CN108410995A - 新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，属于生物技术领域，该方法包括以下步骤：步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得；步骤2、RNA提取；步骤3、文库构建及高通量测序；步骤4、数据处理及生物信息学分析。本发明通过高通量测序，共鉴定基因28717个，其中新候选基因987个，发情期与发情间期相比差异基因308个。

Description

新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法。
背景技术
多浪羊具有常年发情的优良特性，一年四季均可发情，受长、短日照规律的影响较小，可以按“一年两胎”或“两年三胎”繁殖。而大部分品种绵羊为季节性发情，受日照规律的影响较大，一般只在夏秋季节发情，只能按一年一胎进行繁殖。在规模化、集约化养殖趋势下，最大限度挖掘家畜的繁殖潜力是经济效益的追求所在，而季节性发情明显限制了羊繁殖潜能的发挥。从文献查阅及该领域专家报告来看，目前对绵羊常年发情和季节性发情的分子遗传机制还不是很清楚，只是对季节性发情的主要生理途径有个大致了解。从文献报道来看，卵巢上的一些关键基因对卵巢活动及卵巢功能的发挥起着非常重要的作用，而通过转录组学可以筛选到一些调控的关键基因，尤其是在多浪羊常年发情主效基因的筛选上意义重大。
转录组学(transcriptome)是指在某一生理条件下，机体细胞内所有转录产物的集合，包括小RNA(small RNAs,sRNA)、信使RNA(mRNA)及一小部分基因间区和基因区的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)。2005年以来，新一代高通量测序技术相继诞生，包括Illumina/Solexa测序，ABI/SOLiD和Roche/454测序等，这些高新技术为主效基因的挖掘及功能研究提供了更为广阔的平台。转录组学为研究机体内组织或细胞基因表达及调控提供了重要的技术和方法,同时也为主效或功能基因的挖掘提供了重要途径。但目前，多浪羊常年发情主要基因的挖掘方面研究比较少，该技术还没有应用到多浪羊不同生理时期卵巢常年发情等高繁殖特性相关基因的筛选与鉴定。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的空白，提出了一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法。该方法利用转录组高通量测序技术和生物信息学技术对新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因进行鉴定，并作GO功能分析、KEGG通路分析等。
其技术方案如下：
一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得：
通过同期发情、发情鉴定和妊娠鉴定技术，将发情间期、发情期和妊娠期多浪羊(塔里木大学动物试验站饲养)屠宰后立即取出卵巢，并用无RNA酶水冲洗组织表面，之后迅速投入液氮进行快速冷冻，并带回实验室-80℃保存备用。
步骤2、RNA提取：
分别取发情间期、发情期和妊娠期多浪羊卵巢取0.1g，用trizol法提取RNA，该实验用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip头、枪头盒、Enpendoff管必须用0.1％的DEPC水或无RNA酶水浸泡6h以上或直接过夜，包装好后高压灭菌20-30min，65℃烘干备用；用到的所有研钵、玻璃器皿、金属器械用锡箔纸包装好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降温备用，提取的总RNA经微量分光光度计检查纯度及浓度，合适以后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序；
步骤3、文库构建及高通量测序
样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的***片段长度(insert size)进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq测序。
步骤4、数据处理及生物信息学分析
测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。
进一步，步骤4中，数据处理的步骤如下：
(1)去除带接头(adapter)的reads；
(2)去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10％的reads；
(3)去除低质量reads(Qphred<＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。
RNA-seq的接头(Adapter,Oligonucleotide sequences for TruSeqTM RNA andDNA Sample Prep Kits)信息：
RNA 5’Adapter(RA5),part#15013205：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
RNA 3’Adapter(RA3),part#15013207：
5-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
根据不同的基因组的特征，我们选取相对合适的软件(动植物用TopHat2、细菌或者基因密度较高的物种用Bowtie2，二者mismatch均设为2，将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。
将所有测序reads数据的基因组定位结果放到一起，用Cufflinks进行组装，然后用Cuffcompare和已知的基因模型进行比较，可以:(1)发现新基因(相对于原有基因注释文件)；(2)发现已知基因新的外显子区域；(3)对已知基因的起始和终止位置进行优化。差异基因维恩图展示了各比较组间差异基因的个数，以及比较组间的重叠关系。
本发明的有益效果为：
本发明通过高通量测序，共鉴定基因28717个，其中新候选基因987个，发情期与发情间期相比差异基因308个，其中上调基因242个，下调基因66个；发情期与妊娠期相比差异基因352个，上调基因271个，下调基因81个；妊娠期与发情间期相比差异基因58个，上调基因36个，下调基因22个；生物信息学分析发情期获得SNP347659个，发情间期SNP312750个，妊娠期287191个；通过GO及KEGG通路分析发现显著上调基因中50个与受精、胚子的形成、激素的分泌与调控、性别的发生、生殖器官的发育等过程有关，同时获得bHLH、Homeobox、zf-C2H2、HMG、CSL、Transcription_Cofactors等36个转录因子。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得：
通过同期发情、发情鉴定和妊娠鉴定技术，将发情间期、发情期和妊娠期多浪羊(塔里木大学动物试验站饲养)屠宰后立即取出卵巢，并用无RNA酶水冲洗组织表面，之后迅速投入液氮进行快速冷冻，并带回实验室-80℃保存备用。
步骤2、RNA提取：
分别取发情间期、发情期和妊娠期多浪羊卵巢取0.1g，用trizol法提取RNA，该实验用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip头、枪头盒、Enpendoff管必须用0.1％的DEPC水或无RNA酶水浸泡6h以上或直接过夜，包装好后高压灭菌20-30min，65℃烘干备用；用到的所有研钵、玻璃器皿、金属器械用锡箔纸包装好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降温备用，提取的总RNA经微量分光光度计检查纯度及浓度，合适以后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序；
步骤3、文库构建及高通量测序
样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的***片段长度(insert size)进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq测序。
步骤4、数据处理及生物信息学分析
测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。
数据处理的步骤如下：
(1)去除带接头(adapter)的reads；
(2)去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10％的reads；
(3)去除低质量reads(Qphred<＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。
RNA-seq的接头(Adapter,Oligonucleotide sequences for TruSeqTM RNA andDNA Sample Prep Kits)信息：
RNA 5’Adapter(RA5),part#15013205：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
RNA 3’Adapter(RA3),part#15013207：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6位index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
测序分析后数据如下表1所示：
表1
注释：
(1)Sample name：样品名称
(2)Raw reads：统计原始序列数据，以四行为一个单位，统计每个文件的测序序列的个数。
(3)Clean reads：计算方法同Raw Reads，只是统计的文件为过滤后的测序数据。后续的生物信息分析都是基于Clean reads。
(4)Clean bases：Clean reads的个数乘以长度，并转化为以G为单位。
(5)Error rate：通过公式1计算得到。
(6)Q20、Q30：分别计算Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。
(7)GC content：计算碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。
根据不同的基因组的特征，我们选取相对合适的软件(动植物用TopHat2、细菌或者基因密度较高的物种用Bowtie2，二者mismatch均设为2，将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。Reads与参考基因组比对情况统计如表2所示。
表2
注释：
(1)Total reads：测序序列经过测序数据过滤后的数量统计(Clean data)。
(2)Total mapped：能定位到基因组上的测序序列的数量的统计；一般情况下，如果不存在污染并且参考基因组选择合适的情况下，这部分数据的百分比大于70％。
(3)Multiple mapped：在参考序列上有多个比对位置的测序序列的数量统计；这部分数据的百分比一般会小于10％。
(4)Uniquely mapped：在参考序列上有唯一比对位置的测序序列的数量统计。
(5)Reads map to'+'，Reads map to'-'：测序序列比对到基因组上正链和负链的统计。
(6)Splice reads：(2)中，分段比对到两个外显子上的测序序列(也称为Junctionreads)的统计，Non-splice reads为整段比对到外显子的测序序列的统计，Splice reads的百分比取决于测序片段的长度。
将所有测序reads数据的基因组定位结果放到一起，用Cufflinks进行组装，然后用Cuffcompare和已知的基因模型进行比较，可以:(1)发现新基因(相对于原有基因注释文件)；(2)发现已知基因新的外显子区域；(3)对已知基因的起始和终止位置进行优化。差异基因维恩图展示了各比较组间差异基因的个数，以及比较组间的重叠关系。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 塔里木大学
<120> 新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacndatctc gtatgccgtc ttctgcttg 59

Claims (2)

1.一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得：
通过同期发情、发情鉴定和妊娠鉴定技术，将发情间期、发情期和妊娠期多浪羊屠宰后立即取出卵巢，并用无RNA酶水冲洗组织表面，之后迅速投入液氮进行快速冷冻，并带回实验室-80℃保存备用；
步骤2、RNA提取：
分别取发情间期、发情期和妊娠期多浪羊卵巢取0.1g，用trizol法提取RNA，该实验用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip头、枪头盒、Enpendoff管必须用0.1％的DEPC水或无RNA酶水浸泡6h以上或直接过夜，包装好后高压灭菌20-30min，65℃烘干备用；用到的所有研钵、玻璃器皿、金属器械用锡箔纸包装好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降温备用，提取的总RNA经微量分光光度计检查纯度及浓度，合适以后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序；
步骤3、文库构建及高通量测序
样品检测合格后，用带有Oligo的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA；随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物random hexamers合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库；
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的***片段长度进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，文库有效浓度＞2nM，以保证文库质量；
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq测序；
步骤4、数据处理及生物信息学分析
测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。
2.根据权利要求1所述的新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，步骤4中，数据处理的步骤如下：
(1)去除带接头adapter的reads；
(2)去除N的比例大于10％的reads；
(3)去除低质量reads，Qphred<＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads；
RNA-seq的接头信息：
RA5,part#15013205：如SEQ:ID:NO:1所示；
RA3,part#15013207：如SEQ:ID:NO:2所示；根据不同的基因组的特征，选取相对合适的软件，动植物用TopHat2、细菌或者基因密度较高的物种用Bowtie2，二者mismatch均设为2，将过滤后的测序序列进行基因组定位分析；
将所有测序reads数据的基因组定位结果放到一起，用Cufflinks进行组装，然后用Cuffcompare和已知的基因模型进行比较。
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