CN109811013B - 嗜吡啶红球菌在厌氧发酵产甲烷中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜吡啶红球菌在厌氧发酵产甲烷中的应用。本发明通过实验发现，在厌氧发酵的原料中加入嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR‑1后，沼气的产气量明显增大，沼气中甲烷含量明显增高，因此，可以将嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovo rans)HR‑1应用于厌氧发酵产甲烷中。本发明的嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR‑1属于兼性厌氧菌，在氧气存在的情况下也能存活，易于培养，运行相对简单。本发明为嗜吡啶红球菌开拓了新的应用领域，为厌氧发酵产甲烷***提供了一种新的适应性更强的微生物菌株。

Description

嗜吡啶红球菌在厌氧发酵产甲烷中的应用
技术领域：
本发明属于微生物***分类和环境生物技术领域，具体涉及嗜吡啶红球菌在厌氧发酵产甲烷中的应用。
背景技术：
厌氧发酵主要是指有机物质在厌氧条件下分解产生甲烷和二氧化碳的过程，是目前污泥污水、餐厨垃圾、生活垃圾、畜禽粪便等的常见处理工艺，而如何提高厌氧发酵产甲烷的性能是目前的研究热点之一。
前期研究表明，通过往厌氧发酵体系中加入铁系添加物、石墨烯、胞外聚合物等，都可有效的促进体系的厌氧发酵效率，提高甲烷产率。然而，此类物质的添加普遍存在运行成本提高、影响沼液和沼渣资源化利用等问题。而研究表明，产甲烷菌在厌氧发酵过程中起着关键作用，在提高甲烷产量方面具有更为直接的影响。
嗜吡啶红球菌是一种能够降解对邻二甲苯、吡啶、苯酚、亚氨基二乙腈等含氮杂环芳香烃化合物的微生物菌株，申请号为201710363708.7的发明专利申请公开了一株可作为微生物燃料电池阳极催化剂用于处理垃圾渗滤液、电子供体利用谱较广的嗜吡啶红球菌。经文献和专利检索，尚未发现关于嗜吡啶红球菌具有促进厌氧发酵产甲烷的报道。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供嗜吡啶红球菌在厌氧发酵产甲烷中的应用。
本发明通过实验发现，在厌氧发酵的原料中加入嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinovorans)HR-1后，沼气的产气量明显增大，沼气中甲烷含量明显增高。
因此，本发明的目的是提供嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR-1在厌氧发酵产甲烷中的应用。
本发明的嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR-1电子供体谱广泛，可以柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖、蔗糖、酵母粉和乙酸钠的一种或几种为电子受体生长。其形态学特征为：菌落形态呈现圆形，呈红色，单菌落直径大小约为2mm左右，边缘整齐规整；细胞形态为短杆状，尺寸范围为1.0～2.0μm×0.2～0.4μm，兼性厌氧。
优选，嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR-1在以粪便或餐厨垃圾为原料厌氧发酵产甲烷中的应用。
所述的粪便优选为猪粪或鸡粪。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)利用嗜吡啶红球菌HR-1作为厌氧发酵产甲烷***的活性菌株，此菌属于兼性厌氧菌，是从垃圾渗滤液中分离鉴定出来的，易于培养，在氧气存在的条件下不会失活，在培养和运行过程中无需太过严苛的操作，操作简单，运行成本相对较低。
(2)嗜吡啶红球菌HR-1的原料利用谱相对较广，申请号为201710363708.7的发明专利中显示，此菌可以柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖、蔗糖、酵母粉和乙酸钠的一种或几种有机物为原料进行生长繁殖，并且可以将有机物彻底的进行氧化分解，电子回收率相对较高。
(3)本发明通过实验发现，嗜吡啶红球菌HR-1能显著提高厌氧发酵中的沼气产气量以及沼气中甲烷含量，为嗜吡啶红球菌开拓了新的应用领域，为厌氧发酵产甲烷***提供了一种新的适应性更强的微生物菌株。
本发明的嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC NO.14021。该菌公开于专利号：201710363708.7，发明名称：一种嗜吡啶红球菌及其在微生物燃料电池中的应用的专利中。
附图说明：
图1是厌氧发酵产甲烷的小试***的结构示意图；其中，1、厌氧发酵反应装置；11、第一橡胶塞；12、第一三角瓶；13、排气管；14、加样管；15、第一阀门；2、恒温控温装置；3、气体收集装置；31、第二橡胶塞；32、第二三角瓶；33、进气管；34、排水管；4、测量装置4；5、第一软管；51、第二阀门；6、第二软管；7、玻璃管。
图2是以猪粪为厌氧发酵原料的厌氧发酵产甲烷的小试***产生的沼气中甲烷含量变化。
图3是以鸡粪为厌氧发酵原料的厌氧发酵产甲烷的小试***产生的沼气中甲烷含量变化。
图4是以餐厨垃圾为厌氧发酵原料的厌氧发酵产甲烷的小试***产生的沼气中甲烷含量变化。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所述实验方法，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行；所述试剂和材料，无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：嗜吡啶红球菌促进厌氧发酵产甲烷性能验证
(1)构建一个厌氧发酵产甲烷的小试***：
如图1所示，本发明的厌氧发酵产甲烷的小试***，包括厌氧发酵反应装置1、恒温控温装置2、气体收集装置3和测量装置4。厌氧发酵反应装置1包括用第一橡胶塞11密封的第一三角瓶12，第一三角瓶12为2000mL三角瓶，第一橡胶塞11上设有排气管13和加样管14，加样管14的加样端设有第一阀门15。恒温控温装置2为恒温水槽，厌氧发酵产甲烷时将厌氧发酵反应装置1放置于恒温水槽中，以便控制厌氧发酵的温度。气体收集装置3包括用第二橡胶塞31密封的装有水的第二三角瓶32，第二三角瓶32为2000mL三角瓶，第二橡胶塞31上设有进气管33和排水管34，排气管13和进气管33由第一软管5连通，第一软管5上设有第二阀门51。测量装置4为上端开口的玻璃瓶，玻璃瓶上设有多个计量刻度，排水管34的出水端连接有第二软管6，第二软管6的另一端连接有玻璃管7，厌氧发酵时，将玻璃管7放入玻璃瓶中。
(2)制备含有嗜吡啶红球菌菌液作为厌氧发酵产甲烷的小试***的初步接种物：
首先将嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)HR-1接种于常规的LB液体培养基中，在30℃、厌氧条件下培养18h，离心收集菌体，将菌体重新悬浮于新鲜的LB液体培养基中，菌悬液浓度为106cfu/mL，再次在相同条件下培养6h后获得初步接种物。
其中，LB液体培养基成分为：每升含有酵母浸膏5g、NaCl 5g和胰蛋白胨10g，其余为水，pH7；配制方法为：称取5g酵母浸膏、5g NaCl和10g胰蛋白胨，溶解于少量水中，加水定容至1L，调节pH至7，灭菌备用。
(3)对步骤(2)所获得的初步接种物进行驯化：
对步骤(2)所获得的初步接种物进行驯化，是以LB液体培养基稀释沼液获得含有不同浓度沼液的发酵原料，通过递增发酵原料中沼液的浓度逐渐对嗜吡啶红球菌HR-1进行驯化，其中发酵原料中的LB液体培养基与沼液的体积比依次为：10:1、8:1、5:1、2:1、1:1和0:1。最后，当发酵原料全部更换成沼液，且沼气中甲烷含量达到65％以上，并维持一段时间，即认为驯化过程完成，获得接种物。
具体驯化步骤为：将初步接种物按照体积比5％的接种量接种到发酵原料1(发酵原料1是由LB液体培养基和沼液按体积比10:1混合而成)中，在30℃、厌氧条件下培养，待其生长至对数生长期得到发酵液1，将发酵液1按照体积比5％的接种量接种到发酵原料2(发酵原料2是由LB液体培养基和沼液按体积比8:1混合而成)中，在30℃、厌氧条件下培养，待其生长至对数生长期得到发酵液2，将发酵液2按照体积比5％的接种量接种到发酵原料3(发酵原料3是由LB液体培养基和沼液按体积比为5:1混合而成)中，在30℃、厌氧条件下培养，待其生长至对数生长期得到发酵液3，将发酵液3按照体积比5％的接种量接种到发酵原料4(发酵原料4是由LB液体培养基和沼液按体积比为2:1混合而成)中，在30℃、厌氧条件下培养，待其生长至对数生长期得到发酵液4，将发酵液4按照体积比5％的接种量接种到发酵原料5(发酵原料5是由LB液体培养基和沼液按体积比为1:1混合而成)中，在30℃、厌氧条件下培养，待其生长至对数生长期得到发酵液5，将发酵液5按照体积比5％的接种量接种到发酵原料6(发酵原料6为沼液)中，在30℃、厌氧条件下培养至对数生长期，沼气产量达400mL/g.VS，测定沼气中甲烷含量达65％，即驯化过程完成，获得驯化好的含嗜吡啶红球菌的接种物。其中沼液为以猪粪为发酵原料的沼液。
(4)将驯化好的含嗜吡啶红球菌的接种物接入厌氧发酵产甲烷的小试***中进行产甲烷检测：
将500g猪粪装入如图1所示的厌氧发酵产甲烷的小试***的第一三角瓶12中，将恒温控温装置2的温度调节至30℃，关闭加样管14上的第一阀门15，打开第一软管5上的第二阀门51，于30℃、厌氧条件下培养，猪粪自身携带的细菌在厌氧条件下发酵产生沼气，沼气依次经过排气管13、第一软管5和进气管33进入到气体收集装置3的第二三角瓶32中，第二三角瓶32中的水经过排水管34、第二软管6和玻璃管7流入到测量装置4中，通过计量刻度随时读取并记录沼气的产气量(排液法测量气体体积)，厌氧发酵160min后，打开加样管14上的第一阀门15，关闭第一软管5上的第二阀门51，将100mL驯化好的含嗜吡啶红球菌的接种物通过加样管14接种至猪粪中，关闭加样管14上的第一阀门15，打开第一软管5上的第二阀门51，于30℃、厌氧条件下培养，测定沼气的产气量。结果发现，在加入驯化好的含嗜吡啶红球菌的接种物后，沼气的产气量明显增大，由原先的270～300mL/g·VS增加到400±30mL/g·VS，且沼气中甲烷含量明显增高，由原来的53.3％增加到68.3％(见图2)。
实施例2：
具体操作过程与实施例1相同，不同之处在于：
厌氧发酵产甲烷的小试***中的原料为鸡粪，原先鸡粪厌氧发酵的沼气产气量为320～350mL/g·VS，产生的沼气中甲烷含量约57.3％，加入驯化好的含嗜吡啶红球菌的接种物后，沼气的产气量增加到420±30mL/g·VS，而沼气中甲烷含量升高至73.1％，如图3。
实施例3：
具体操作过程与实施例1相同，不同之处在于：
厌氧发酵产甲烷的小试***中的原料为餐厨垃圾，原先餐厨垃圾厌氧发酵的沼气产气量为230～250mL/g·VS，产生的沼气中甲烷含量约48.3％，而加入驯化好的含嗜吡啶红球菌的接种物后，沼气的产气量增加到320±30mL/g·VS，沼气中甲烷含量升高至67.3％，如图4。
上述详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利保护范围中。

Claims (3)

1.嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinovorans）HR-1在厌氧发酵产甲烷中的应用，其特征在于，所述的嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinovorans）HR-1的保藏编号为：CGMCCNO.14021。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinovorans）HR-1在以粪便或餐厨垃圾为原料厌氧发酵产甲烷中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的粪便为猪粪或鸡粪。
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小试厌氧混合处理糖蜜酒精废液及不同阶段活性污泥中可培养微生物的群落结构分析;耿三春等;《基因组学与应用生物学》;20161231;第35卷(第12期);摘要、第3441页左栏第1段至第3443页右栏第4段 *

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