CN105603019A - 一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，涉及碳水化合物。利用平板划线法于固体培养基上保存微藻；从微藻平板上划取微藻，接入到Modified？3N？medium培养液中培养，得微藻种子培养液；利用生物量与OD685之间存在正比关系，建立OD685与生物量之间的标准曲线；从厌氧发酵罐中取沼液，离心后取上清液；将上清液稀释，并转移到间歇式光反应器中，接种培养，定期测定微藻生物量和营养物质变化，评价实验效果；收集微藻，再经冷冻干燥、破碎、水浴、水解后，测定微藻中的碳水化合物含量。沼液耦合微藻培养，不仅降低微藻培养的成本，同时净化沼液废水；碳水化合物发酵可产生生物乙醇，实现沼液的资源化利用与能源再生。

Description

一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法
技术领域
本发明涉及碳水化合物，尤其是涉及一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法。
背景技术
生物甲烷副产物沼液由于其排放量大、含有大量的氮、磷等，直接排放至环境中将存在风险，容易导致水体富营养化。沼液无害化与资源化利用成为沼液处理方面广泛开展的科研领域。沼液中含有大量的氮、磷等，正是微藻养殖所需的必须营养物质。利用微藻处理沼液不仅可以避免直接排放对环境造成的风险，降低微藻养殖的成本，同时，微藻可以积累生物质和高附加值产物，实现沼液的资源化利用。
碳水化合物作为微藻积累的高附加值产物之一，可以厌氧发酵生产生物乙醇。目前，以玉米、甘蔗为原料的第一代生物乙醇已具备商业化生产条件，然而对于发展中国家而言，利用玉米、甘蔗为原料将出现生物能源“与人争粮”和“与粮争地”的局面。而利用微藻积累碳水化合物产生物乙醇，可以避免该问题，保证粮食安全。微藻由于具有生物量大、光合效率高、生长周期短、环境友好且不占地等优点，是积累碳水化合物，最终得到生物乙醇的重要途径，有望破解后石油时代的能源危机。中国专利CN101285075A介绍了将沼气发酵和自养型淡水微藻培养的耦合方法，并将沼气中的CO2作为微藻培养所需的氮源进行利用，降低了生产成本，解决了沼液的净化和沼液的后处理问题。但其未对微藻本身积累的高附加值产物进行研究，忽略了进一步对微藻进行的资源化利用的可能。专利CN104531779A提供了一种固体碱糖化微藻发酵制备燃料乙醇的方法已初具思路，但其并未提到使用废水替代微藻培养液，存在微藻养殖成本高的弊端。专利CN102433362A提出的利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法，但其培养出的微藻含油量只有14％，经济效益不高。综上，目前利用沼液耦合微藻产碳水化合物还未见专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供不仅能使微藻利用沼液中的氮磷进行自身生长，达到净化沼液的目的，同时还能有效积累高附加值产物碳水化合物，实现沼液资源化利用与能源再生的一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法。
本发明包括以下步骤：
1)利用平板划线法于固体培养基上保存微藻；
2)从微藻平板上划取微藻，接入到Modified3Nmedium培养液中培养，得微藻种子培养液；
3)利用生物量(干重)与OD685之间存在正比关系，建立OD685与生物量(干重)之间的标准曲线；
4)从厌氧发酵罐中取沼液，离心后取上清液；
5)将步骤4)得到的上清液稀释，并转移到间歇式光反应器中，接种培养，定期测定微藻生物量和营养物质变化，评价实验效果；
6)收集微藻，再经冷冻干燥、破碎、水浴、水解后，测定微藻中的碳水化合物含量。
在步骤1)中，所述微藻为小球藻C.sorokiniana.FACHB-275，C.vulgaris和栅藻S.dimorphus.FACHB-1266；所述小球藻C.sorokiniana.FACHB-275，C.vulgaris和栅藻S.dimorphus.FACHB-1266，均可购于中国科学院水生生物研究所；所述固体培养基可采用BG11培养基，BG11培养基的组成为：1.5g/LNaNO3，0.03g/LK2HPO4，0.075g/LMgSO4·7H2O，0.006g/L柠檬酸，2g/LNa2CO3，3.6g/LCaCl2·2H2O，0.6g/L柠檬酸铁铵，0.1g/LEDTA，2.86g/LH3BO3，1.81g/LMnCl2·4H2O，0.222g/LZnSO4·7H2O，0.39g/LNa2MoO4·2H2O，0.079g/LCuSO4·5H2O，0.049g/LCo(NO3)2·6H2O，琼脂粉15～20g/L。
在步骤2)中，所述Modified3Nmedium培养液的组成为：0.75g/LNaNO3，0.0383g/LK2HPO4，0.088g/LKH2PO4，0.075g/LMgSO4·7H2O，0.025g/LCaCl2·2H2O，0.025g/LNaCl，1.77mg/LFeCl3·6H2O，5.53mg/LEDTA，0.073mg/LZnSO4·7H2O，0.016mg/LCoSO4·7H2O，0.584mg/LMnSO4·5H2O，1.48ug/LNa2MnO4·2H2O，1.49ug/LNiCl2·6H2O；所述培养的条件可为：光照为8000lux，光照时间为每天连续光照24h，通2.5％CO2培养，温度25℃，培养4～5天至微藻生长到对数期。
在步骤4)中，所述沼液可采用猪粪厌氧发酵后获得；所述猪粪可取自福建莆田养猪厂；所述离心的条件可为8000rpm，离心10min。
在步骤5)中，所述上清液稀释可用去离子水稀释，去离子水的用量按体积比可为上清液的8倍，所述接种培养的氨氮含量与Modified3Nmedium培养液中氮源浓度相同；
所述接种培养的具体方法可为：取步骤2)得到的微藻种子培养液，4000rpm离心2min，弃掉上清液，取藻体接种到稀释后的上清液中，接种量按使稀释后的沼液生物量为0.1g/L接种量接种，使接种后OD685在0.300～0.350；接种培养的条件可为25℃，光照为15000lux，光照时间为每天连续光照24h，按体积百分比通入2.5％CO2培养；每12h测量一次营养元素浓度变化，具体为测量沼液中氨氮及溶解磷的浓度。
在步骤6)中，所述收集微藻的方法为离心法，离心条件为4000rpm，2min，弃上清收集藻体；所述冷冻干燥的时间可为24h；所述破碎可采用珠磨机破碎9min；所述水浴的条件可在30℃下水浴1h；所述水解可在高压灭菌锅中水解，水解的条件为121℃，20min；所述测定微藻中的碳水化合物含量的方法可采用苯酚硫酸法。
本发明的积极效果是：沼液耦合微藻培养，不仅降低微藻培养的成本，同时净化沼液废水，规避了将沼液直接向环境排放可能引发的风险；另一方面，微藻本身积累高附加值产物碳水化合物，碳水化合物发酵可产生生物乙醇，实现沼液的资源化利用与能源再生。
附图说明
图1为本发明提供的沼液耦合微藻产碳水化合物的装置流程图。
图2为本发明实施例2～5用提供沼液养殖微藻的生物量浓度变化图。
图3为本发明实施例2～5提供沼液养殖微藻的碳水化合物浓度变化图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
如图1所示为本发明实施例的沼液耦合微藻产碳水化合物的装置流程图，空气压缩机2将空气送入二氧化碳混合器1，与二氧化碳钢瓶7输送的二氧化碳混合，由二氧化碳混合器1将二氧化碳浓度调为2.5％，再输送至微藻光生物反应器9中，通过鼓泡石使气泡小而均匀，通过磁力搅拌器8控制搅拌速度和温度，防止微藻沉底。在图1中，标记3为日光灯，4为微藻光生物反应器9的出气口，5为温度控制棒，6为取样口。
实施例2
配制Modified3Nmedium培养基，121℃下灭菌20min。用如实施例1所示装置培养小球藻C.sorokiniana.FACHB-275、C.vulgaris和栅藻S.dimorphus.FACHB-1266，接入灭菌后的Modified3Nmedium中，培养条件：光照为8000lux，光照时间为每天连续光照24h，通2.5％CO2培养，温度25℃，于12h，24h，36h，72h，96h(OD685存在一定间隔即可)准确取50ml样，4000rpm离心2min，弃上清液，再加去离子水反复洗涤3次，定容至50ml，测量OD685并记录，再离心一次弃掉上清液，烘干并称重。得到5个点，拟合成直线，r2〉0.9。做出OD685与干重之间的标准曲线。
实施例3
1、种子培养液的制备：
配制Modified3Nmedium培养基，121℃下灭菌20min。从保存藻种的平板上接种小球藻C.sorokiniana.FACHB-275到实施例1所述装置中，进行扩大培养，培养4～5天至对数期(OD685为3.00～3.50)。培养条件：光照为8000lux，光照时间为每天连续光照24h，通2.5％CO2培养，温度25℃。
2、取20L沼液，用离心机在室温下8000rpm离心10min，收取上清液。取处理后的上清液125ml，用去离子水稀释至1L，将稀释8倍后的沼液转入光生物反应器中，将上一步中生长至对数期的纯种微藻种子取100ml于4000rpm离心2min，取藻体接入到沼液中，使沼液中微藻初始生物量为0.1g/L(OD685为0.3～0.35)左右，通2.5％的CO2培养，光照为15000lux，温度为25℃。
3、每12h监测OD685(生物量)、氨氮、溶解磷的变化情况。
4、收集50ml微藻，于4000rpm离心2min，弃掉上清液，再加入等量的去离子水离心洗涤三次，收集微藻，冷冻干燥24h。取10mg干藻粉，加入1ml的72％浓硫酸，0.5g玻璃珠于珠磨机中破碎9min，30℃水浴1h，加入17ml去离子水将硫酸稀释至4％后，于120℃灭菌锅中水解20min，冷却后取上清液，用苯酚硫酸法测量碳水化合物浓度。
培养结束时，由OD685与干重的标准曲线可算得生物量为1.63g/L(如图2)，氨氮去除率为57.8％，溶解磷去除率为97.6％，碳水化合物最高含量为52.3％(如图3)。
实施例4
按实施例3所述步骤，将藻种换为C.vulgaris培养，培养结束时，由OD685与干重的标准曲线可算得生物量为2.04g/L(如图2)，氨氮去除率为76.4％，溶解磷去除率为97.2％，碳水化合物最高含量为54.8％(如图3)。
实施例5
按实施例3所述步骤，将藻种换为S.dimorphus.FACHB-1266培养，培养结束时，生物量为1.11g/L(如图2)，氨氮去除率为64.1％，溶解磷去除率为98.8％，碳水化合物最高含量为51.9％(如图3)。
相同条件下，用Modified3Nmedium培养基培养C.sorokiniana.FACHB-275、C.vulgaris和S.dimorphus.FACHB-1266，培养结束时，碳水化合物含量分别为49.8％、43.4％和45.2％，通过比较可知，用微藻培养液培养出的微藻所含碳水化合物含量更高。说明沼液在耦合微藻产碳水化合物方向上具备更大的优势和巨大的潜力。
实验结果表明，沼液耦合微藻产碳水化合物方面效果良好，尤其是C.vulgaris，不仅净化了沼液，将沼液中的氨氮从初始的134mg/L降至12mg/L，达到90％去除率，三种藻均将沼液中的溶解磷从初始的2mg/L将至0.26mg/L以下，达到97％以上的去除率，降低了微藻养殖的成本，而且在短时间内积累较大的生物量以及高含量的碳水化合物，C.vulgaris在沼液中碳水化合物最高达到54.8％，实现了沼液的资源化利用与能源再生，具备非常好的使用前景。
本发明不仅能让微藻利用沼液中的氮磷进行自身生长，达到净化沼液的目的，同时还能有效积累高附加值产物碳水化合物，实现沼液的资源化利用与能源再生。

Claims (10)

1.一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)利用平板划线法于固体培养基上保存微藻；
2)从微藻平板上划取微藻，接入到Modified3Nmedium培养液中培养，得微藻种子培养液；
3)利用生物量与OD685之间存在正比关系，建立OD685与生物量之间的标准曲线；
4)从厌氧发酵罐中取沼液，离心后取上清液；
5)将步骤4)得到的上清液稀释，并转移到间歇式光反应器中，接种培养，定期测定微藻生物量和营养物质变化，评价实验效果；
6)收集微藻，再经冷冻干燥、破碎、水浴、水解后，测定微藻中的碳水化合物含量。
2.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤1)中，所述微藻为小球藻C.sorokiniana.FACHB-275，C.vulgaris和栅藻S.dimorphus.FACHB-1266。
3.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤1)中，所述固体培养基采用BG11培养基，BG11培养基的组成为：1.5g/LNaNO3，0.03g/LK2HPO4，0.075g/LMgSO4·7H2O，0.006g/L柠檬酸，2g/LNa2CO3，3.6g/LCaCl2·2H2O，0.6g/L柠檬酸铁铵，0.1g/LEDTA，2.86g/LH3BO3，1.81g/LMnCl2·4H2O，0.222g/LZnSO4·7H2O，0.39g/LNa2MoO4·2H2O，0.079g/LCuSO4·5H2O，0.049g/LCo(NO3)2·6H2O，琼脂粉15～20g/L。
4.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤2)中，所述Modified3Nmedium培养液的组成为：0.75g/LNaNO3，0.0383g/LK2HPO4，0.088g/LKH2PO4，0.075g/LMgSO4·7H2O，0.025g/LCaCl2·2H2O，0.025g/LNaCl，1.77mg/LFeCl3·6H2O，5.53mg/LEDTA，0.073mg/LZnSO4·7H2O，0.016mg/LCoSO4·7H2O，0.584mg/LMnSO4·5H2O，1.48ug/LNa2MnO4·2H2O，1.49ug/LNiCl2·6H2O。
5.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养的条件为：光照为8000lux，光照时间为每天连续光照24h，通2.5％CO2培养，温度25℃，培养4～5天至微藻生长到对数期。
6.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤4)中，所述沼液采用猪粪厌氧发酵后获得；所述离心的条件可为8000rpm，离心10min。
7.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤5)中，所述上清液稀释是用去离子水稀释，去离子水的用量按体积比为上清液的8倍。
8.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤5)中，所述接种培养的具体方法为：取步骤2)得到的微藻种子培养液，4000rpm离心2min，弃掉上清液，取藻体接种到稀释后的上清液中，接种量按使稀释后的沼液生物量为0.1g/L接种量接种，使接种后OD685在0.300～0.350；接种培养的条件可为25℃，光照为15000lux，光照时间为每天连续光照24h，按体积百分比通入2.5％CO2培养；每12h测量一次营养元素浓度变化，具体为测量沼液中氨氮及溶解磷的浓度。
9.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤6)中，所述收集微藻的方法为离心法，离心条件为4000rpm，2min，弃上清收集藻体；所述冷冻干燥的时间可为24h；所述破碎可采用珠磨机破碎9min；所述水浴的条件可在30℃下水浴1h；所述水解可在高压灭菌锅中水解，水解的条件为121℃，20min。
10.如权利要求1所述一种利用沼液耦合微藻积累碳水化合物的方法，其特征在于在步骤6)中，所述测定微藻中的碳水化合物含量的方法采用苯酚硫酸法。
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