CN109825533A

CN109825533A - 一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基及其发酵培养方法

Info

Publication number: CN109825533A
Application number: CN201910118281.3A
Authority: CN
Inventors: 张作法; 吕国英; 蔡为明; 程俊文; 陈建飞; 苗立祥
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2039-02-14
Also published as: CN109825533B

Abstract

本发明公开了一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基及其发酵培养方法，其中发酵培养基按重量份计，由如下组分组成：大豆芽浆20‑30份，小麦纤维素5‑10份，三叶青酶解物5‑10份，桑枝和青钱柳提取物2‑3份，氯化钙0.05‑0.1份、乳糖0.3‑0.5份，葡萄糖1‑3份，水杨酸0.02‑0.05份，水80‑100份。本发明的发酵培养基有助于提高最终产品桑黄发酵产物中活性成分的含量和活性。制备的高活性桑黄发酵产物对D‑半乳糖诱导小鼠亚急性氧化损伤具有明显的保护作用。

Description

一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基及其发酵培养方法

技术领域

本发明涉及一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基及其发酵培养方法。

背景技术

桑黄(Inonotus sanghuang)寄生于桑树上，其子实体菌盖多数叠生在一起，马蹄形或不规则形，幼使柠檬黄至金黄色，老时土黄色或黄棕色。桑黄是一种珍贵的多年生大型药用木腐真菌，通常生长在桑属植物上。桑黄被现代人称为“森林黄金”。桑黄是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。我国是野生药用真菌出口大国，但目前对桑黄菌的研究还处于初步阶段，技术尚未成熟。由于我国有限的桑黄野生资源生长期长，功效成分稳定性差，且被过分采集，越来越少，难以成为稳定的工业产品来源，远远不能满足市场的需求。利用生物发酵技术制备生物制品，是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径和实现有用代谢产物开发利用的基础。和传统子实体栽培相比，通过液体发酵制备桑黄次生代谢产物具有生产周期短、代谢产物多、质量易于控制、规模化生产等优点。用液体发酵制备桑黄次生代谢产物的发酵培养基具有重要意义，其能够直接影响桑黄次生代谢产物的活性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基及其发酵培养方法，能够有效提高桑黄发酵产物的活性。

所采用的技术方案为：

一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基，按重量份计，由如下组分组成：大豆芽浆20-30份，小麦纤维素5-10份，三叶青酶解物5-10份，桑枝和青钱柳提取物2-3份，氯化钙0.05-0.1份、乳糖0.3-0.5份，葡萄糖1-3份，水杨酸0.02-0.05份，水80-100份。

进一步地，所述大豆芽浆是通过如下方法制备的：选用粒型完整的大豆，放入全自动豆芽机中喷淋催芽，当大豆芽头露至4-5mm时，停止发芽；将大豆芽∶水按重量比1∶1混合，高速打浆得到大豆芽浆。

进一步地，所述桑枝和青钱柳提取物是通过如下方法制备的：分别将桑枝和青钱柳叶粉碎，按重量比1:1比例混合，加入20-30倍重量的70vol％的乙醇溶液，在40-50℃的摇床中震荡提取10小时，过滤后得到上清液，上清液减压浓缩后，真空冷冻干燥后，得到桑枝和青钱柳提取物。

进一步地，所述三叶青酶解物是通过如下方法制备的：将三叶青根茎，干燥，打粉，加入10倍重量的去离子水，加入体积质量比为0.1-0.2ml/100g淀粉酶，70℃酶解3-5小时，得到三叶青酶解物。

在上述技术方案中，大豆芽浆的作用在于：发芽大豆的蛋白质的V_B2、V_B6、V_C等含量明显提高；胰蛋白酶抑制剂和植酸等抗营养因子也因发芽被分解，大豆异黄酮、卵磷脂、皂角苷等含量也不同程度地增加，从而发芽大豆的营养价值和药用价值都得到了提高；

三叶青酶解物的作用在于：利用淀粉酶对三叶青中大量淀粉的酶解糖化，水解生成为容易被菌种吸收的麦芽糖和葡萄糖，使有效成分更好的释放。

桑枝和青钱柳提取物的作用在于：可以提高菌丝体生物量。

乳糖的作用在于：可以促进多糖的合成。

氯化钙和水杨酸的作用在于：可以促进三萜类化合物的合成。

一种制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养方法，包括如下步骤：

(1)将活化后的桑黄菌种接种于种子液体培养基中进行桑黄发酵培养3-7天，得到桑黄液体种子液；

(2)向上述方案任一所述的发酵培养基中先接入占所述发酵培养基的体积为1％-5％的所述桑黄液体种子液，在温度24-27℃条件下培养5-8天，发酵结束，发酵液经真空冷冻干燥，得到高活性桑黄发酵产物。

进一步地，步骤(1)所述种子液体培养基按重量份计，由如下组分组成：发芽大豆20份,葡萄糖5份,硫酸镁0.05份,磷酸二氢钾0.02份。

进一步地，步骤(1)所述桑黄菌种选自浙江省杭州市千岛湖的I.sanghuang。

本发明的有益效果在于：

(1)通过发酵将发酵培养液中的营养成分和有效成分更好的进行生物降解和转化，有助于提高最终产品桑黄发酵产物中活性成分的含量和活性。

(2)制备的高活性桑黄发酵产物对D-半乳糖诱导小鼠亚急性氧化损伤具有明显的保护作用。

附图说明

图1为桑黄发酵产物对小鼠血清氧化指标MDA的影响图。

图2为桑黄发酵产物对小鼠血清氧化指标T-AOC的影响图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1

制备高活性桑黄发酵产物的方法，按以下步骤进行：

(1)配置发酵培养基，发酵培养基的组成：大豆芽浆20g/L，小麦纤维素5g/L，三叶青酶解物5g/L，桑枝和青钱柳提取物2g/L，氯化钙0.05g/L、乳糖0.3g/L，葡萄糖1g/L，水杨酸0.02g/L，水80g/L。

其中，大豆芽浆的制备：选用粒型完整的大豆，放入全自动豆芽机中喷淋催芽，当大豆芽头露至4-5mm时，停止发芽；将大豆芽：水质量比1:1，高速打浆备用。

桑枝和青钱柳提取物的制备：分别将桑枝和青钱柳叶粉碎，按重量比1:1的比例混合，加入20-30倍量(重量)的70vol％的乙醇溶液40-50℃的摇床中震荡提取10小时，过滤后得到上清液，上清液减压浓缩后，真空冷冻干燥后得到提取物。

三叶青酶解物：将三叶青根茎，干燥，打粉，加入10倍量的去离子水，加入体积质量比为(0.1-0.2ml/100g)淀粉酶，70℃酶解3-5小时，备用。

(2)桑黄液体发酵培养；将活化后的桑黄菌种接种于种子液体培养基中进行桑黄发酵培养3-7天，得桑黄液体种子液；其中种子液体培养基的组成为：1L中发酵液中含有发芽大豆20g,葡萄糖5g,硫酸镁0.05g,磷酸二氢钾0.02g。以及所选的桑黄菌种选自如下：

采集地点/菌种来源	寄主/栽培原料	ITS比对结果	GenBank序号
				千岛湖，杭州，浙江省	桑树	I.sanghuang	HM584808

备注：ITS(Internal Transcribed Spacer)鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。

(3)液体发酵培养：向步骤(1)中的发酵培养基中先接入占该发酵培养基体积1％-5％的桑黄液体种子液，在温度24-27℃条件下培养5-8天，发酵结束，发酵液经真空冷冻干燥，得到高活性桑黄发酵产物。

实施例2

参照实施例1，与实施例1不同的是，发酵培养基的组成：大豆芽浆25g/L，小麦纤维素7g/L，三叶青酶解物8g/L，桑枝和青钱柳提取物3g/L，氯化钙0.08g/L，乳糖0.4g/L，葡萄糖2g/L，水杨酸0.04g/L，水90g/L。

实施例3

参照实施例1，与实施例1不同的是，发酵培养基的组成：大豆芽浆30g/L，小麦纤维素10g/L，三叶青酶解物10g/L，桑枝和青钱柳提取物3g/L，氯化钙0.1g/L，乳糖0.5g/L，葡萄糖3g/L，水杨酸0.05g/L，水100g/L。

对比例1

参照实施例2，与实施例1不同的是，发酵培养基的组成中，将桑枝和青钱柳提取物改成桑枝提取物。

桑枝提取物的制备：将桑枝粉碎，加入20-30倍量(重量)的70vol％的乙醇溶液40-50℃的摇床中震荡提取10小时，过滤后得到上清液，上清液减压浓缩后，真空冷冻干燥后得到提取物。

对比例2

参照实施例2，与实施例1不同的是，发酵培养基的组成中，将桑枝和青钱柳提取物改成青钱柳提取物。

桑枝提取物的制备：将青钱柳叶粉碎，加入20-30倍量(重量)的70vol％的乙醇溶液40-50℃的摇床中震荡提取10小时，过滤后得到上清液，上清液减压浓缩后，真空冷冻干燥后得到提取物。

对实施例2、对比例1-2得到的桑黄发酵产物进行菌丝体得率的计算，参见表1。

表1

	菌丝体得率
		实施例2	4.8％
对比例1	4.0％
		对比例2	4.1％

实施例5

将实施例2得到的高活性桑黄发酵产物进行如下试验：

将实施例2的桑黄发酵产物(后简称发酵物)干燥粉碎后备用，60只ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药物组、发酵物高、中、低剂量组(18.0g/kg,12.0g/kg,6.0g/kg)，每组10只，除正常对照组外，其余5组采用D-半乳糖皮下注射法制备小鼠亚急性过氧化损伤模型，即每天定时颈背部皮下多点注射120mg/kg的D-半乳糖，正常对照组以注射用生理盐水代替，连续42d。在造模的同时(首次注射D-半乳糖后次日开始灌胃给药，按20ml/kg体重灌胃)，发酵物各组灌胃相应剂量，阳性对照组给予维生素E 200mg/kg，正常对照组和模型组给予饮用水。末次给药后禁食24h，摘眼球取血，取肝脏和脑。采用总蛋白定量测定试剂盒测定肝脏蛋白浓度。按照试剂盒说明的方法测定血液和肝组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)的含量。测试结果参见表2，以及图1和图2所示。

表2发酵物对小鼠肝组织T-AOC，GSH和SOD含量的影响

如图1和图2所示,与正常对照组相比，模型组血清中MDA显著升高，T-AOC显著降低，发酵物各剂量组MDA含量显著降低，T-AOC无明显变化。阳性组MDA和T-AOC均无统计学差异。与模型组相比，发酵物各剂量组及阳性组血清中MDA含量显著降低，T-AOC水平显著升高。

如表2所示，与正常对照组相比，模型组和发酵物各剂量组小鼠肝组织中GSH水平无明显变化，模型组T-AOC和SOD酶活力呈现下降趋势。发酵物6.0和12.0g/kg剂量组SOD无明显变化，发酵物高剂量组SOD活力下降。阳性组T-AOC和GSH呈现明显上升，SOD酶活力呈上升趋势，但无统计学差异。与模型组相比，阳性组GSH和SOD活力显著升高，T-AOC升高，但无统计学差异。发酵物各剂量组小鼠肝组织中GSH水平无明显变化，发酵物高剂量组T-AOC略有上升，SOD酶活力显著升高，具有统计学差异(P<0.05)。

因此，桑黄发酵产物在6.0，12.0和18.0g/kg剂量下对D-半乳糖诱导小鼠亚急性氧化损伤具有明显的保护作用。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基，其特征在于，按重量份计，由如下组分组成：大豆芽浆20-30份，小麦纤维素5-10份，三叶青酶解物5-10份，桑枝和青钱柳提取物2-3份，氯化钙0.05-0.1份、乳糖0.3-0.5份，葡萄糖1-3份，水杨酸0.02-0.05份，水80-100份。

2.根据权利要求1所述的用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基，其特征在于，所述大豆芽浆是通过如下方法制备的：选用粒型完整的大豆，放入全自动豆芽机中喷淋催芽，当大豆芽头露至4-5mm时，停止发芽；将大豆芽∶水按重量比1∶1混合，高速打浆得到大豆芽浆。

3.根据权利要求1所述的用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基，其特征在于，所述桑枝和青钱柳提取物是通过如下方法制备的：分别将桑枝和青钱柳叶粉碎，按重量比1:1比例混合，加入20-30倍重量的70vol％的乙醇溶液，在40-50℃的摇床中震荡提取10小时，过滤后得到上清液，上清液减压浓缩后，真空冷冻干燥后，得到桑枝和青钱柳提取物。

4.根据权利要求1所述的用于制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养基，其特征在于，所述三叶青酶解物是通过如下方法制备的：将三叶青根茎，干燥，打粉，加入10倍重量的去离子水，加入体积质量比为0.1-0.2ml/100g淀粉酶，70℃酶解3-5小时，得到三叶青酶解物。

5.一种制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)向权利要求1-4任一所述的发酵培养基中先接入占所述发酵培养基的体积为1％-5％的所述桑黄液体种子液，在温度24-27℃条件下培养5-8天，发酵结束，发酵液经真空冷冻干燥，得到高活性桑黄发酵产物。

6.根据权利要求5所述的制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)所述种子液体培养基按重量份计，由如下组分组成：发芽大豆20份,葡萄糖5份,硫酸镁0.05份,磷酸二氢钾0.02份。

7.根据权利要求5所述的制备高活性桑黄发酵产物的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)所述桑黄菌种选自浙江省杭州市千岛湖的I.sanghuang。