CN107058557A - 影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法 - Google Patents

影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法，其中功能候选基因是RXRG、GPI、CPT2和/或GABARAPL1。筛选方法包括以下步骤：(1)选取肉质性状差异大的两个极端猪种的背最长肌，提取DNA，独立建库；(2)采用MeDIP‑Seq技术对样本DNA库进行全基因组DNA甲基化测序；(3)获得两个极端猪种的全基因组DNA甲基化水平的图谱，并筛选到差异甲基化表达基因；(4)对差异甲基化基因进行GO功能注释和KEGG Pathway分析，筛选出与脂肪酸生成和分解等肉质性状相关的功能基因和调控通路；(5)结合MeDIP‑seq和RNA‑seq的试验结果，进行DNA甲基化和表达谱的联合分析，获得猪肉质性状的功能候选基因。本发明筛选出参与猪肉质性状调节相关的功能候选基因，为今后的深入研究奠定基础。

Description

影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法
技术领域
本发明涉及一种影响猪肉质性状的功能候选基因及其筛选方法。
背景技术
猪肉质性状是动物经济蛋白生产的重要指标。尽管目前已经进行了大量针对猪肉质性状的遗传机制的研究，但全基因组水平探索候选基因和遗传机制的研究还是相对有限。过去20年DNA测序技术快速发展，目前已经成为研究遗传机制的重要手段。大量的研究表明转录因子、生长因子受体和信号通路机制参与肉品质性状形成的调节过程。
DNA甲基化是最早发现的基因表观遗传修饰之一，先前的报道表明，甲基化的CpG双核苷酸通过改变染色质结构或影响一些转录因子的结合活性抑制基因的表达。同时DNA甲基化调节不同的生理进程，包括胚胎发育、x染色体失活、细胞分化和抑制印迹基因的表达。DNA甲基化几乎只发生在5'碳胞嘧啶的位置[8]。然而这些CpG点在基因组中所占比例仅为1％。远低于其他二核苷酸序列的出现频率[9]。70％～80％的CpG双核苷酸处于DNA甲基化状态。但是存在一些区域，非甲基化的CpG不是均匀分布，而且呈现局部聚集倾向，是胞嘧啶和鸟嘌呤的富集区，CpG双核苷酸序列密度很高，以大小为300-3000bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛的形式存在，出现频率为平均值的5倍，形成CpG岛，CpG岛一般处于非甲基化状态。2012年Li等利用MeDIP-Seq方法绘制了猪基因组甲基化图谱，探索了全基因组不同表型的脂肪组织中脂肪沉积和DNA甲基化之间的关系。2015年Choi等利用RRBS方法对猪五个不同组织和一个细胞系进行全基因组DNA甲基化测序，观察表明猪全基因组甲基化图谱和人类等哺乳动物有着很高的相似度，CpG甲基化比例和基因的功能在五个组织中(除细胞系)正相关。试验为猪表观遗传学的探索提供重要的信息。2006年张等通过基因芯片分析拟南芥全基因组甲基化，表明DNA甲基化不仅作用于启动子和增强子还在基因间区和基因区扮演着重 要角色。也有学者认为，并不是所有的基因都有相同的甲基化和基因表达模式。有研究表明，启动子区CGI的缺失是DNA甲基化抑制的miRNA的一个共同特点。
随着对遗传学和表观遗传学的深入了解，我们致力于筛选候选基因。选取肉质性状差异大的两个极端猪种，皖南花猪(脂肪型)和大约克猪(瘦肉型)，是研究猪生长性能和肉质差异化的理想模型。我们的研究的目的是分析比较皖南花猪和大约克猪全基因组DNA甲基化模式，识别筛选可能参与脂肪酸代谢和脂肪沉积过程的关键基因。利用MeDIP-seq方法探索DNA甲基化和两个品种猪种肉质差异的联系。得到全基因组水平下高甲基化和低甲基化Peaks和DMRs在基因特征区域和CGI的数量和分布。除此之外，筛选出GO功能注释和KEGG Pathway通路分析中与脂肪酸代谢和脂肪沉积相关的条目和通路，做出相关的功能和途径分析。同时结合转录组测序，进行DNA甲基化和转录组表达谱的联合分析，筛选出同时差异甲基化和差异表达的基因。最后随机挑选7个候选基因进行焦磷酸测序，验证DNA甲基化免疫共沉淀的准确性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种影响猪肉质性状的功能候选基因。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种影响猪肉质性状的功能候选基因的筛选方法。
对于影响猪肉质性状的功能候选基因，本发明采用的技术方案是，功能候选基因是RXRG、GPI、CPT2和/或GABARAPL1。
其中的RXRG、GPI、CPT2和GABARAPL1的核苷酸参考序列，已经通过国际猪基因组测序联盟(International Swine Genome Sequencing Consortium)公布的猪全基因组序列发布。
对于筛选方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：
(1)选取肉质性状差异大的两个极端猪种的背最长肌，提取DNA，独立建库；
(2)采用高通量的全基因组DNA甲基化免疫共沉淀测序技术对样本DNA库进行全基因组DNA甲基化测序；
(3)获得两个极端猪种的全基因组DNA甲基化水平的图谱，并筛选到差异甲基化基因；
(4)对差异甲基化基因进行GO功能注释和KEGG Pathway分析，筛选出与脂肪酸生成和分解等肉质性状相关的功能基因和调控通路；
(5)结合MeDIP-seq和RNA-seq的试验结果，进行DNA甲基化和表达谱的联合分析，获得猪肉质性状的功能候选基因。
作为优选，步骤(1)中，所述两个极端猪种分别是皖南花猪和大约克猪。
另外，上述功能候选基因在猪肉质性状研究中得到应用。
本发明的有益效果是：
筛选出参与猪肉质性状调节相关的功能候选基因，为今后的深入研究奠定基础。
具体实施方式
本实施例是一种影响猪肉质性状的功能候选基因的筛选方法，具体包括以下步骤：
1材料与方法
1.1皖南花猪和大约克猪背最长肌样本的采集
本实验选取的样本为皖南花猪和大约克猪。两组猪群体，每组3个个体且均为随机选取，体重范围在100-131kg之间，共6个个体。取猪体背最长肌肉样(约1kg，位于最后肋骨至倒数第4肋骨处)，装于冻存管中，立刻放入液氮罐中保存。采集结束后取出放入-80℃冰箱冻存备用。
1.2背最长肌DNA的提取与测序文库构建
本实验采用酚:氯仿:异戊醇25:24:1/Agencourt AMPure beads并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样本的DNA抽提及纯化。DNA经 ND-1000分光光度计和0.8％琼脂糖凝胶电泳质检合格后备用。测序所用Flow cell为Illumina SE FlowCell v3-HS。测序文库构建选取合格的样品共6组制作DNA池，分别命名为WH-1，WH-2，WH-3，YY-1，YY-2，YY-3，用于后续MeDIP-seq及验证试验pyrosequencing。
1.3 Cluster生成
按照cBot User Guide所示相应流程，在Illummina HiSeq 2500测序仪配套的cBot上完成Cluster生成和第一向测序引物杂交。
1.4上机测序
按照HiSeq 2500User Guide准备测序试剂，将携有cluster的flowcell上机(仪器型号：HiSeq 2500，，Illumina)。选用single-end程序，进行single end 1×50ntmultiplex测序。测序过程由Illumina提供的data collection software进行控制，并进行实时数据分析。
2结果与分析
2.1高通量MeDIP测序分析
试验组WH-1，WH-2和WH-3样本分别生成33 179 625，37 610 867和32 924 118个有效reads，试验组YY-1，YY-2和YY-3样本分别生成31634309，31056478和27457277个有效reads。(表1)在去除低质量的原始数据后，六组数据生成平均30.8Gb的clean reads，有效reads率为98.84％至98.96％。然后将所有的reads映射到参照基因组，根据软件Sscrofa10.2共有77.73％至85.65％的有效率。uniquely mapped reads是测序进一步分析的基础。同时得出reads主要分布于CDS区，近启动子区转录起始位点(TSS)上游2k区域甲基化程度最低。
表1 MeDIP-seq测序生成的reads数量
2.2 Peaks在基因区域的识别和认证
表2 MeDIP-seq测序生成的peaks数量
Sample ID Peak count Sample ID Peak count
WH-1 120，443 YY-1 194，507
WH-2 206，080 YY-2 223，008
WH-3 193，398 YY-3 171，769
根据测序的原理，使用MACS(version:1.4.2)***，我们总共获得1109205个peaks。具体每个个体的peaks数量见表2。从表中我们得知6个样本的peaks数范围为120443～223008，并且在数量和分布上差异很大(表2)。对所有参考基因组染色体检测，发现peaks主要分布于基因间区，说明基因间区可能具有调节生物功能的潜质。其次为内含子和CDS区域，除此之外转录终止位点下游2k，转录起始位点上游2k较低(近启动子区)，5’-UTR和3’-UTR最低。我们同时得到了全基因组DNA甲基化Circos展示图。
2.3 DMRs和DMGs在基因区域的识别和认证
比较了大约克猪和皖南花猪全基因组DNA甲基化模式，共生成58283个差异甲基化区域，其中12086个超甲基化，46197个低甲基化(YY VS WH)。DMRs主要分布于内含子，外显子和CDS区域，转录终止位点下游2k，转录起始位点上游2k次之，5’-UTR和3’-UTR最低。DMRs的实验结果和之前报道相一致[23]。先前的研究定义启动子和基因本体均含有peaks区域为差异甲基化基因[24]。我们共识别1425个差异甲基化基因，其中447个上调，978个下调(YYVS WH)。其中1161个DMGs位于内含子区(387个上调，779个下调)，486个DMGs位于CDS区域(47个上调，439个下调)，167个DMGs位于2kb upstream区域(40个上调，127个下调)，229个DMGs位于2kb downstream区域(36个上调，193个下调)，116个DMGs位于3’UTR区域(9个上调，107个下调)，43个DMGs位于5’UTR区域(7个上调，36个下调)。可以看出高甲基化数量低于低甲基化数量(YY VS WH)。 同时基因可能同时存在于不同的区域内。我们同时得到了全基因组DNA甲基化染色体图谱，形象展示了DMRs的分布情况。
2.4聚类分析热图
近年来，越来越多的研究证实，基因表达调控机制很多，DNA甲基化只是其中之一。我们使用测序数据对所有样品进行聚类分析。首先，6个样本同一品种聚集在一起，说明同一品种的甲基化程度类似。皖南花猪的甲基化程度高于大约克猪(表7A)。表明DNA甲基化可能是影响皖南花猪和大约克猪肉质性状差异的潜在因素。
猪的启动子区域大约一半含有CGI。而启动子区CGI的DNA甲基化又经常和基因的转录活性有关。一般来讲，CGI上胞嘧啶的甲基化通过结合转录因子或改变染色质结构抑制基因转录。实验表明启动子区域和CGI区域的聚类分析热图结果和全基因水平一致。
2.5 DMGs的GO功能注释
利用上海伯豪生物有限公司相关软件进行大约克猪和皖南花猪的差异甲基化基因生物学分析。GO功能注释共涉及346个功能类别(P<0.05)，包含三个方面。其中细胞组分40个条目，占比例的11.56％，分子功能54个条目，占比例的15.61％，生物学功能252个条目，占比例的72.83％。生物学功能条目中有一些关于脂肪酸代谢过程、脂肪酸生物合成过程、脂质代谢过程、细胞脂质代谢过程和有机酸代谢过程(表3)。除此之外，我们针对甲基化上调和下调的情况分别做出排名前30的生物学功能展示图(P<0.05)。
表3大约克猪和皖南花猪背最长肌差异甲基化基因GO功能注释
2.6 DMGs的KEGG Pathway通路分析
利用上海伯豪生物有限公司相关软件进行大约克猪和皖南花猪的差异甲基化基因KEGG Pathway通路分析预测。实验结果显示差异甲基化基因显著富 集在277个pathways网络通路中，其中24个可能与肉质相关。包括PPAR信号通路、脂肪细胞因子信号通路、AMPK信号通路和调控脂肪细胞的脂解作用等。进一步揭示了猪肉质性状是一个多基因、多网络调控的性状(表4)。除此之外，我们针对甲基化上调和下调的情况分别做出排名前30的KEGGPathway通路分析展示图(P<0.05)。
表4大约克猪和皖南花猪背最长肌差异甲基化基因KEGG Pathway通路分析
2.7 MeDIP-Seq和RNA-Seq联合分析
DNA甲基化主要发生在基因启动子区CGI附近，CGI的甲基化将会显著抑制或者完全沉默基因的转录，进而影响蛋白质的生成。RNA-seq通过设定参数能准确的测出差异表达的基因，而甲基化和转录组又呈负相关的关系。因此，我们结合DNA甲基化和转录组数据进行关联分析，探索大约克猪和皖南花猪DNA甲基化和转录组之间的关系。
大约克猪和皖南花猪背最长肌DNA甲基化和转录组的联合分析，我们识别高甲基化对应低表达和低甲基化对应高表达的基因，其甲基化程度和转录的情况相反。已有的研究表明这些基因参与与肉质相关的遗传机制，进一步揭示了肉质性状为多基因调控的性状。
试验共识别差异甲基化基因1425个，差异表达基因347个。联合分析表明有80个基因存在负相关关系，其中RXRG、GPI、CPT2和GABARAPL1基因显著负相关。
关联总表为：correlation_all.txt。直接画图得到correlation_all.pdf，但是这图不能很直观地体现它们直接的相关性，所以根据图的结果进行调整。根据图(坐标轴在-3到3的范围内基因多)，筛选x，y轴。进一步筛选y轴：log(FoldChange_YY.WH)>0.5)或者log(FoldChange_YY.WH)<-0.5。筛选的关联表为：correlation_filter05.txt。筛选后的基因再标上颜色和(计算基因数)加上标注就得到：correlation_filter05.pdf注意：重复的基因根据FoldChange_YY.WH得分进行筛选。筛选显著性差异得到的表格：second_correlation.txt，图第二象限的log(FoldChange_YY.WH)>1并且edgeR.logFC<-1；fourth_correlation.txt，图第四象限的log(FoldChange_YY.WH)<-1并且edgeR.logFC>1。
2.8焦磷酸测序
随机选取7个差异甲基化基因进行焦磷酸测序认证，证明DNA甲基化免疫共沉淀的准确性。7个基因分别为ACOX1、GABARAPL1、LEP、PPARD、GNB3、APOC3、NR6A1。pyrosequencing结果和MeDIP-seq结果相一致且差异显著(P<0.05)，表明MeDIP-Seq测序获得结果是准确可靠的。
3讨论
本试验以皖南花猪和大约克猪背最长肌为样本，绘制出一个综合的全基因组DNA甲基化模式图。先前的研究已经证实，启动子区域的甲基化是一个重要的表观遗传学调控机制并沉默基因的表达。我们的实验验证了这一点，并且证实启动子区域的甲基化水平相对其他区域保持较低的状态，而基因本体/蛋白质编码区保持较高的状态(定义基因本体为基因转录起始位点至转录终止位点的部分)。基因本体的甲基化同时也被认为一种抑制信号阻碍转录的延伸，并且在拟南芥和哺乳动物细胞中得到验证。同时，有文章报道红原鸡和艾维茵肉鸡肝脏和肌肉组织全基因组DNA甲基化研究，在近启动子区域，基因的表达水平和DNA的甲基化水平呈负相关。
皖南花猪和大约克猪全基因组甲基化图谱的比较揭示了肌肉分化的过程，展示了不同的DNA甲基化模式图。和之前报道的文章一致，包含一些显著的生 物学通路。包括PPAR信号通路、MAPK信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Wnt信号通路、胰岛素信号通路和调控脂肪细胞的脂解作用。其中，PPAR信号通路是关于肌肉分化和肉质形成过程最重要的信号通路之一。PPAR信号通路作为脂肪传感器调节脂肪酸代谢酶的转录。有PPARα，PPARβ和PPARγ三种亚型。PPARα主要集中在脂肪酸代谢较高的组织中，如肝脏，棕色脂肪，心脏，肾脏和骨骼肌的表达。同时PPARα通过调节靶基因的表达调节许多生理功能包括能量代谢、生长发育等。此外，它还通过调节脂质代谢的生物受体调节细胞生长、分化和凋亡。PPARβ广泛表达于多种组织，PPARγ调节脂肪细胞的分化，在糖代谢中发挥了重要作用。PPARs结合RXRs受体才能完成转录活动。通过对皖南花猪和大约克猪肉品质性状DNA甲基化在的Pathway显著性富集分析，证明DNA甲基化可能是导致肌肉分化的重要原因。
结合GO功能分析和Pathway通路显著富集分析，我们筛选了几个肉品质性状相关基因，包括ACOX1、APOC3、LEP、PPARD、ADIPOQ、RXRG、GPI、CPT2、CROT、AKT2等。
脂酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)是ACOX基因家族的一员，主要参与过氧化物酶体中脂肪酸的氧化分解过程。ACOX1是脱氢反应的限速酶，参与了过氧化物酶体脂肪酸β氧化第一步。同时ACOX1酶极度保守，拥有相对独特的表达方式，转录生成mRNA及其蛋白质的表达主要分布于肝脏、肾脏，其次是大脑和脂肪组织。充分证明ACOX1基因在脂肪沉积和脂肪代谢方面发挥着潜在的作用。同时，许多之前的报道也证明ACOX1基因在日增重、初生重、背膘厚和脂肪酸组成等这些重要的数量遗传性状发挥重要作用。我们的实验表明ACOX1基因在启动子区域，大约克猪甲基化水平高于皖南花猪，即低甲基化水平的皖南花猪促进ACOX1的表达。
载脂蛋白C3(APOC3)基因位于9号染色体。被认为通过调节甘油三酯(TG)的水平影响脂肪代谢和沉积。惠等人研究了可乐猪和江口萝卜猪七个组织中APOC3的表达情况，其中表达量最高的在肝脏，其次是皮下组织和背最长肌。APOC3是构成高密度脂蛋白胆固醇(HDL)及富甘油3酯脂蛋白(TRL)的重要基因，在肝脏和小肠合成APOC3，进而抑制脂类相关代谢酶的活性，阻断 肝脏内对应的受体与酶类结合，从而影响脂类的代谢。
LPIN1基因从两个方面影响脂肪的合成。一方面，LPIN1基因编码磷脂酸磷脂酶，参与磷脂和甘油三酸脂的合成。另一方面，调节脂肪细胞分化、作为激活因子诱导脂肪形成。Leptin基因是一种由瘦素基因编码的蛋白质激素，其由脂肪细胞分泌产出，形成一种分子量为16ku的蛋白质类激素。在脂肪沉积、能量代谢、体重生长等众多生理活动中具有重要的调节作用。张等人对脂肪五个特定组织启动子区域的CpG位点进行DNA甲基化转录分析，检测了在不同组织mRNA的表达水平，结果表明瘦素的表达程度最高。乙酰辅酶A(ACACB，acetyl-Co A carboxylase beta)是实验筛选出的差异甲基化表达基因，在细胞内合成，同时也是脂肪酸合成途径的限速酶，是脂肪细胞获取脂肪酸的另外一种重要途径。肉碱O辛基转移酶(CROT)是一种过氧化物酶，通过耦合短链脂肪酸形成肉毒碱进入线粒体基质并联合肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPT1A)进行脂肪酸的氧化和调节脂肪酸的代谢。硬脂酰-Co A脱氢酶(Stearoyl-CoA desaturase，SCD)是一种可以催化合成单不饱和脂肪酸的含铁酶。主要存在于哺乳动物脂肪组织和乳腺中。研究表明，SCD可以对骨骼肌进行新陈代谢调节，同时可以影响胰岛素敏感度及线粒体脂肪酸氧化、氧化肌纤维中神经酰胺的新生等。除此之外，SCD也是瘦素信号通路的重要调节成分，是最重要的瘦素调节基因之一，对瘦素可能具有一定的下调作用。GPI基因在细胞糖酵解和糖质新生发挥重要作用。何等人研究证实GPI不仅能参与信号传导，而且参与“传统”的一些受体信号转导。所以它可能可以通过相关信号通路调节糖酵解和糖质新生。AKT2基因可以介导调节不同的生长因子和激素，参与种猪的成长、发育、代谢等调节过程。
结合本次MeDIP-seq和之前本课题组RNA-seq的试验结果，进行DNA甲基化和表达谱的联合分析，筛选既有甲基化差异又有表达差异的基因。结果表明，大约克猪和皖南花猪相比有4个差异甲基化和表达基因(P<0.05)。
在四个基因中，RXRG基因是一个与猪肌内脂肪沉积相关的基因，位于4号染色体上。RXRG通过结合特定应答区域靶定基因，进而调控细胞分化和组织形态学变化。RXRG参与PPAR信号通路，是一种核受体蛋白，在细胞分化，发育和代谢(碳水化合物，脂类，蛋白质)发挥着重要作用。在我们的试验中，皖南花 猪RXRG基因表现为低甲基化，但RXRG基因表现为基因的过表达。RXRG基因的甲基化，在一定程度上，可能参与肉质性状调节，如脂肪沉积，脂肪酸代谢和生物合成，脂肪细胞分化等调控。2006年Hale分析了斑马鱼RARG基因对胚胎发育的影响。
GPI基因是之前的报道过的与肉质性状相关的差异表达基因。在细胞糖酵解和糖异生中起重要作用。2012年He的研究表明GPI不仅可以参与信号转导，同时还参与某些“传统”的受体的信号转导。因此它可能通过相关信号通路调节糖酵解和糖异生。我们的实验结果表明，皖南花猪GPI基因低甲基化水平的可能影响肉质性状。
CPT2是脂肪酸代谢途径中的关键基因，依赖其关键限速酶参与的脂肪酸氧化。CPT2还可以调节脂肪酸的分解和能源供应。同时，CPT2还受到各种细胞因子，如丙二酰-CoA的调节。无论是在转录前，翻译或转录后水平，都表明体内的脂肪堆积是由CPT2严格调控。据报告，在猪肉，鸡肉，鱼等饲料中添加左旋肉碱可以帮助改善肉质，提高风味。CPT2是在猪身体显著的表达的基因。主要分布于心脏，肝脏，脾脏，骨骼肌等。我们实验结果和以前的研究相一致。CPT基因在猪脂肪沉积过程中发挥重要作用，并在肌肉组织和脂肪组织中具有不同的表达模式。这与我们的结果一致。
GABARAPL1是GABARAP家族的一员。2014年刘发现GABARAPL1存在一些结构域由该基因启动子区的上游胰岛素信号调节，称为胰岛素应答元件(IRE)。并证实胰岛素是GABARAPL1的转录水平的最重要的调控因子。研究表明，GABARAPL1和糖酵解的潜力(GP)有关，并且受到激素水平的调节，如胰岛素、胰高血糖素和肾上腺素等。同时和各种肉质性状也紧密相关。生理生化指标和肌肉肉质性状相关分析表明，GP对最终肉质形成的影响有限。刘等报道胰岛素能抑制小鼠原代肝细胞GABARAPL1的表达水平，这种表达水平的增加可以被胰岛素抑制剂LY294002抑制。在我们的实验中，GABARAPL1在皖南花猪中是超甲基化和低表达的基因，GABARAPL1基因可能通过胰岛素信号的调控间接影响肉质性状。
4结论
本试验绘制了全基因组DNA甲基化图谱，比较了大约克猪和皖南花猪背最长肌DNA甲基化对猪肉品质的影响。共识别1425个差异甲基化基因。DNA甲基化和转录组测序的联合分析证实了甲基化影响基因的表达，并获得4个猪肉质性状的功能候选基因RXRG、GPI、CPT2和/或GABARAPL1。筛选出的候选基因及GO功能注释、KEGG Pathway通路分析为今后猪的表观遗传学探索提供一个良好的参考作用。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (4)

1.影响猪肉质性状的功能候选基因，其特征在于，所述影响猪肉质性状的功能候选基因是RXRG、GPI、CPT2和/或GABARAPL1。
2.影响猪肉质性状的功能候选基因的筛选方法，包括以下步骤：
(1)选取肉质性状差异大的两个极端猪种的背最长肌，提取DNA，独立建库；
(2)采用高通量的全基因组DNA甲基化免疫共沉淀测序技术对样本DNA库进行全基因组DNA甲基化测序；
(3)获得两个极端猪种的全基因组DNA甲基化水平的图谱，并筛选到差异甲基化基因；
(4)对差异甲基化基因进行GO功能注释和KEGG Pathway分析，筛选出与脂肪酸生成和分解等肉质性状相关的功能基因和调控通路；
(5)结合MeDIP-seq和RNA-seq的试验结果，进行DNA甲基化和表达谱的联合分析，获得猪肉质性状的功能候选基因。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述两个极端猪种分别是皖南花猪和大约克猪。
4.如权利要求1所述的影响猪肉质性状的功能候选基因在猪肉质性状研究中的应用。
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