CN109837302A

CN109837302A - 一种敲除pd1的靶向cd20的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

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Publication number: CN109837302A
Application number: CN201711196439.6A
Authority: CN
Inventors: 曾滢; 张长风; 吴咏东
Original assignee: Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-25
Filing date: 2017-11-25
Publication date: 2019-06-04

Abstract

本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将靶向CD20的嵌合抗原受体CAR‑CD20的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。所述T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性地杀伤CD20阳性肿瘤细胞的性能，持久地维持细胞的活力和杀伤力。

Description

一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CA R改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫***，对肿瘤细胞进行杀伤，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。

目前CAR-T技术在CD19阳性血液瘤(如B细胞淋巴瘤、急慢性B淋巴细胞白血病)中取得了令人瞩目的效果。但由于同类的肿瘤常表达各不相同的免疫表型，举例来说，当肿瘤细胞出现CD19阴性逃逸，即，存在不表达CD19的肿瘤细胞，则CD19靶点失效，而CART-CD19无法再发挥抗肿瘤效果。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫检查点抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。因此，有必要提供能靶向恶性肿瘤的其他广泛表达靶点的CAR-T细胞且可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向CD20嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，持久地维持细胞的活力和杀伤力。

第一方面，本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD20的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向CD20的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPX LD-CAR-CD20重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。

可选的，所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可选的，所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ I D NO：5所示的核苷酸序列。

可选的，所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:5具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。

本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-CD20表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。

可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

可选的，所述信号肽的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

可选的，所述信号肽的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SE Q IDNO:7所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:8具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:7。

本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向CD20的单链抗体与肿瘤上的CD20结合。

可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、C D5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

进一步可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区。

可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。

本发明中，所述跨膜区用于固定所述嵌合抗原受体CAR-CD20。

可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。

进一步可选的，所述跨膜区包括CD8跨膜区。

可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:11。

本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。

可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、C D27信号区、OX40信号区、CD27信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。

可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区和CD3ζ信号区。

可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:13所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:13。

可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:16具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。

可选的，所述靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列包含了所述信号肽的编码基因，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。

所述CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-CD20的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。

可选的，所述靶向嵌合抗原受体CAR-CD20的氨基酸序列包括如SEQ ID N O：4所示的氨基酸序列。

可选的，所述包装所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒，得到重组慢病毒包括：

将所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述重组慢病毒。

可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2。

所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。

可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞。

进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。

重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。

重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。

为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体***都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒***(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒***(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒***(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒***的慢病毒包装***在使用。

可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。

可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。

进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。

可选的，所述敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因采用电转染和Crispr/Cas9技术敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因。

进一步地，所述敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，包括以下步骤：

将所述Cas9的编码基因***至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-cas9重组质粒，以所述pcDNA3.1-cas9重组质粒为模板进行体外转录得到Cas9mRNA；

提供靶向PD1基因的sgRNA序列；将所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列***至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒，以所述pc DNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒为模板进行体外转录得到sgRNA；

将所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA序列与所述嵌合抗原受体T细胞进行混合，并置于电转仪中进行电转，完成所述嵌合抗原受体T细胞上PD1基因的敲除。

可选的，所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

可选的，所述Cas9mRNA和所述PD1基因的sgRNA的质量比为1:1-1:5。

进一步可选的，所述Cas9mRNA和所述PD1基因的sgRNA的质量比为1:3。

本发明中，步骤(5)中，获得的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，是在步骤(4)中的嵌合抗原受体T细胞的基础上敲除了T细胞的PD1基因。步骤(4)中的嵌合抗原受体T细胞也具有一定的靶向CD20的作用，但可能会出现肿瘤细胞逃脱免疫监视的现象。敲除PD1基因获得的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的靶向性更强，且避免了肿瘤细胞逃脱免疫监视的情况。

本发明第一方面提供的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，通过制备靶向CD20的嵌合抗原受体得到嵌合抗原受体T细胞，并敲除T细胞上的PD1基因制得敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，该制备方法有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，使其具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，适用于CD20阳性肿瘤细胞的杀伤，尤其适用于杀伤不表达CD19的肿瘤细胞，避免肿瘤细胞CD19阴性逃逸时CART-CD19无法再发挥抗肿瘤效果。

在本发明的其他实施方式中，也可以采用以下方法来制备敲除PD1的靶向C D20的嵌合抗原受体T细胞，包括以下步骤：

(1)提供CD3阳性T淋巴细胞，敲除所述CD3阳性T淋巴细胞的PD1基因，得到敲除PD1的CD3阳性T淋巴细胞；

(2)提供靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD20的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向CD20的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)将所述CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPX LD-CAR-CD20重组质粒；

(4)包装所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒，得到重组慢病毒；

(5)将所述重组慢病毒转染所述敲除PD1的CD3阳性T淋巴细胞，得到敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。

本发明中，所述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备过程中，敲除过程可以针对所述CD3阳性T淋巴细胞时进行，也可以在获得靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞后进行。在本发明中对敲除顺序不作限定，只要可以达到获得敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的目的即可。

第二方面，本发明提供了采用如第一方面所述的制备方法制备得到的敲除P D1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，所述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞不含PD1基因，所述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞包括靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20，所述靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD20的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向CD20的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。

其中，所述靶向CD20的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的氨基酸序列如本发明第一方面部分所述，在此不再赘述。

可选的，所述靶向嵌合抗原受体CAR-CD20的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-CD20的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:6具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:4。

优选地，所述嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列包含了所述信号肽的编码基因，所述信号肽能指导所述嵌合抗原受体CAR-CD20表达到细胞表面，但信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。

本发明第二方面提供的所述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，可以专一性的靶向CD20，在CAR-CD20受体与CD20结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，尤其是杀伤表达CD20的恶性肿瘤(包括B细胞恶性肿瘤等)，特别适用于杀伤不表达CD19的肿瘤细胞，避免肿瘤细胞CD19阴性逃逸时CART-CD19无法再发挥抗肿瘤效果。此外，基于靶向CD20的单链抗体为人源化单链抗体，这使得该T细胞避免引起人机体的免疫反应，持久地维持细胞的活力和杀伤力；所述T细胞敲除了PD1基因，可以避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，使其具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的制备方法制备得到的或如第二方面所述的一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。尤其适用于表达CD20的恶性肿瘤。特别适用于B细胞恶性肿瘤(如B细胞淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等)的预防、诊断和治疗，特别是与幼稚型淋巴细胞相关的恶性肿瘤。

所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的制备方法制备得到的或如第二方面所述的一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。

本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-CD20重组质粒的质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的阳性率；图2中(a)为阴性对照组，图2中(b)为本发明实施例提供的敲除PD1的靶向C D20的嵌合抗原受体T细胞的实验组。

图3为本发明实施例提供的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤效果图。

图4为本发明实施例提供的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞***小鼠的效果图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例一

一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备嵌合抗原受体CAR-CD20的基因序列

分别制备信号肽、靶向CD20的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：8所示，所述靶向CD20的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：5所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：12所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ ID NO：14所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示。

通过PCR的方法将上述信号肽、靶向CD20的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因，所述CAR-CD20的编码基因如SEQ I D NO：2所示。

(2)构建pWPXLd-CAR-CD20重组质粒

将CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体的BamH1和EcoR1酶切位点之间，并在pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-CD20的编码基因的5’端添加起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的p WPXLd-CAR-CD20重组质粒。

(3)重组慢病毒构建

将pWPXLd-CAR-CD20重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×10⁸个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。

(4)嵌合抗原受体T细胞的制备

a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离

PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞

取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。

c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞

取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到嵌合抗原受体T细胞。

d)敲除PD1基因

将所述Cas9的编码基因***至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-cas9重组质粒，以所述pcDNA3.1-cas9重组质粒为模板，利用mMESSAGE T7试剂盒进行体外转录得到Cas9mRNA；

提供靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列，其序列如SEQ ID NO：3所示；将所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列***至pcDNA3.1载体中，得到pc DNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒，以所述pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒为模板进行体外转录得到sgRNA；

将所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA序列与上述得到嵌合抗原受体T细胞进行混合，并置于电转仪中进行电转，敲除T细胞的PD1基因；将电转后的T细胞进行培养，得到敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。

利用流式细胞仪测定上述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的PD1表达量，计算敲除率，结果发现敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞中P D1基因的敲除率达72％。

为了评估本发明所描述的上述方法制备的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的效果，进行如下效果实施例。

效果实施例一：评估本发明所制备的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的阳性率

将经过本发明方法制备敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)，使用流式细胞仪检测其阳性率，结果如图2所示，其中图2中(a)为阴性对照组，即未经制备的T细胞，图2中(b)为实验组，即为本发明制得的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。由图2中(a)与(b)比较可得到，本发明所制备的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的阳性率为34.7％。

效果实施例二：评估敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明方法制得的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(简写为CAR-T-CD20(PD1KO)组)、未敲除PD1的嵌合抗原受体T细胞(简写为CAR-T-CD20)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)的体外肿瘤杀伤效果进行比较，具体的：在体外将效应细胞(敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞或未经制备的T淋巴细胞)与靶细胞(Nalm-6细胞，急性人B淋巴白血病细胞)按数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1比例，在37℃，5％CO₂下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果如图3所示。

从图3中可看出，添加的CAR-T-CD20(PD1KO)细胞越多，它们对肿瘤细胞的杀伤力越强。经过本发明所述的方法制备的靶向CD20的CAR-T-CD20(PD1KO)细胞的肿瘤杀伤力均在20％以上，甚至可达80％，远远高于阴性对照组，此外，在效靶比超过1：1后，CAR-T-CD20(PD1KO)组对肿瘤的杀伤能力开始明显高于未敲除PD1的CAR-T-CD20组。以上结果说明，经本发明方法制备的敲除了PD1基因后的、敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞具有高效且特异性的肿瘤杀伤能力，可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视。

效果实施例三：评估敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明方法制备的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞(简写为CAR-T-CD20(PD1KO)组)、未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)以及生理盐水(空白对照组)，在小鼠肿瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个Nalm-6细胞(n＝9)，绘制小鼠的生存曲线，结果如图4所示。从图4可以看出，经过本方法制备的敲除PD1的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞使得小鼠在培养40天以后存活率可稳定在65％，并可维持70天以上，远远超过阴性对照组和空白对照组。图4的结果表明，经过本方法制备的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞能够更好的保护小鼠免于因肿瘤导致的死亡。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

1 5 10 15

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

20 25 30

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

35 40 45

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

50 55 60

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

65 70 75 80

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

85 90 95

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

115 120 125

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

130 135 140

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

145 150 155 160

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

165 170 175

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

180 185 190

<210> 2

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 120

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 180

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 240

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 300

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 360

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 420

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 480

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 540

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 600

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 660

acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 720

gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 780

gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 840

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 900

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 960

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 1020

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1080

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1140

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1200

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1260

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1302

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacgaagctc tccgatgtgt tgg 23

<210> 4

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

1 5 10 15

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

20 25 30

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

35 40 45

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

50 55 60

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

65 70 75 80

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

85 90 95

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

115 120 125

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

130 135 140

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

145 150 155 160

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

165 170 175

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr

180 185 190

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

195 200 205

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

210 215 220

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

225 230 235 240

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

245 250 255

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

260 265 270

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

275 280 285

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

290 295 300

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn

305 310 315 320

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

325 330 335

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

340 345 350

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

355 360 365

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

370 375 380

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

385 390 395 400

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

405 410

<210> 5

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 60

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 120

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 180

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 240

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 300

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 360

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 420

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 480

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 540

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 573

<210> 6

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 60

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 120

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 180

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 240

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 300

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 360

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 420

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 480

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 540

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 600

acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 660

gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 720

gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 780

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 840

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 900

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 960

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1020

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1080

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1140

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1200

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1242

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro

20

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

<210> 9

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

<210> 10

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatc 138

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 60

ctttactgc 69

<210> 13

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 14

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims

1.一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(2)将所述CAR-CD20的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD20重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒，得到重组慢病毒；

2.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述胞内信号区包括4-1BB信号区和CD3ζ信号区。

3.如权利要求1或2所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，包括：

提供靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列；将所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列***至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒，以所述pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒为模板进行体外转录得到sgRNA；

将所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA与所述嵌合抗原受体T细胞进行混合，并置于电转仪中进行电转，完成所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因的敲除。

5.如权利要求4所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求4所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和所述PD1基因的sgRNA的质量比为1:1-1:5。

7.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述包装所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒，得到重组慢病毒包括：

8.如权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞不含PD1基因，所述敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞包括靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20，所述靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD20的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向CD20的单链抗体包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

9.如权利要求8所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

10.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的或如权利要求8-9任一项所述的敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。