNA-seq获得在该特定时空下的相应的转录本信息，就可以准确的找到在该特定时空下相关基因的上游调控序列和下游调控序列；ATAC-seq和RNA-seq两种测序方法的联合能够帮助基因筛选从不同角度(两种测序方法得出的差异基因)和不同层面(不同的生长环境因素)进行考虑，整体分析在特定时空下的调控网络，同时ATAC-seq测序方法和RNA-seq测序方法能够在同样的特定时空下进行相互验证，提高关键功能基因筛选结构的准确性。

2、本发明中将联合ATAC-seq和RNA-seq的方法用于绣球菌的关键功能性基因的筛选，同时将影响绣球菌生长的环境因素也就是绣球菌生长的特定时空-光照考虑在内，选择绣球菌在黑暗条件下的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝、经过光照诱导后的原基为测试样品，形成对比组，通过寻找两对比组差异基因，并从差异基因中寻找共同差异基因，即筛选出绣球菌菌丝生长的重要调控基因，也就是子实体形成的关键基因。

附图说明

图1为本发明中绣球菌功能基因筛选的整体技术路线图；

图2中(a)为绣球菌经过RNA-seq和ATAC-seq方法测序后黑暗条件培养的菌丝和光照诱导但还未出原基的菌丝表达下调的基因数量Venn分析图；(b)经过RNA-seq和ATAC-seq方法测序后黑暗条件培养的菌丝和光照诱导但还未出原基的菌丝表达上调的基因数量Venn分析图；(c)经过RNA-seq和ATAC-seq方法测序后黑暗条件培养的菌丝和光照诱导后的原基表达下调的基因数量Venn分析图；(d)经过RNA-seq和ATAC-seq方法测序后黑暗条件培养的菌丝和光照诱导后的原基表达上调的基因数量Venn分析图；

图3中(a)为绣球菌在黑暗条件培养的菌丝与光照诱导后的原基对比组与黑暗条件培养的菌丝与光照诱导但还未出原基的菌丝对比组中共同表达下调的基因数量Venn分析图；(b)为绣球菌在黑暗条件培养的菌丝与光照诱导后的原基对比组与黑暗条件培养的菌丝与光照诱导但还未出原基的菌丝对比组中共同表达上调的基因数量Venn分析图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。

一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法，利用ATAC-seq方法测试出食药用菌在环境因子诱导前后的菌丝培养阶段的菌丝和经过环境因子诱导原基分化后原基的开放染色质区域并分析开放区域编码基因，利用RNA-seq方法测试出食药用菌在菌丝阶段的菌丝和经过原基分化后的原基的mRNA序列，并利用Venn图寻找经过ATAC-seq方法和RNA-seq方法获得的基因序列之间的共有差异基因，最终通过生物学分析在共有差异基因中寻找影响食药用菌原基分化的关键功能性基因。

一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用。

进一步的，所述绣球菌的菌丝培养阶段的菌丝取用在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝。

进一步的，联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，具体步骤如下：

S1、将绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝、黑暗条件培养的菌丝和经过光照诱导后的原基分别经过ATAC实验获得纯化DNA进行IlluminaHiSeq测序、经过RNA实验获得mRNA进行Illumina HiSeq测序；

S2、经过ATAC-seq技术测序后分别获得绣球菌在黑暗条件培养的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝和经过光照诱导后的原基中表达下调和下调的基因数量，同时经过RNA-seq技术测序后分别获得在黑暗条件下培养的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝和经过光照诱导后的原基中表达下调和上调的基因数量；

参见图2，经过ATAC-seq技术测序后获得的在黑暗条件培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组中表达下调的基因数量一共为198个，经过RNA-seq技术测序后获得的在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组中表达下调的基因数量一共为830个；经过ATAC-seq技术测序后获得的在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组中表达上调的基因数量一共为182个，经过RNA-seq技术测序后获得的在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝表达下调的基因数量一共为795个；

参见图2，经过ATAC-seq技术测序后获得的在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调的基因数量一共为1227个，经过RNA-seq技术测序后获得的在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调的基因数量一共为1435个；经过ATAC-seq技术测序后获得的在黑暗条件培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达上调的基因数量一共为1241个，经过RNA-seq技术测序后获得的在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达上调的基因数量一共为1469个；

S3、利用Venn图分析上述差异基因数据，得出经过光照诱导但还未出原基的菌丝和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq结合技术测序后共同表达下调的差异基因数量有45个，共同表达上调的差异基因数量有32个；同样利用Venn图分析得出经过光照诱导后的原基和在黑暗条件培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq结合技术测序后共同表达下调的差异基因数量有174个，共同表达上调的差异基因数量有350个(如图2所示)；

S4、综合分析经过步骤S3中获得的两对比组中共同表达下调和上调的差异基因数量，利用Venn图分析寻找两对比组的共有差异基因；

参见图3，将经过光照诱导后的原基和在黑暗条件下培养的菌丝对比组共同表达下调的基因与经过光照诱导但还未出原基的菌丝和在黑暗条件下培养的菌丝对比组共同表达下调的基因进行比对分析获得其中两对比组中共同表达下调的共有差异基因数量13个，共同表达上调的共有差异基因数量17个，因此共有差异基因数量为30个，具体共有差异基因见序列表；

S5、对经过步骤S4获得的共有差异基因进行GO分析、KEGG分析、GSEA分析和信号网络分析等生物信息学分析筛选出光照诱导绣球菌原基分化的关键功能性基因。

其中，所述ATAC实验的具体步骤如下：

A1、样品制备：取绣球菌栽培中的黑暗条件下的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝、经过光照诱导后的原基，用液氮速冻，超低温保存；将样品放入预先冷却含有匀浆缓冲液的匀浆器中，让冷冻的组织解冻并将组织研磨，预冷离心，取上清液，利用碘克沙醇梯度法分离细胞核，计数细胞核，每50000个细胞核核分装保存；

A2、转座反应与纯化：将50000个细胞核转移到含有1ml ATAC-RSB和0.1％Tween-20的管中，离心取上清液，加入Omni-ATAC ATAC-seq反应混合物，在37℃下孵育30min纯化DNA，用10μl elution buffer洗脱DNA；

A3、PCR扩增：取10μl经过步骤(2)转座纯化后的DNA、10μl无核酸酶的水、2.5μl浓度为25μM的PCR引物1、2.5μl浓度为25μM的PCR引物2和25μl NEB Next High-Fidelity2×PCR Master Mix；

A4、测序和基因数据分析进而获得不同样品表达下调和上调的基因数量。

其中，所述RNA实验依次经过样品制备、mRNA提取、文库构建以及测序与数据分析进而获得不同样品表达下调和上调的基因数量。

RNA实验中样品的制备：取栽培中的黑暗条件下培养的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝、经过光照诱导后的原基，用液氮速冻，超低温保存。

mRNA提取：将样品在液氮中研磨后，根据Trizol RNA提取试剂的操作说明提取总RNA。利用NanoDrop2000超微量分光光度计、琼脂糖凝胶、安捷伦2100RNA Nano 6000AssayKit进行样本检测。

文库构建步骤如下：

B1、用带有Oligo的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入NEB FragmentationBuffer使其片断化成为短片段；

B2、以片断化后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链，经过QIAQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱；

B3、洗脱纯化后的双链cDNA再进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段并进行PCR扩增，完成文库构建工作。

其中，文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的***片段长度进行检测，***片段符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 福建省农业科学院食用菌研究所（福建省蘑菇菌种研究推广站）

<120> 一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 1

atggtggtca gttcctctca gcatgacgca cccaggcgtc tcgtagacga gcaggatgtc 60

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<210> 2

<211> 327

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 2

atgacttggc tactctatga agctaccata gctggttgct tcaagggctc atattcactg 60

gtatctgggt catcggacat gaatttcctc acatacctcg agattgcaca taccattctt 120

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<211> 3028

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 3

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tggtggcgat atttgtcata tgaatttgca caagaccttc gctatccccc atggtggcgg 2280

tggtccaggt gtcggaccaa tctgtgccgc cgagcatctc gcacctttct tgcccggcca 2340

cccagttatt gcaactggcg gagataatgc aatcaacgcg gttgcagctg caccgtacgg 2400

aagcgcgtcc attcttctca tctcctgggc atacatcaag atgctcggtg gtgacggtct 2460

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<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

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ggactctgcg cacgtgggtt ggccgatacc gagaagctga tgcccactta cgaacacgaa 120

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<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

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atggttgagg tcaagaacaa agtctgtctg atctggtgga atcgtcgctc accccgtcaa 60

gatagtgtgc acgacggctg gggtatcgcc cccgagaaga acatgaaggg cgatgccatc 120

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cacctgaaca tcggcgcggg ccgtattgta tggcaggaca tcgtcaggat cgatgtgtcc 300

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gagggcaatg gccgtttgca cctcctcgga ttggtttctg acgggggtgt tcactcgcac 420

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

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atgtcagtca ctcaccaaga tacgacgtct gttgaagaga aagctgctgg ggctttccag 60

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<400> 8

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gctggggcga agacgagaca gtcgcagcgc cggaagacca tgcagaagcc aaagtacgtg 2040

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cgcagaatcc ctgttggcgg tacaattgat gtcaagaagc tcgaagaaac tgcacgacag 120

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atctgcgtca attcacgttc gctcctcaac gtgagctctt ccagaaatgg gctacggctt 180

acggcgacgt cttccatctc aatatcttag ggcagattat cgtagttgtg aactccctcc 240

aagtcgcaac tgacctcctc gagaaacgga gtgcgaacta cagtgacagg cctgcttgta 300

ctgccctgga gatgatgggc tggaaggcga acgttgcctt tatgcggtac ggcgcgcggt 360

ggaggaagca cagaaagctt ttccaagagt actttggcca gagtcaaagc ctgacatacc 420

gcgcccatca gactgaggaa gcgcgtatgc tcctgaaaga tttgctactt cgcccgcgga 480

gttcaaggca tgtacgcaga agtatgctct tctgagcatc ataggcattg catacggaca 540

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a 1441

<210> 13

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<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 13

atggctctca aggtcgacaa tattccccgc ctcagtggaa cagaccttgt tcatgctgat 60

gatcagttgc acggtcctga agtcgctcct tccatctcag taacttccac attccgtgct 120

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<210> 14

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<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 14

atgctctcac tcgcccgcgt gcggtcggtc gcagagctgc tcgcgatgct ccttgcaagc 60

gttcggacgc gtccgctcaa gctcctcggc cccgccgctg cggtgagtgc actcgtgctc 120

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gtgttctcgc agataccatc tgcctttgct tctctatttc atggcaagca cgaatacaat 420

ttctacacca tcccgcaacc aaacgctggt gggaaggcaa agtactggcc gcgaggcacg 480

ttgcgttatt ctcgttatcg gttggacgct aacaattgtt cgatggtagc caagcttttg 540

ggtggatgtt cctcattaaa tgcgatgatt ttccaccact gcgcgccgtc cgactatgac 600

gaatgggtaa ggtaccagaa aggcgcggag ggtgcagagg gctggtcgta cagcgaattc 660

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atggagctga tcgaacctgc agctgggtat tttggaaatg ctgcggtgca tacgatgaat 840

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<400> 15

atggtcttcc cagtccgagg ctttgcgaat ggcagaagaa gtgagcaagc gcgagcggca 60

cgtcactgtg ctcttcgaca acgcagggat cacgggcgca cgcgctccgc ggcctgcggc 120

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atggtcttcc cagtccgagg ctttgcgaat ggcagaagaa gtgagcaagc gcgagcggca 60

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<400> 18

atgcccgact accccgagtc gtcccaccgc accgtcctcg ccgatccccg cccgtccggg 60

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atgtccagct ccagatcttg cgctcccagc cgtccacctt accggccgaa gccgacctct 60

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<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 20

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ggctcagccc cctcatgtcc actcccaacc tgcaacgcgc cctcctccga gacacccacc 360

accaccacca ccaccaccag cagtcccggc gtacacttct ctccggcccc cgtgtcctct 420

tcgcgtccgt ccacacccgt ttcgcgcgtc gatgtctccg taaacaagat catctctctc 480

gtcgtccgcg cccacaacaa cacagacccc gacgcgtccg ccaccgtccg cacttacccc 540

gcagacatcg acgaccaaac cgatgacagc gatgccgcgg acgacctcga cgagcatccc 600

ttgccttcca ccgacgctgt ttccgatccc gatcgacaca gcggtctagg ccccgccgcc 660

cctgcctcta gccatccccg cccgcagtcc ccaccgcgtt cgcgcaagcg tcgccgcggt 720

ccccgcccgc gccaccgccc tcacgaccac ccgcccagcc cttcttcgga tcctgccgcg 780

cgattcgaaa aggagctgct caccgagctc acctgcgaga tctgctttgc gctgctctgg 840

cagcccgtta cgaccccgtg ccagcacacc ttctgctccc cgtgtctcgc ccgcgctctc 900

gatcacaacc tcgcctgccc cctctgccgc cagatcctcc ccgggtacga ctactttcag 960

gagcacccct gcaacaagct cgtcctctcc atcctgctcc gcgcgttccc cgaggctacg 1020

ccgagcgcgg cgccgccctc gaggccgagg cccgcgactc ccgcctcgac accccgctct 1080

tcgtctgcca gctcagcttc ccgggcatgc ccaccatcct ccactttttc gagcctcggt 1140

accgcctgat gctccgccgg tgcctcgccg cgccgtaccc cgccttcggg atggtgcccc 1200

cgccgcgcgc ctccgccggc gtggtggagt tcgggacgat gctcgagatc cgcaacgtgc 1260

agatgctgcc cgacgggcgg agcgtcgtcg agacctgggg cgtgtggcgc tttcgggtca 1320

tggagcgtgg gaccctcgac gggtatggcg tcgcgcgcgt ggagcgtgtc gaggactggg 1380

aggaggacga cgaggaggcc gttctggacg tgcggcctgt tgcgagtggg gaggaggggt 1440

ctgggacgcc cggtccgtcc tcgtcgtcct cggtcgcgtc gatgtccact tctccgcctc 1500

tttcggagcc cccgggctct gcgttgacga gcgttggccc gtcgacgatc ccgcgcagtg 1560

cgccgacgaa cgtggagctg atggcgatct gccacgagtt tcttgagtac ctccgcgagg 1620

gcacgccgtg ggtcgtgcag cacctcaaca cgtcgtacgt ccccatgccg gcggatcccg 1680

ctgcgttcag tttttggatt gggatggtgg ttctctggtg gctgcgtcgt ctcgtgatgc 1740

ggctctactt ttcgcgcgct gctggcccgt acgcctgcgt cgtcgcgctg cttgcgttcg 1800

ctgtgtactc tatacaaggc ggctga 1826

<210> 26

<211> 2008

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 26

atgtcctcct cgcgccagaa ggccccgccg gtccaacgtc ggccgcgcac cgtcgacccg 60

cccttccgag ccgtgctctc actcccccgc cgcctgctgc gcccgcccag cccccgcggc 120

aagctgccct cgtggggcat cgccccgcgc ttcaccgtca ccctggacga catcctcgac 180

cgccgccacc tcccgcccct cggcctcaaa gactttgagg agtggctcct cttcgtcgag 240

cactcccccg agtccctgta cttcatccta tggctccgcg agtacaccgc ccgcttcgac 300

gcctggatcc acgcctccaa gggcgcgttc acccccaccg accctgtcca ccccagctcg 360

taccgcactc cgcccacacg tccccctccc agccccgccc tgctttcctt ctatatgcgc 420

gcaaagcaca cattcctcct ccacgacgcc ccctacgaac tcctcgtccc caccgacgcc 480

ctcgccccct tccgctcctc gcaagcctat ccgtatgatt gcaacgccga tttcgagcag 540

tgtccacacg cacaccccgt cttcaggtcc aagctgcagc caagagaaac tgatctaccc 600

ccctttgcag gcttgccacc ggaccccctc gtcttcgccg agctcgccgc cctcgtgcgc 660

acggccctcg ccgagagtct cgcccgcttc gtccgcgcga ccttcgccaa cgtcgacgca 720

ccccgcgccg tctgcgggtg ctacggcggg acggtgatct tactcgcggg cagcatcccg 780

ccgatcgtca cgagtatcgt gctgggcagc agccgatggt ggcggctgtt tgcgctcccc 840

gggatgtggc tcggcctgac ggtgctcatc gcggccatgt acggcgtctg catgatgatc 900

tacctcttcg gcgacctccg ccaattgcgc tcgttcgagc tccttcggcc gccctccgac 960

cctgcgctga ccgttgaccg ctcgaagaag gccgggtggc tgaccccgcg cgtgacaccc 1020

gcgatctcgc cgcccacgct gctcacatcc acagccgtag agagtccggg gctgctgcct 1080

gtcccgtgtg ccccccctgc acctgcagac gcgaaggcgc cccagaagcc gcagctgagc 1140

atcgtctgcg gcccccccgc gcactggccc gggccagacc gcgcgctcac accattctcg 1200

tacgactcgc gcagcatgta ctcgcagtcc acgggcggcc tcagcgagca ctacggctcg 1260

gactacgagg acgaggacga ggacgacgcg tgcagcgacg cgcgcatcca cgtctccgac 1320

gcgttcttcg acgagcaccc cgccgcgccg gacgcgccgt tccccgcgcc ccccctcacc 1380

gcgtcgttca tccggcccta tgtctaccgc gccgaggacg cgtacgcgga gggcgacgtc 1440

gagcgtggag aggccgggac cccgccgcgc gccagcccgt cgacgtgttc gactttgacg 1500

cgctcccgcc cgcgcgccgc aggctgtccg tgccgcacgc ggccgccacg ctccaggcgc 1560

ctgcgccggt gcacatcatc gcgccggacg agaagccgcg ccgcgacggg ccgcgggcgc 1620

tcctcggcgt gctgcaggcg cgatgcgcgc cgcggaatat cgtgcgcacg cgcttcgcgg 1680

gggacgtggg cgtcggtatt gggctcggtg ccgtgagggc gcgcgggcgc gttgcgatcc 1740

cggcgtttgc gctcctcccg agcccgacgc gtcgagcgcg tcgttctccg cggcggcgag 1800

cgcgaaggcc ccctccgcgc gggagaagga acgggcgagg gggtggatcc ctgctgcgcc 1860

gtttgcggtg ccggtgacgc cggtgctgag cccggtggtg tcgcgtgcgc agtgggagat 1920

tgtggtgcgg agcggggtgc tggctgcggt tgtgagcggg cttttgggtg tggttgtttt 1980

ggcgctgcct gtgcggcgca cggtgtag 2008

<210> 27

<211> 264

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 27

atgaaactga ttgttctgcg gctgaagagc agacgactca cggaggcact tcttcaccgc 60

gatttccaat tatctgtaac aatcccggac gacaggcttt gtccccctgt accgaacagg 120

ctcaactaca ttttatggat gcaagacatc gtgcatgcga cctccatcgc ggaacctgaa 180

atatcgaaga gaattatcaa gggagttgat atgtatgttc ttccgcattc tcttgcactc 240

ctggatatcg atcgctccga atag 264

<210> 28

<211> 2617

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 28

atgccctttg agcggtatct ccaggcgccg tcctcgtcct cccagcaccg tcgctcctat 60

gacaattatc ccgtcgccca tcccgacccg tctttcggca tcgatgcctc gaccttctct 120

ccaatgtcca gttccaggtc ccccgcatga tgaaccctgc tcccaccctc gctcacggcg 180

gtggtgcaga ggttcttccc ccaggtctcc ttccctcctc cggccccatc tcctcctggt 240

tccccgccgc cggttatcgt tccccggacg acttttcccc ctcctgctct gcatcccccg 300

tctatcgtag ccacccatcg ctgactgctc cagcctattc tcttccccca ggtccacact 360

cctaccgcca ccccgacttt gccgactcac ccgtgaactc tcctcccgat tctattccct 420

cctcctccgc cgccccatac gccttccctc tccagcaacc tcctcccgct gacatcctca 480

tctcccccga ttcccacatc cacctcgatg cccagctctt actccgtgct cacctctcca 540

ttccatcctc ttctctcccc ctctccatcc cctcggccat gggccttccc gtttattccg 600

cttccggctt cgatttcctc tccatcctca gccgtgtagc caaccgtcct caccccaagg 660

tccttctcgg tcccgtagac ctcacctgct cctttgtcgt cgtcgacgtc cgtcgctacg 720

actcccccat cgtgtacgcc tcccccactt ttttcaaact caccggctac gacgaacacg 780

aggtcttggg caggaactgc cgctttctcc agtctcccga tggccgcctc cagcgcggcg 840

agcagcgtct tcatactgcc cccgaggccg tcggcctcct caaacgctgt ctcgtcgccg 900

acaaagagtg ccaaaccagc atcaccaact acaagaaggg cggggccgcc ttcatcaacc 960

tcgtcaccgt cattcccatc ccaggcggcg tcaataatac tcccgcagag gcagacgacg 1020

tcgcctacca cgtcggcttc caaatcgacc tcacagagca gcccaacgcc attctcgaga 1080

agctccgcga cggtagctac gtcgttgact acagccgcaa accgcatgcc ctcccgctcc 1140

tcggaaaccc ttctgggtcc cgcaactggc gatccaactc gatatccatg agcggcgtgt 1200

ccacggaact gcgcaccctc ttggcagacc ccgcctttct tcagtcgatc tcggtcacca 1260

cttccaccac cgcctcctgc ccaccttccg gcgagaagct cgacgtatac gacggcaaca 1320

agccgctgca tatgttcctc ctcgagtgtg cccccgactt tatccacgtc gtttccctca 1380

agggcgcctt cctctacgtc gctccagccg tccgcagcgt cctcggctat gccccagacg 1440

acctcgtcgg tcgcgccgtc tccgatttct gccaccctgc cgacgtcgtc cccctcatgc 1500

gcgagctcaa agagtcctcc ataacccccg gtccaggaag cagccaccta atcgccgcat 1560

cgtcagacgc aggcccgcgc aacgtcgacc tccttttccg catgcgcgcc cagtcgggcc 1620

actttgtctg ggtcgagtgc cgaggtcgcc tccacgtcga gcccggcaag ggtcgcaaag 1680

ccatcatcct ttccggtcgc ctccgcagca tgccccgcct tgactgggat cctgtcgacc 1740

gcgccggtgg cctcgccgcg tccgcgcgca gtcccggcga cgactcgcgc aaggaacgcg 1800

agcgcgaatt ttgggcgctc ctcagcacca acggcacctg cctctttgtt ggcgctgccg 1860

tgcacgacgt gctcggctgg ggcgcgggcg aagtcatcgg cagggctctc ggcgatttta 1920

tcggcggtgc tactacggcg gatgcgcgcc gggcgttgga ggacgagctc gcgcgcgcgc 1980

tctctccgct ctcccccgtc ccgaggtgcg ccaacgcggc gtgtcgtgcg agatgatgcg 2040

caaggatggc gtgcaggtcg tcgtgcacat cactcttttc cgctcgcagg acaacagcga 2100

tgtgctcgcg cccgacgacg cgtggcaggg cgcggtggcc gttccacacg ccccgccgtg 2160

ccccgtggtc tgccaggtga agctgttcga cgcgccgtca gatggaccgc cggcggcggc 2220

ggcggggggt atcttgcacc cactgacgga cagcgtgttc gacgagctgc acatcgcgcg 2280

cgggagcagc tggcagtacg agctgcagca gctcaagttt gcgaaccagc gcataaaaga 2340

ggaagtcgcc gcgctggagg ccagcctctg ctctaaaaca cgccaacgtc ccttttcgca 2400

gagtacctcg cgggcaaacc ctgcccacga gcagcaacag cagcagtcgc agcagcaaca 2460

acagcgagag caatacgcgc atcatccgga gctactgccc gataatacca acaattggag 2520

cacgccatat gtgcagtacc cagtaaacct cgccccgttg cagccgtcgc aaacgttgaa 2580

gcggtcatgg cacgccatag acggggcacc cacctaa 2617

<210> 29

<211> 960

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 29

atgcccgaat ttagcacttc tttgggctgc tcaaatgccc cttacatcta caatgcgacc 60

gataccacct tcctcgtgcc agttggcttg aacaatgccg accacgagat cgaaatcctt 120

ggcaaggcgg tcggcacact cacattcgtg cagggcgact ctgatgcgac ggacgtcaag 180

tacgacatca ccctccgtgc tgaccaggac gggctcttcg actccattct gctgcagcac 240

tccacggcat acgaaatcga gcacggcatc tcgaacagtc acacgcgtct tgcgacaact 300

tacgaatcgt cagcgtgcat gcgctatgat atcaaagtct ctgtgccgcc gaccctcaag 360

aacttggctg taagcacgcg cacggtcacc cacatcaagt tcgacaccga ctccatgttt 420

gacttcgaca agctctcagt gagcatgcgc gcaatgatgg aaaccggcca tcttctcctc 480

ccgcatacgg gcgttcacgc gggcatgctc ttattcgata tttcccgtgg atggctcgtt 540

ggcgacgtcg cgatcgtgga caagaccacg ctgtcgacat caaagggcga cgcagtgatg 600

aacgtgcacg tgcaccccgt cccgtcaacc gcagaccttc ccgcgaccgc tgaactgcag 660

acgacaacgg gcacgggacg caccgacgtc ttcttcgtta gcagcgctgg tcacgttcac 720

cgccccattt ctagcactca cagctcgatg cgcggtggcg aaatgtacct gacgtacaag 780

gaggcggagt tcaagggcga ggtcgacctc tctgcgaagt cgtattctgc tagtggcctc 840

cagggctcaa tgatgcgcca cggtggcatg ggcggcgagc tcccttgggt tggggacaag 900

aacggcggcg ataagatcgt tgcgcagtct cccaatggct ggattgggtt gtacttctga 960

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<211> 594

<212> DNA

<213> 广叶绣球菌(Sparassis latifolia)

<400> 30

atgaagcagc ttgcactgct tcccgaggga aagggtctct tcaatttgtg taccaccgga 60

ctcaccttcg tccctctaaa cacgatttgt gccgacacga cgacgataca gaagacggta 120

tccgagacga tcctcgcagg tatcgcgcaa aatgtgtacc cgccaggtct gcgaaagcag 180

tacacaattc aactcaaaca ccttgagcag caggtaccta gtctcgaatt aattcttggt 240

cccggcataa tgataccgcc tgccaacccc gaccccacca agaaacacat caccctcggc 300

ttcggcctca acagtccctt ctctcggggc accatccacg tcgggtccag cgacccgctg 360

gtaccacccg tcatcgaccc gcacgtattc gaagaatcat acggcgagta cctcacgact 420

atggttgaac ttgtcaaatt tctccgccgc ctggcgaaga ccgagccact gaagagcctc 480

ctcgttggta agcatgtttg atacttgatt ttgcatttct actccagctc ttgaaactcg 540

tgcgtcggac acagagacgg aggtcagccc cggtccacag gtcgaatcag atga 594

Claims (9)

1.一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法，其特征在于：利用ATAC-seq方法测试出食药用菌在环境因子诱导前后的菌丝培养阶段的菌丝和经过环境因子诱导原基分化后原基的开放染色质区域并分析开放区域编码基因，利用RNA-seq方法测试出食药用菌在菌丝阶段的菌丝和经过原基分化后的原基的mRNA序列，并利用Venn图寻找经过ATAC-seq方法和RNA-seq方法获得的基因序列之间的共有差异基因，最终通过生物学分析在共有差异基因中寻找影响食药用菌原基分化的关键功能性基因。

2.一种如权利要求1所述的联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用。

3.如权利要求2所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于：所述绣球菌的菌丝培养阶段的菌丝取用在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝。

4.如权利要求3所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于，具体步骤如下：

S1、将绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝、在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基分别经过ATAC实验获得纯化DNA进行IlluminaHiSeq测序、经过RNA-seq实验获得mRNA进行Illumina HiSeq测序；

S2、经过ATAC-seq方法测序后分别获得绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组以及在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调和上调的基因数量，同时经过RNA-seq方法测序后分别获得在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组以及在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调和上调的基因数量；

S3、利用Venn图分析经过光照诱导但还未出原基的菌丝和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq联合方法测序后共同表达下调的基因数量以及共同表达上调的基因数量；同样利用Venn图分析经过光照诱导后的原基和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq联合方法测序后共同表达下调的基因数量，共同表达上调的基因数量；

S4、综合分析经过步骤S3中获得的两对比组中共同表达下调和上调的基因数量，并利用Venn图分析寻找两对比组的共有差异基因；

S5、对共有差异基因进行生物信息学分析筛选出光照诱导绣球菌原基分化的关键功能性基因。

5.如权利要求4的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于，所述ATAC实验具体操作步骤如下：

A1、样品制备：取绣球菌栽培中的黑暗条件下的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝、经过光照诱导后的原基，用液氮速冻，超低温保存；将样品放入预先冷却含有匀浆缓冲液的匀浆器中，让冷冻的组织解冻并将组织研磨，预冷离心，取上清液，利用碘克沙醇梯度法分离细胞核，计数细胞核，每50000个细胞核核分装保存；

A2、转座反应与纯化：将50000个细胞核转移到含有1ml ATAC-RSB和0.1％Tween-20的管中，离心取上清液，加入Omni-ATAC ATAC-seq反应混合物，在37℃下孵育30min纯化DNA，用10μl elution buffer洗脱DNA；

A3、PCR扩增：取10μl经过步骤(2)转座纯化后的DNA、10μl无核酸酶的水、2.5μl浓度为25μM的PCR引物1、2.5μl浓度为25μM的PCR引物2和25μl NEB Next High-Fidelity 2×PCRMaster Mix；

A4、测序和基因数据分析进而获得不同样品表达下调和上调的基因数量。

6.如权利要求4的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于：所述RNA实验依次经过样品制备、mRNA提取、文库构建以及测序与数据分析进而获得表达下调和上调的基因序列。

7.如权利要求6所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于：所述RNA实验中绣球菌菌丝和原基样品需在液氮中研磨，利用Trizol RNA提取试剂提取mRNA。

8.如权利要求4所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于：所述RNA实验中文库构建的步骤如下：

B1、用带有Oligo的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入NEB Fragmentation Buffer使其片断化成为短片段；

B2、以片断化后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链，经过QIAQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱；

B3、洗脱纯化后的双链cDNA再进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段并进行PCR扩增，完成文库构建工作。

9.如权利要求4所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于：所述步骤S5中生物信息学分析包括对共有差异基因进行GO分析、KEGG分析、GSEA分析和信号网络分析。