CN109810983B - 猪IFN-γ的优化基因和采用该优化基因制备猪IFN-γ的方法及其注射液和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪IFN‑γ的优化基因和采用该优化基因制备猪IFN‑γ的方法及其注射液和应用，所述猪IFN‑γ的优化基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述制备方法包括：1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪IFN‑γ的CHO细胞株；以及3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪IFN‑γ。所述注射液包括60μg猪IFN‑γ与

70佐剂。使用优化后的基因序列在CHO细胞中制备猪IFN‑γ蛋白时具有产量高、易纯化、成本低、质控容易，且具有良好的活性，可以作为免疫增强剂和治疗药品使用。

Description

猪IFN-γ的优化基因和采用该优化基因制备猪IFN-γ的方法 及其注射液和应用

技术领域

本发明涉及一种稳定高效分泌表达猪IFN-γ的CHO细胞株及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛***研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一种细胞因子，具有抑制细胞***、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。干扰素本质是由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分为I型和II型IFN；I型IFN主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ζ和τ等，II型IFN只有IFN-γ一种。

IFN-γ虽然只有一种基因，但其结构更为复杂，如编码人和鼠IFN-γ的基因长约6Kb，各包含有4个外显子和3个内含子。IFN-γ与I型干扰素(IFN-α与IFN-β)在基因和蛋白质水平上没有明显的相关性(DeGrado,etal,1991)。虽然IFN-γ具有其它干扰素大多数的生物学活性，但在特异性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫调节活性方面要高100-10000倍(Pace,etal,1985)。猪IFN-γ全基因编码166个氨基酸残基，其中包括20aa的信号肽(Dijkmans,etal,1990)，信号肽切除后，产生146个氨基酸的IFN-γ单体，分子量为17.3kD，天然活性状态的IFN-γ是由两个IFN-γ单体经非共价交联形成的同源二聚体糖蛋白((Boehm,etal,1997)。猪IFN-γ与人、小鼠、猫和犬的IFN-γ分别具有60％,41％,72％和72％的同源性，而与IFN-β及IFN-α家族没有明显的同源性(Farrar andSchreiber,1993)。

目前，对猪IFN-γ的制备主要有大肠杆菌表达、酵母表达、昆虫杆状病毒表达。这些表达方式制备猪IFN-γ都存在了表达量低、抗病毒活性较低(糖基化修饰低或没有，与天然蛋白存在较大差异导致)、工艺复杂、产业化困难(成本的高低决定了兽用生物制品的产业化)等缺陷。截止目前为止，兽用生物制品中还没有真核细胞表达的重组干扰素的产品，这主要还是因为产量低、成本高导致产业化困难。

另外，在蛋白类药物中，单独直接使用未经修饰的蛋白作为药物，在药代学上来看，药物的半衰期都很短，一般就几个小时。因此，为了延长药物的半衰期和剂量，一般都选择对目的蛋白进行修饰。但是，修饰都会极大的增加成本，不利于药物的推广，特别是在猪用药物中的推广。因此，研发一种可以适当延长半衰期且成本低的注射液是非常必要的，特别是在该药物的推广使用过程中。

发明内容

本发明要解决的技术问题一是提供一种适合在真核表达细胞中，特别是在CHO细胞中表达重组猪IFN-γ蛋白的猪IFN-γ优化基因序列；二是提供一种成本低、易于推广应用、易于产业化生产的真核细胞制备猪IFN-γ的方法；二是克服现有技术中表达量低、抗病毒活性较低(糖基化修饰低或没有，与天然蛋白存在较大差异导致)、工艺复杂、产业化困难等缺陷；三是提供了一种可延长半衰期且成本低的注射液及其制备方法。

根据本发明的一个方法，本发明在充分研究CHO细胞蛋白表达时的偏嗜性以及猪IFN-γ原始基因序列(如SEQ ID NO.2所示)的基础上，优化了猪IFN-γ的基因序列，所述优化后的猪IFN-γ的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备猪IFN-γ的方法，该方法包括以下步骤：1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪IFN-γ的CHO细胞株；以及3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪IFN-γ。

本发明的技术方案中，优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。

本发明的技术方案中，优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。

本发明的技术方案中，优选地，在所述发酵培养时，将培养基CD-CHO和培养基Ex-cell 302混合，以得到混合培养基，其中，所述培养基CD-CHO和所述培养基Ex-cell 302的体积比为8:2。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种猪IFN-γ注射液，所述猪IFN-γ注射液含有本方法制备的猪IFN-γ和一种水溶性佐剂，所述注射液中猪IFN-γ的浓度为60μg/ml。

本发明的技术方案中，优选地，所述水溶性佐剂为

70。

本发明的技术方案中，优选地，含有所述猪IFN-γ的蛋白缓冲液与

70按照体积比为4:1的比例混合，其中，缓冲液为PBS。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种将优化后的猪IFN-γ的基因序列在重组猪IFN-γ蛋白的表达中应用。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种猪IFN-γ在猪病的治疗和保健中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种猪IFN-γ作为免疫增强剂在猪疫苗中的应用。

本发明人一开始在制备猪IFN-γ重组蛋白时，使用的是猪IFN-γ的原始基因序列(如SEQ ID NO.2所示)，将该序列导入pEE12.4载体中，并使用CHO-K1细胞进行表达，但是本发明人未检测到猪IFN-γ的表达或表达量太低，这说明使用原始基因序列在CHO细胞中表达猪IFN-γ蛋白是不可取的，必须要对原始序列进行优化。

本发明人在前述失败的基础上，对猪IFN-γ的原始基因序列(如SEQ ID NO.2所示)进行了深度优化，再使用优化后的基因序列在CHO细胞中进行表达，该优化后的序列在CHO细胞中表达时具有产量高(猪IFN-γ产量最低能达到500mg/L)、易于纯化(表达出来的IFN-γ为分泌表达，杂蛋白少，直接从细胞上清中纯化)、成本低、抗病毒活性强(使用CHO细胞表达的猪IFN-γ更接近于生物体内自然表达的猪IFN-γ)、适合大规模工业化生产等优点。

本发明的另一方面提供了一种治疗猪疾病用的猪IFN-γ注射液及其制备方法，该注射液在治疗病猪时有非常好的疗效，该注射液不仅克服了单独使用未经修饰猪IFN-γ作为药物时半衰期短的问题，还克服了对猪IFN-γ进行修饰时成本高的问题，在一个实施例中，注射液实验组比对照组(常规化药治疗)的平均日增重要高0.09kg/天，且注射液实验组比另一个实验组(猪IFN-γ未配制成注射液进行治疗)的平均日增重要高0.04kg/天(这是因为配制成注射液后，可以延长猪IFN-γ蛋白在猪体内的半衰期且有一定的缓释作用)；且在观察的30天内2组实验组都没有死亡(对照组死亡3头)。

本发明比较了不同制备方法制备的猪IFN-γ在病猪治疗方面作用，发现本发明的方法制备的猪IFN-γ(注射液4)在病猪治疗方法比其他3种方法要好，这可能主要是因为CHO***表达的猪IFN-γ更接近于猪体内表达的猪IFN-γ，所以在治疗方面较其他的要好。且酵母表达***制备的(注射液1)和昆虫杆状病毒表达***制备的(注射液2)在病猪治疗方法较大肠杆菌表达***制备的(注射液3)，这可能主要是因为大肠杆菌表达***不具备翻译后修饰和糖基化的功能，而其他两种***都有一定程度的糖基化修饰功能。

本发明的另一方面还提供了一种将猪IFN-γ注射液作为免疫增强剂的实施例，从实施例中可以看出，猪IFN-γ作为免疫增强剂在疫苗免疫后能够增强疫苗产生抗体的速度和高度，特别是在疫苗一免后到二免前这段时间。

附图说明

图1表示pEE12.4-OPTI-IFN-γ质粒图。

图2表示pEE12.4-OPTI-IFN-γ双酶切鉴定结果。

图3A表示表达IFN-γ蛋白的CHO-K1单克隆细胞株发酵上清的SDS-PAGE检测结果，图3B表示表达IFN-γ蛋白的CHO-K1单克隆细胞株发酵上清的Werstern Blot检测结果。

图4表示蛋白纯化后SDS-PAGE检测结果。

图5表示疫苗免疫后抗体检测结果。

图6表示密码子优化前后序列比对结果。

图7表示IFN-γ蛋白去糖基化实验SDS-PAGE检测结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国gibco公司；

真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

Lipofectamine LTX购自美国Thermo Fisher公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；

70由赛德奥生物科技(北京)有限公司惠赠；

BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；

实施例1：编码猪IFN-γ基因的优化及其合成

通过对猪IFN-γ核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)进行优化，得到OPTI-IFN-γ序列，如SEQ ID NO.1所示。该合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

将优化后的序列(如SEQ ID NO.1所示)与优化前的序列(如SEQ ID NO.2所示)进行比对，共有111/519＝21.4％的序列差异，具体比对结果见图6所示。

实施例2：pEE12.4-OPTI-IFN-γ重组质粒构建

2.1 PCR扩增目的片段OPTI-IFN-γ

2.1.1 PCR反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-CACGAAGCTTGCCGCCACCATGTCTTACACCAC-3’

下游引物:5’-AATGAATTCTCAATGGTGATGGTGA-3’

(2)加样体系50μL，如下表所示：

PCR扩增程序：

2.1.2 PCR产物进行胶回收

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2 PCR产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。

(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。

1.2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μLElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系

(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查***片段大小是否正确；实验结果见图2所示，其中M为DL10000 maker；1-2为pEE12.4-opti-IFN-γ质粒EcoRI/SpeI双酶切条带大小约7197bp，2083bp，酶切均正确。

(4)选择***片段正确的克隆送测序公司测序。

2.6无内毒素质粒大提

2.6.1无内毒素质粒提取

(1)测序正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；

(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL溶液P1，用移液器充分重悬菌体；

(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL溶液P2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；

(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL溶液P4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；

(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；

(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；

(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤(9)一次；

(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；

(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；

(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL缓冲液TB，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，测浓度，-20℃保存。

(14)取1-2μL所得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。

实施例3：pEE12.4-OPTI-IFN-γ重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立

3.1 CHO-K1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至3×10⁵个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜。

(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。

(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。

(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。

(12)将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4-6h。

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清、1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mLDMEM/F12(含10％血清、1％双抗+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

3.3单克隆筛选

(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。

(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清、1％双抗+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(4)用DMEM/F12(含10％血清、1％双抗+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。

(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。

(6)记录单个细胞的孔。

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清、1％双抗+25μMMSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清、1％双抗，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清、1％双抗，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用100％DMEM/F12(含10％血清、1％双抗，25μM MSX)悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(9)每隔24h计数细胞密度及活力。

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清、1％双抗，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO₂细胞培养箱中预热至37℃。

(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。

(13)将DMEM/F12(含10％血清、1％双抗，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。

(14)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(16)每隔24h计数细胞密度及活力。

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×10⁵个/mL。

(18)经驯化，1D5、5G8、4G6单克隆细胞株均满足要求，表明驯化成功。

实施例5：细胞摇瓶发酵

(1)80％的CD-CHO(体积比)+20％的Ex-cell 302(体积比)混合的培养基对上4种细胞株进行摇瓶发酵验证。单克隆细胞株编号为1D5、5G8、4G6。

(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

(3)稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种60mL培养基于一个250mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

(5)补料(约第四天)：补充79.6g/L CD Efficient Feed C AGT，添加基础培养基的10％。

(6)第5天开始，将CO₂培养箱温度调整至32℃。

(7)第九天，补充79.6g/L CD Efficient Feed C AGT，添加基础培养基的10％。

(8)第十二天，收获细胞上清。

(9)使用SDS-PAGE和Werstern Blot检测单克隆细胞株IFN-γ蛋白的表达水平。如图3A所示(为SDS-PAGE结果)，其中1为Marker 26628，2为10μl 1D5株发酵上清，3为10μl5G8株发酵上清，4为10μl 4G6株发酵上清；如图3B所示(为Werstern Blot检测结果)，其中1为Marker 26628，2为10μl 1D5株发酵上清，3为10μl 5G8株发酵上清，4为10μl 4G6株发酵上清。从中可以看出，4G6株表达量最高，且细胞上清中杂蛋白较少，方便下游纯化。

实施例6：蛋白纯化

(1)取GE excle填料4ml，用BufferA(20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH7.4)平衡5个柱体积；

(3)将4ml填料加入到细胞上清中，于滚瓶机上4℃混匀1h；

(4)将填料和细胞上清转移到空层析柱中，流穿细胞上清；

(4)洗涤：用含20mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(5)洗脱：用含250mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(6)洗涤：用含500mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(7)透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。

(8)图4所示SDS-PAGE检测4G6株发酵上清纯化结果，其中M表示蛋白Marker，γ-IFN-表示纯化后的猪IFN-γ，上样量为10μl。从图中可以看出，在17kDa、21kDa、25kDa各有一条带，这有可能是因为糖基化程度不同所造成的。

(9)去糖基化验证：为了验证是否是因为是糖基化不同所造成的，我们做了去糖基化研究实验，具体步骤参见申请号为201710242260.3的中国发明专利申请中去糖基化实验。结果如图7所示，其中M表示Marker，1和2为酶切前的IFN-γ蛋白，3和4是酶切后的IFN-γ蛋白。从图中可以看出，21kDa、25kDa处的条带在酶切后都与17kDa处的条带重合，这说明21kDa、25kDa的蛋白是因为不同糖基化所造成的，符合预期。

(10)蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，4G6单克隆细胞株蛋白得率约为0.5-0.8g/L；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到80％以上。这是在未优化发酵培养条件下的得率，若再进一步优化发酵培养条件，目的蛋白得率还会进一步提高，初步估计最少能达到1g/L。

实施例7：病猪治疗实验

7.1注射液配制(制备1ml/头，共200ml为例说明)

所用制备用耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。

1)

70佐剂准备：根据抗原液和佐剂体积比为4:1(抗原液是指含有猪IFN-γ的蛋白缓冲液，其中，缓冲液为PBS)，量佐剂体积为40ml置于预先准备好的试剂瓶中，封口，待用。

2)根据抗原液和佐剂体积比为4:1，根据猪IFN-γ浓度以及注射液中该蛋白的含量，计算猪IFN-γ取用的体积；用PBS或其他缓冲液将抗原液总体积补充至160ml，混匀，待用。

3)搅拌：将准备好的抗原液置于预先准备好的烧杯(根据制备量选择大小合适的烧杯，如制备200ml选择500ml的烧杯即可)中，调整好搅拌机的高度和速度，再将准备好的佐剂加到抗原液中，继续搅拌30-40min。一般根据制备体积选择搅拌速度和搅拌时间，如制备200ml疫苗，一般选择500rpm/min搅拌30min即可。

4)分装：稳定好的注射液根据需要分装并写上标签。

7.2保育病猪治疗

1)30龄左右的病猪，挑选30头，随机均匀分成3组，一组注射1ml猪IFN-γ注射液(按照7.1配制的注射液，其中猪IFN-γ的浓度为60μg/ml)，一组注射相同剂量和体积的未配制成注射液的猪IFN-γ，一组作为对照组，进行常规抗生素治疗。注射后连续观察一个月，并跟踪治疗前后的体重、死亡率及精神食欲方面的变化。

2)精神、食欲对比：在跟踪阶段，2组实验组猪只在精神、食欲方面比对照组较好。

3)死亡率对比：在整个跟踪阶段，对照组死亡3头，2组实验组全部存活，在死亡率方面，实验组明显优于对照组(实验组为0，对照组为3/10)。

4)日增重对比：在整个跟踪阶段，注射液实验组日增重明显优于对照组日增重(实验组日增重比对照组高0.09kg/天)，且比另一个实验组(猪IFN-γ未配制成注射液进行治疗)的平均日增重要高0.04kg/天。具体下表所示。

7.3不同表达体系表达的猪IFN-γ对比实验

1)参见申请号为201210525573.7的中国发明专利制备猪IFN-γ蛋白，在实验设计时加入His标签，表达后使用镍柱纯化后用BCA的方法对其进行定量。

2)参见申请号为201210110533.6的中国发明专利制备猪IFN-γ蛋白，在实验设计时加入His标签，表达后使用镍柱纯化后用BCA的方法对其进行定量。

3)参见申请号为201610938474.X的中国发明专利制备猪IFN-γ蛋白，在实验设计时加入His标签，表达后使用镍柱纯化后用BCA的方法对其进行定量。

4)参见7.1的方法将1)、2)、3)的猪IFN-γ蛋白全部制备成相同剂量的注射液，分别记为注射液1(参见申请号为201210525573.7的中国发明专利制备)、注射液2(参见申请号为201210110533.6的中国发明专利制备)、注射液3(参见申请号为201610938474.X的中国发明专利制备)、注射液4(本发明的方法制备)。

5)参见7.2的方法对病猪进行治疗实验，治疗后结果统计如下：

从表中可以看出，注射液4(本发明的方法制备)在病猪治疗中比其他三种方法制备的猪IFN-γ的效果要好。且注射液1和注射液2要比注射液3较好。

实施例8：作为免疫增强剂的免疫实验

8.1疫苗配制

将适量猪圆环病毒PCV2蛋白加入到ISA201VG佐剂中(体积比为46:54)，使猪瘟E2蛋白终浓度为50μg/ml，超声乳化，记为疫苗1；

将适量猪圆环病毒PCV2蛋白和猪IFN-γ加入到ISA201VG佐剂中(体积比为46:54)，使猪瘟E2蛋白浓度为50μg/ml，猪IFN-γ浓度为20μg/ml，超声乳化，记为疫苗2。

具体猪圆环病毒PCV2蛋白的制备参考本发明人申请号为201710602362.1的发明专利申请。

8.2免疫实验

筛选2-3周龄仔猪(猪圆环抗原抗体阴性、蓝耳抗原阴性)15头进行试验，将其平均随机分成3组，每组5头，其中2组分别免疫8.1制备的疫苗1和疫苗2(颈部肌肉注射，每次每头注射1ml相应疫苗)，剩余一组作为空白对照组，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和免疫后14天采集血清，用韩国金诺抗体检测试剂盒测定抗体效价。抗体效价结果如图5所示。

由图中可以看出，疫苗2免疫组S/P值一免后21天(二免前)明显高于疫苗1免疫组，平均S/P值约高0.2左右。在二免后14天，疫苗2免疫组平均S/P值比疫苗1免疫组稍高，约高0.1左右。这说明，在免疫后，含有猪IFN-γ的疫苗在产生抗体时的速度和高度都要比不含猪IFN-γ的疫苗强，即猪IFN-γ在疫苗中作为免疫增强剂有很好的增强免疫的作用。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 浙江海隆生物科技有限公司

<120> 猪IFN-γ的优化基因和采用该优化基因制备猪IFN-γ的方法及其注射液和应用

<160>3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 519

<212> DNA

<213> 猪IFN-γ优化基因序列（DNA）

<400> 1

atgtcttaca ccacatattt cctggccttt cagctgtgcg tgaccctgtg cttctctggc 60

tcctactgcc aggccccctt ctttaaggag atcaccatcc tgaaggacta tttcaacgct 120

agcacatctg atgtgcccaa tggcggccct ctgtttctgg agatcctgaa gaactggaag 180

gaggagtccg acaagaagat catccagtct cagatcgtgt ccttctactt taagttcttt 240

gagatcttca aggataacca ggctatccag cgcagcatgg acgtgatcaa gcaggatatg 300

ttccagaggt ttctgaacgg ctccagcggc aagctgaatg actttgagaa gctgatcaag 360

atcccagtgg ataacctgca gatccagcgg aaggccatct ccgagctgat caaagtgatg 420

aacgacctgt cccccagaag caatctgagg aagcggaaga gaagccagac aatgtttcag 480

ggccagcgcg cttctaagca ccatcaccat caccattga 519

<210> 2

<211> 519

<212> DNA

<213> 猪IFN-γ原始基因序列(DNA)

<400> 2

atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc 60

tcttactgcc aggcgccctt ttttaaagaa ataacgatcc taaaggacta ttttaatgca 120

agtacctcag atgtacctaa tggtggacct cttttcttag aaattttgaa gaattggaaa 180

gaggagagtg acaaaaaaat aattcagagc caaattgtct ccttctactt caaattcttt 240

gaaatcttca aagataacca ggccattcaa aggagcatgg atgtgatcaa gcaagacatg 300

tttcagaggt tcctaaatgg tagctctggg aaactgaatg acttcgaaaa gctgattaaa 360

attccggtag ataatctgca gatccagcgc aaagccatca gtgaactcat caaagtgatg 420

aatgatctgt caccaagatc taacctaaga aagcggaaga gaagtcagac tatgttccaa 480

ggccagagag catcaaaaca ccatcaccat caccattga 519

<210> 3

<211> 172

<212> PRT

<213> 猪IFN-γ蛋白序列(PRT)

<400> 3

Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Thr Leu

1 5 10 15

Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile

20 25 30

Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly Gly

35 40 45

Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys

50 55 60 65

Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile

70 75 80

Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln

85 90 95

Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp

100 105 110

Phe Glu Lys Leu Ile Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys

115 120 125 130

Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser

135 140 145

Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg

150 155 160

Ala Ser Lys His His His His His His

165 170

Claims (6)

1.一种猪IFN-γ的优化基因，其特征在于，所述优化基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种使用权利要求1所述优化基因制备猪IFN-γ的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的基因序列克隆到真核表达载体中，得到重组真核表达载体；

2)将步骤1)中所述重组真核表达载体转染CHO细胞，通过培养、筛选和驯化，得到高效表达猪IFN-γ的CHO细胞株；以及

3)将步骤2)中所述CHO细胞株进行发酵培养，从发酵培养上清中纯化得到猪IFN-γ。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE12.4。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤3)所述发酵培养时，将培养基CD-CHO和培养基Ex-cell 302混合，以得到混合培养基，其中，所述培养基CD-CHO和所述培养基Ex-cell 302的体积比为8:2。

6.一种根据权利要求1所述的猪IFN-γ优化基因在制备重组猪IFN-γ蛋白中的应用。

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