CN109819892B - 一种草果优良单株的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种草果优良单株的组织培养方法，它涉及植物组织培养技术领域。它包括如下步骤：步骤一、优良单株选择；步骤二、外植体的选择；步骤三、外植体的处理与消毒；步骤四、诱导培养；步骤五、增殖培养；步骤六、生根培养；步骤七、炼苗移栽。本发明有益效果为：本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，利用植物组织培养方法建立了草果的快速繁殖体系，为草果良种繁育与推广应用提供了技术保障，是解决草果生产中优质种苗短缺以及提升草果产业建设质量的有效途径。本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，采用无性繁殖方式培育无性系苗木，培育苗木具有良好的遗传稳定性，能将优良单株上的优良性状完全地遗传给无性系后代。

Description

一种草果优良单株的组织培养方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种草果优良单株的组织培养方法。
背景技术
草果(Amomum tsao-ko revost et Lemaire)是姜科豆蔻属多年生草本植物，生长于南亚热带及中亚热带的热带雨林、季雨林中。主要分布于云南、广西、贵州、海南、四川、福建，以及越南、老挝北部的部分地区。云南是草果主要栽培地，草果栽培已有1000多年的历史，主要栽培于南部、东南部、西南部和西部，包括红河、文山、西双版纳、普洱、德宏、保山、怒江7州(市)31个县(市)，其中发展最快、产量最高的是红河州的金平县、文山州马关县等。草果具有特殊浓郁的辛辣香味，能祛除腥气，是烹调佐料中的佳品。其味辛性温，有温中健胃、消食顺气、祛寒祛湿的功能，用于治疗心腹疼痛、食积不消、食欲不佳、咳嗽痰多、胸满腹胀等症，为《中国药典》(2010年)收载的常用中药及食用调味佳品,是食药两用的植物。草果一般种植后3年开始结果，7年进入盛果期，可连续结果20年甚至更长，因此它具有省工、受益时间长、经济价值高的特点,被称为“山中摇钱树”。目前云南省草果种植达20多万亩，种植面积和产量占全国90％以上，是草果适生区山区群众重要的经济来源，在部分县区甚至是群众家庭经济收入的唯一来源。
草果的繁殖方式通常分为种子繁殖、分株繁殖和组织培养繁殖。种子繁殖是目前草果种苗生产的主要方式，它具有繁殖速度快，育苗成本低等特点，但由于草果遗传不稳定，植株及花的开放行为具有二型性，是高度杂合的异花授粉植物，后代分化较大，况且当前种苗培育并没有对种子来源进行严格筛选，见种就采、见苗就栽现象普遍存在，草果种苗种植后无论是在长势、结实率、产量等方面均表现出明显的差异，种植林分结果少甚至不结果现象普遍存在，对草果产业建设的质量造成了较为严重的影响，一定程度上限制了草果在脱贫攻坚中作用的发挥以及农户种植草果脱贫的积极性。分株繁殖具有成林快、结果早、丰产性稳定等特点，但由于受到母株来源的限制，繁殖效率低，培育苗木数量有限，难以进行规模化生产，不能满足生产发展需要，该方式仅限于小面积内的草果林改造和更新。组织培养繁殖是目前快速繁殖优良品种或单株的最佳方法，它具有繁殖速度快、周期短，能在短期内提供大量与母本性状一致的优质种苗用于生产的特点，以该方式培育的种苗具有生长速度快、抗病性强、丰产性好等特点，已广泛应用于桉树、杉木等用材林、石斛、白芨等中药材以及马铃薯等农作物的良种繁育与良种推广。草果的组织培养仅见2006年萧洪东等以草果茎尖为外植体,MS为基本培养基,探讨不同浓度的培养基因子,对草果不定芽的诱导、增殖分化、生根情况和试管苗移栽成活率的影响。结果表明:以MS+6-BA6mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.05mg/L的培养基对不定芽增殖分化效果较好,增殖倍数达到2.34，不定芽叶色绿，苗粗壮，整体感最好。糖浓度对草果不定芽分化增殖有一定影响,以糖浓度为30-35g/L增殖分化效果较好。在草果不定芽生根中,以1/2MS+IBA0.2mg/L、1/2MS+NAA0.2mg/L效果较好。出根率较高,须根最多,平均根数最多,移栽成活率为100％。
虽然草果组织培养取得了初步的成功，但是存在着繁殖系数低，未能实现规模化生产，不能应用于生产实践。同时在试验过程中,还存在着部分不定芽出现玻璃化现象及各种变异,如叶失绿,整株黄化死亡等；诱导和增殖培养过程中,部分培养基产生褐化现象,从而影响培养物的生长发育,甚至导致培养物整体死亡的情况。因此选择产量高、结实率较好、健壮无病虫害的草果优良单株为繁殖材料，研制开发一种繁殖系数高、繁殖速度快、技术稳定可靠、实现规模化生产的草果组织培养方法可为推动草果良种的选育与应用提供技术保障，对提升草果产业建设的质量以及发挥草果在脱贫攻坚中的作用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种草果优良单株的组织培养方法，本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，利用植物组织培养方法建立了草果的快速繁殖体系，为草果良种繁育与推广应用提供了技术保障，是解决草果生产中优质种苗短缺以及提升草果产业建设质量的有效途径。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是：一种草果优良单株的组织培养方法，包括如下步骤：
步骤一、优良单株选择：
在当年10-11月草果成熟季节，在农户报优与现场调查相结合的基础上，以产量为第一指标，初步确定选择母株并进行标记，同时对标记母株的每丛果穗数、每穗小花数、每穗结果数、每穗果重进行调查统计，比较各母株间的产量、结实率等指标，选择生长健壮、产量大、结实率高、丰产性好的单株作为开展组织培养繁殖材料的入选单株；
步骤二、外植体的选择：
以标记的入选单株作为采集繁殖材料的母株，以新生带芽根茎作为外植体；外植体采集在次年的4-6月进行；待新生带芽根茎伸长并抽出第一个叶片时用锋利刀具将新生带芽根茎从新老根茎结合处切下，装入保鲜袋并及时运回试验室进行消毒处理；
步骤三、外植体的处理与消毒：
剪去外植体上过长的叶片、苞片及根系，流水冲洗30min，洗净外植体表面泥土及杂质，然后在流水下从基部开始自下而上采取环状剥离的方式剥除苞片及叶片；剥离时用力均匀，用力方向与根茎垂直，确保完全去除苞片、叶片；去除苞片、叶片的外植体用棉花蘸洗衣粉水由自下而上方向进行擦洗，流水冲洗后以芽为中心切成1cm大小的带芽方形小块，无菌水漂洗后在超净工作台上用0.1％的HgCl2溶液消毒10min，然后无菌水漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗完后用无菌滤纸吸干水分；
步骤四、诱导培养：
将经消毒并吸干水分的带芽方形小块外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养；外植体接种后，芽体由白色逐渐转为黄绿色，7d开始萌动并逐渐长大，20d后有新芽突破芽体苞片，继续培养20～30d形成1-3个丛生芽；
步骤五、增殖培养：
将诱导培养获得的丛生芽剪除多余的新生苞片或叶片，保留1-2cm并带1-2个芽体的无菌小苗接入增殖培养基上进行增殖培养，经40～50d培养后可形成带2-4个芽体的丛生芽；在生根培养之前，每隔40d，对培养获得的丛生芽进行剪切并接入增殖培养基中进行增殖培养，可实现小苗的增殖与快速繁殖；
步骤六、生根培养：
待增殖培养分化得到的小芽苗长到2～4cm时，将丛生芽切成单芽小苗，转接到生根培养基上进行生根培养；小苗接种后10d开始有根系形成，经30d后可形成具根系2～5条，根长1～5cm的完整小植株，生根率可达100％；
步骤七、炼苗移栽：
当生根培养25d，小苗生根率达95％以上时，即可将小苗由培养室移到遮光率75％的自然光温室或大棚中进行炼苗；炼苗3-5d后即可进行移栽；移栽时将小苗从培养瓶中取出，流水冲洗干净附着在根系表面的培养基，然后用0.5％的高锰酸钾浸泡消毒10min；然后将小苗移栽到装有移栽基质为泥炭土：珍珠岩＝5：1的育苗盘中，移栽前移栽基质用800倍的百菌清或甲基托布津进行浇淋消毒，移栽时扶正小苗并确保根系被基质覆盖不外露，移栽后用喷雾器喷水并进行遮荫保湿及病害防治管理；移栽20天后即可成活，成活率可达100％；小苗移栽成活后，可将小苗移入营养袋或假植于苗床进行大苗培育，满足造林需要。
一种草果优良单株的组织培养的基本培养基，其特征在于：它的配方是以MS培养基为基础，结合草果的生物学特性及对生长环境的要求设计而成，它包括大量元素、微量元素、铁盐和有机附加物。
所述大量元素的组分及其对应的浓度为：硝酸钾1000mg/L、硝酸铵800mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾250mg/L、无水氯化钙110mg/L、四水合硝酸钙500mg/L。
所述微量元素的组分及其对应的浓度为：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、一水合硫酸锰16.9mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L。
所述铁盐的组分及其对应的浓度为：七水合硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L。
所述有机化合物的组分及其对应的浓度为：肌醇100mg/L、烟酸2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.5mg/L、盐酸硫胺素5.0mg/L、甘氨酸4.0mg/L。
不同培养阶段的培养基配方及培养条件：
所述的诱导培养的培养基配方及培养条件：改良MS+6-BA3mg/L+IAA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d。
所述增殖培养的培养基配方及培养条件：改良MS+6-BA4.5mg/L+IBA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为14h/d。
所述生根培养的培养基配方及培养条件：1/2改良MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间为14h/d。
采用上述技术方案后，本发明有益效果为：本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，利用植物组织培养方法建立了草果的快速繁殖体系，为草果良种繁育与推广应用提供了技术保障，是解决草果生产中优质种苗短缺以及提升草果产业建设质量的有效途径。
本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，采用无性繁殖方式培育无性系苗木，培育苗木具有良好的遗传稳定性，能将优良单株上的优良性状完全地遗传给无性系后代。
本发明对草果组织培养过程中各个阶段的基本培养基选择、植物生长调节剂的种类和用量以及培养条件进行了试验筛选和优化，有效提高了草果的繁殖系数，为实现规模化生产奠定了技术基础。
本发明培养过程繁殖速度快，再生频率较高，变异率低，繁殖周期相对较短，技术成熟可靠，可直接应用于生产实践。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1-2是本发明选择的草果优株的实物图；
图3-4是本发明优株数据调查的实物图；
图5-6是本发明外植体选择与采集的实物图；
图7-8是本发明诱导培养的实物图；
图9是本发明增殖培养的实物图；
图10是本发明生根培养的实物图；
图11是本发明生根小苗的实物图；
图12是移栽成活小苗的实物图。
具体实施方式
参看图1-图12所示，本具体实施方式采用的技术方案是：一种草果优良单株的组织培养方法，包括如下步骤：
步骤一、优良单株选择：
在当年10-11月草果成熟季节，在农户报优与现场调查相结合的基础上，以产量为第一指标，初步确定选择母株并进行标记，同时对标记母株的每丛果穗数、每穗小花数、每穗结果数、每穗果重进行调查统计，比较各母株间的产量、结实率等指标，选择生长健壮、产量大、结实率高、丰产性好的单株作为开展组织培养繁殖材料的入选单株；
步骤二、外植体的选择：
以标记的入选单株作为采集繁殖材料的母株，以新生带芽根茎作为外植体；外植体采集在次年的4-6月进行；待新生带芽根茎伸长并抽出第一个叶片时用锋利刀具将新生带芽根茎从新老根茎结合处切下，装入保鲜袋并及时运回试验室进行消毒处理；
步骤三、外植体的处理与消毒：
剪去外植体上过长的叶片、苞片及根系，流水冲洗30min，洗净外植体表面泥土及杂质，然后在流水下从基部开始自下而上采取环状剥离的方式剥除苞片及叶片；剥离时用力均匀，用力方向与根茎垂直，确保完全去除苞片、叶片；去除苞片、叶片的外植体用棉花蘸洗衣粉水由自下而上方向进行擦洗，流水冲洗后以芽为中心切成1cm大小的带芽方形小块，无菌水漂洗后在超净工作台上用0.1％的HgCl2溶液消毒10min，然后无菌水漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗完后用无菌滤纸吸干水分；
步骤四、诱导培养：
将经消毒并吸干水分的带芽方形小块外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养；外植体接种后，芽体由白色逐渐转为黄绿色，7d开始萌动并逐渐长大，20d后有新芽突破芽体苞片，继续培养20～30d形成1-3个丛生芽；
步骤五、增殖培养：
将诱导培养获得的丛生芽剪除多余的新生苞片或叶片，保留1-2cm并带1-2个芽体的无菌小苗接入增殖培养基上进行增殖培养，经40～50d培养后可形成带2-4个芽体的丛生芽；在生根培养之前，每隔40d，对培养获得的丛生芽进行剪切并接入增殖培养基中进行增殖培养，可实现小苗的增殖与快速繁殖；
步骤六、生根培养：
待增殖培养分化得到的小芽苗长到2～4cm时，将丛生芽切成单芽小苗，转接到生根培养基上进行生根培养；小苗接种后10d开始有根系形成，经30d后可形成具根系2～5条，根长1～5cm的完整小植株，生根率可达100％；
步骤七、炼苗移栽：
当生根培养25d，小苗生根率达95％以上时，即可将小苗由培养室移到遮光率75％的自然光温室或大棚中进行炼苗；炼苗3-5d后即可进行移栽；移栽时将小苗从培养瓶中取出，流水冲洗干净附着在根系表面的培养基，然后用0.5％的高锰酸钾浸泡消毒10min；然后将小苗移栽到装有移栽基质为泥炭土：珍珠岩＝5：1的育苗盘中，移栽前移栽基质用800倍的百菌清或甲基托布津进行浇淋消毒，移栽时扶正小苗并确保根系被基质覆盖不外露，移栽后用喷雾器喷水并进行遮阴保湿及病害防治管理；移栽20天后即可成活，成活率可达100％；小苗移栽成活后，可将小苗移入营养袋或假植于苗床进行大苗培育，满足造林需要。
一种草果优良单株的组织培养的基本培养基，其特征在于：它的配方是以MS培养基为基础，结合草果的生物学特性及对生长环境的要求设计而成，它包括大量元素、微量元素、铁盐和有机附加物。
所述大量元素的组分及其对应的浓度为：硝酸钾1000mg/L、硝酸铵800mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾250mg/L、无水氯化钙110mg/L、四水合硝酸钙500mg/L。
所述微量元素的组分及其对应的浓度为：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、一水合硫酸锰16.9mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L。
所述铁盐的组分及其对应的浓度为：七水合硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L。
所述有机化合物的组分及其对应的浓度为：肌醇100mg/L、烟酸2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.5mg/L、盐酸硫胺素5.0mg/L、甘氨酸4.0mg/L。
不同培养阶段的培养基配方及培养条件：
所述的诱导培养的培养基配方及培养条件：改良MS+6-BA3mg/L+IAA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d。
所述增殖培养的培养基配方及培养条件：改良MS+6-BA4.5mg/L+IBA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为14h/d。
所述生根培养的培养基配方及培养条件：1/2改良MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间为14h/d。
采用上述技术方案后，本发明有益效果为：本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，利用植物组织培养方法建立了草果的快速繁殖体系，为草果良种繁育与推广应用提供了技术保障，是解决草果生产中优质种苗短缺以及提升草果产业建设质量的有效途径。
本发明以优良单株的幼嫩芽体为繁殖材料，采用无性繁殖方式培育无性系苗木，培育苗木具有良好的遗传稳定性，能将优良单株上的优良性状完全地遗传给无性系后代。
本发明对草果组织培养过程中各个阶段的基本培养基选择、植物生长调节剂的种类和用量以及培养条件进行了试验筛选和优化，有效提高了草果的繁殖系数，为实现规模化生产奠定了技术基础。
本发明培养过程繁殖速度快，再生频率较高，变异率低，繁殖周期相对较短，技术成熟可靠，可直接应用于生产实践。
为了确保本发明的有益效果，申请人进行了一系列的实验，具体如下：
1、外植体选择--不同外植体类型的诱导效果比较
以草果优良单株不同成熟期的新生根茎为外植体，接种于诱导培养基进行诱导培养，诱导培养基为改良
MS+6-BA3mg/L+IAA0.5mg/L+VC20mg/L蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d。结果表明，新生根茎的发育程度与诱导效果密切相关，新生根茎过于幼嫩，根茎节间较短，不利于切取带芽小块，腋芽发育程度低，接种后不易萌发；对于已抽生两个以上叶片的新生根茎，其维管束已开始木质化，虽然腋芽发育较好，萌发率较高，但不易切取带芽方形小块且污染率较高。具体结果见下表(表1)。
表1不同外植体类型的诱导效果比较
外植体类型 接种数/个 萌发数/个 萌发率/％ 污染数/个 污染率/％
见二叶根茎 35 23 65.7 17 48.6
见一叶根茎 28 15 53.6 9 32.1
未见叶根茎 22 6 27.3 7 31.8
2、不同6-BA浓度对增殖及生长的影响
将草果丛生芽切分成单芽小苗接种于不同6-BA浓度的增殖培养基(除6-BA外其余为改良MS+IBA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为14h/d。)中，结果表明(见表2)，6-BA的浓度与增殖率呈正相关。随着6-BA浓度的增加，增殖率也增加。但当6-BA浓度为6mg/L时，增殖小苗有一定比例多个叶片簇生的畸形苗出现，将其继代接种培养后并未逆转形成正常苗。同时在培养过程中发现所有培养基中均有根系形成，但根系生成的时间、数量与6-BA浓度密切相关，浓度低根系生成时间早，数量多，浓度高根系生成时间晚，数量少。
表2不同6-BA浓度对增殖及生长的影响
Figure BDA0001970383510000121
3、不同基本培养基对增殖及生长的影响
将草果丛生芽切分成单芽小苗接种于不同基本培养基的增殖培养基(除基本培养基外其余为6-BA4.5mg/L+IBA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为14h/d。)中，结果表明(见表3)，不同的基本培养基对增殖率的影响并不明显，但对增殖形成的小苗生长影响较大。以B5为基本培养基，小苗叶色黄绿，培养后期有叶片黄化、枯稍的情况发生，未见玻璃化苗出现；以MS为基本培养基，叶色嫩绿，长势旺盛，叶片不黄化，但有部分小苗顶叶坏死情况发生，部分小苗有玻璃化情况发生；以改良MS为基本培养基，叶色嫩绿，长势旺盛，叶片不黄化，小苗顶叶不坏死，未见玻璃化苗出现。
表3基本培养基对增殖及生长的影响
Figure BDA0001970383510000131
4、不同生长素种类对增殖及生长的影响
将草果丛生芽切分成单芽小苗接种于包含相同浓度(0.5mg/L)、不同生长素种类的增殖培养基(除生长素外其余为改良MS+6-BA4.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为14h/d。)中，结果表明(见表4)，不同生长素种类对增殖率的影响并不显著，相互间无明显差异。但是对小苗生长及根系形成却存在一定差异。在含NAA的增殖培养基中，长势一般，根系形成早，根系粗壮，根毛明显，但叶色黄绿，叶片有黄化及枯稍现象，同时可见部分畸形小苗；在含IBA的增殖培养基中，长势旺盛，根系形成较早，根系较粗壮，根毛明显，叶色嫩绿，叶片无黄化及枯稍现象，同时无畸形小苗出现；在含IAA的增殖培养基中，长势较旺盛，偶有根系形成，数量少，根系较短且细弱，根毛不明显，叶色嫩绿，叶片无黄化及枯稍现象，同时无畸形小苗出现。
表4不同6-BA浓度对增殖及生长的影响
Figure BDA0001970383510000141
5、不同生长素种类及浓度对生根的影响
将草果丛生芽切分成带2个以上小叶的单芽小苗接种于不同生长素种类及浓度的生根培养基(1/2改良MS+蔗糖30g/L)上进行生根诱导，观察并记录生根效果。试验设计采用三因素三水平的正交试验，试验设计及结果见表5。
表5不同生长素种类及浓度对生根的影响
Figure BDA0001970383510000151
表5的结果表明，在生根培养基中，NAA所得的极差值R最大，对草果的生根影响也最大，其次为IBA。各生长素对草果的生根影响主次依次为：NAA>IBA>IAA。通过k值比较，草果生根的最优方案为：NAA0.5mg/L+IBA1mg/L+IAA1mg/L。以此方案为指导，开展草果种苗生产，生根率可达100％。
6、移栽基质的选择
当生根培养25d，小苗生根率达95％以上时，即可将小苗由培养室移到遮光率75％的自然光温室或大棚中进行炼苗。炼苗3-5d后即可进行移栽。生根小苗用流水清洗掉附着在小苗上的培养基并用0.5％高锰酸钾消毒后移栽到浇淋过800倍甲基托布津的不同移栽基质中，比较不同移栽基质对小苗成活及生长的影响。结果见表6。
表6不同移栽基质对小苗成活及生长的影响
Figure BDA0001970383510000161
表6的结果表明，草果小苗较易移栽成活，最高成活率可达100％。而不同移栽基质小苗生长情况不同，其原因与不同基质所含养分有关。同时观察到，以泥炭土为移栽基质，在管理过程中存在基质失水后不易浇透水的情况，因此选择泥炭土：珍珠岩＝5:1为移栽基质，即有较高的成活率，又能保证小苗生长旺盛，同时还有利于移栽管理。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种草果优良单株的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、优良单株选择：
在当年10-11月草果成熟季节，在农户报优与现场调查相结合的基础上，以产量为第一指标，初步确定选择母株并进行标记，同时对标记母株的每丛果穗数、每穗小花数、每穗结果数、每穗果重进行调查统计，比较各母株间的产量、结实率等指标，选择生长健壮、产量大、结实率高、丰产性好的单株作为开展组织培养繁殖材料的入选单株；
步骤二、外植体的选择：
以标记的入选单株作为采集繁殖材料的母株，以新生带芽根茎作为外植体；外植体采集在次年的4-6月进行；待新生带芽根茎伸长并抽出第一个叶片时用锋利刀具将新生带芽根茎从新老根茎结合处切下，装入保鲜袋并及时运回实验室进行消毒处理；
步骤三、外植体的处理与消毒：
剪去外植体上过长的叶片、苞片及根系，流水冲洗30min，洗净外植体表面泥土及杂质，然后在流水下从基部开始自下而上采取环状剥离的方式剥除苞片及叶片；剥离时用力均匀，用力方向与根茎垂直，确保完全去除苞片、叶片；去除苞片、叶片的外植体用棉花蘸洗衣粉水由自下而上方向进行擦洗，流水冲洗后以芽为中心切成1cm大小的带芽方形小块，无菌水漂洗后在超净工作台上用0.1％的HgCl2 溶液消毒10min，然后无菌水漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗完后用无菌滤纸吸干水分；
步骤四、诱导培养：
将经消毒并吸干水分的带芽方形小块外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养；外植体接种后，芽体由白色逐渐转为黄绿色，7d开始萌动并逐渐长大，20d后有新芽突破芽体苞片，继续培养20～30d形成1-3个丛生芽；
步骤五、增殖培养：
将诱导培养获得的丛生芽剪除多余的新生苞片或叶片，保留1-2cm并带1-2个芽体的无菌小苗接入增殖培养基上进行增殖培养，经40～50d培养后可形成带2-4个芽体的丛生芽；在生根培养之前，每隔40d，对培养获得的丛生芽进行剪切并接入增殖培养基中进行增殖培养，可实现小苗的增殖与快速繁殖；
步骤六、生根培养：
待增殖培养分化得到的小芽苗长到2～4cm时，将丛生芽切成单芽小苗，转接到生根培养基上进行生根培养；小苗接种后10d开始有根系形成，经30d培养后可形成具根系2～5条，根长1～5cm的完整小植株，生根率可达100％；
步骤七、炼苗移栽：
当生根培养25d，小苗生根率达95％以上时，即可将小苗由培养室移到遮光率75％的自然光温室或大棚中进行炼苗；炼苗3-5d后进行移栽；移栽时将小苗从培养瓶中取出，流水冲洗干净附着在根系表面的培养基，然后用0.5％的高锰酸钾浸泡消毒10min；然后将小苗移栽到装有移栽基质为泥炭土：珍珠岩＝5：1的育苗盘中，移栽前移栽基质用800倍的百菌清或甲基托布津进行浇淋消毒，移栽时扶正小苗并确保根系被基质覆盖不外露，移栽后用喷雾器喷水并进行遮荫保湿及病害防治管理；移栽20天后成活，成活率可达100％；小苗移栽成活后，将小苗移入营养袋或假植于苗床进行大苗培育，满足造林需要；
改良MS培养基组分为：硝酸钾1000mg/L、硝酸铵800mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾250mg/L、无水氯化钙110mg/L、四水合硝酸钙500mg/L；碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、一水合硫酸锰16.9mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L；七水合硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；肌醇100mg/L、烟酸2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.5mg/L、盐酸硫胺素5.0mg/L、甘氨酸4.0mg/L；
所述的诱导培养的培养基配方及培养条件：改良MS+6-BA3mg/L+IAA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d；
所述增殖培养的培养基配方及培养条件：改良MS+6-BA4.5mg/L+IBA0.5mg/L+VC20mg/L+蛋白胨0.5g/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为14h/d；
所述生根培养的培养基配方及培养条件：
1/2改良MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间为14h/d。
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