CN117402223A - 一种牛疱疹病毒4型抗原、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种牛疱疹病毒4型抗原、制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明提供的牛疱疹病毒4型亚单位疫苗的制备方法。对牛疱疹病毒4型gB基因进行优化，构建重组质粒，转染至CHO细胞，构建表达牛疱疹病毒4型gB蛋白细胞株，培养表达牛疱疹病毒4型细胞，收获细胞培养上清液、纯化获得制备疫苗用抗原水相，将抗原水相与佐剂混合获得疫苗。该疫苗安全性好、免疫原性强、生产成本低、工艺简单、批次稳定；构建的表达BHV4型gB蛋白的CHO细胞株表达目的蛋白量高，表达蛋白为分泌蛋白更利于纯化。

Description

一种牛疱疹病毒4型抗原、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种牛疱疹病毒4型抗原、制备方法和应用。
背景技术
牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus BHV-4)是丙型疱疹病毒科的新成员，首次从匈牙利患有呼吸***疾病和结膜炎的犊牛身上分离出。后来相继从外表健康的和患有流产、子宫炎、肺炎、腹泻、呼吸道感染、***炎、脓泡性皮炎等牛的不同组织和细胞内分离出该病毒。现在BHV-4已蔓延世界各地，而该病多为牛的隐性感染，和其他病原共同感染牛后可能使临床症状加剧，且表现多样化，给诊断和治疗带来较大困难，对养牛业构成严重威胁。国外对BHV-4的形态结构、致病性、免疫及分子生物学等方面的研究已取得很大进展。
BHV-4病毒基因组为1446kb的双股线形DNA分子。糖蛋白gB蛋白是在病毒膜上最丰富的蛋白之一，其编码基因是疱疹病毒科成员中最保守的一个基因。BHV-4gB是异二聚体，由ORF8(11420nt～14044nt)编码874个氨基酸，被蛋白水解酶切割成2个分别为51ku和46ku的亚体组成了分子的氨基端和羧基端，但仍以二硫键相连。两个亚体分别具有15个、5个与N端连接的糖基化位点。gB基因作为BHV-4病毒粒子的重要组成部分在病毒复制中发挥重要作用，也是刺激机体产生抗体的主要糖蛋白之一。
疱疹病毒gB和gD蛋白能够诱导中和抗体，是目前研究疫苗的靶蛋白。据有关报道，猪伪狂犬gB、gD亚单位疫苗有很好的免疫原性、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白亚单位疫苗也有很好的免疫原性，BHV-4也属于疱疹病毒科，但BHV-4无gD蛋白，据文献报道，BHV-4病毒gH蛋白和gL蛋白与疱疹病毒gD蛋白的作用相似。目前对BHV-4gB蛋白、gL蛋白、gH蛋白能否作为靶蛋白来制备疫苗尚未有人研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供牛疱疹病毒4型gB蛋白，该蛋白免疫原性好，蛋白表达量高。
本发明的第二个目的在于提供上述牛疱疹病毒4型gB蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种牛疱疹病毒4型gB蛋白亚单位疫苗。
本发明的第四个目的在于提供上述牛疱疹病毒4型gB蛋白在制备牛疱疹病毒4型亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
第一方面，本发明提供了牛疱疹病毒4型gB蛋白，编码所述gB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
作为进一步技术方案，所述gB蛋白由CHO细胞表达。
第二方面，本发明提供了一种牛疱疹病毒4型gB蛋白的制备方法，所述制备方法包括：将所述的牛疱疹病毒4型gB蛋白的核苷酸***到PEE12.4载体上，并在其下游***6×His标签，得到重组质粒PEE12.4-gB质粒。
进一步地，将所述重组质粒PEE12.4-gB质粒转染至CHO细胞，获得CHO-gB细胞株。
进一步地，培养获得的CHO-gB细胞株，收获上清纯化后获得所述牛疱疹病毒4型gB蛋白抗原。
作为进一步技术方案，所述CHO-gB细胞株培养步骤为：使用60％Dynamis+40％EX-CELL 302培养基培养，在37℃条件下培养至第6日时，降温至32～34℃，继续培养至第10-15天收获gB蛋白抗原。
进一步地，所述CHO-gB细胞株在37℃培养至第6日时，降温至33℃，继续培养至第15天收获gB蛋白抗原。
进一步地，所述CHO-gB细胞株培养转速为30～100r/min，pH值为7.0～7.4、DO值为20～100。
优选地，所述CHO-gB细胞株培养转速为55r/min，pH值为7.2、DO值为40。
作为进一步技术方案，所述培养到第6日添加补料培养基CD Efficient Feed C培养，添加体积为原培养基的5％～15％。
优选地，所述补料培养基添加体积为原培养基的10％。
作为进一步技术方案，所述培养过程中全程控制葡萄糖浓度，使葡萄糖浓度维持在2.0～3.0g/L。
优选地，所述培养过程中葡萄糖浓度始终维持为2.5g/L。
进一步地，将所述培养物离心，收集离心上清液，用镍柱纯化得到所述牛疱疹病毒4型gB蛋白；
优选地，所述离心条件为4℃，10000r/min离心30分钟。
第三方面，本发明提供一种牛疱疹病毒4型gB蛋白亚单位疫苗，包括上述牛疱疹病毒4型gB蛋白。
进一步地，所述疫苗中牛疱疹病毒4型gB蛋白的含量为80～250μg/mL。
优选地，所述牛疱疹病毒4型gB蛋白的含量为80μg/mL。
作为进一步技术方案，所述牛疱疹病毒4型gB蛋白亚单位疫苗中还包括佐剂。
进一步地，gB蛋白抗原和佐剂的质量比为1:1。
优选地，所述佐剂为双向佐剂，进一步优选为ISA 206 VG佐剂。
第四方面，本发明提供了上述牛疱疹病毒4型gB蛋白在制备牛疱疹病毒4型亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的牛疱疹病毒4型gB蛋白表达量高、免疫原性好，能够有效诱导机体产生相应抗体，适于制备用于预防牛疱疹病毒4型的产品。
本发明提供的牛疱疹病毒4型gB蛋白的制备方法，降低了杂蛋白的产量，提高了目的蛋白的表达量，该方法操作简单，稳定、高效且质量可控。
本发明提供的牛疱疹病毒4型亚单位疫苗，以上述gB蛋白为活性物质，其安全性好，能够有效的激发机体的免疫反应，免疫效果好，副作用小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明重组质粒PEE12.4-gB构建示意图；
图2为本发明培养方法得到的牛疱疹病毒4型gB蛋白半成品有效蛋白量和牛疱疹病毒4型全病毒对比检测的Western-blot结果图，其中M为mark，1为本发明得到的gB蛋白，2为牛疱疹病毒4型全病毒。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例采用的主要试剂及其购买信息材料来源如表1所示：
表1试剂及其厂家
试剂 厂家
PEE12.4质粒 上海林渊生物科技有限公司
CHO-K1细胞 上海生命科学研究院
细胞培养基 Gibco公司
酶制剂 大连TaKaRa生物工程有限公司
分离毒株 BHV4-CJ株
实施例1 gB蛋白的构建
1、gB基因获取、优化
根据近两年牛场流行病料和NCBI公布的序列(GenBank:MN173777.1)，扩增得到一株BHV-4gB基因序列，通进一步过优化在CHO细胞中表达gB基因核苷酸序列得到SEQ ID NO:1，并添加His标签。
2、PEE12.4重组质粒的构建及鉴定
在PEE12.4载体多克隆位点***SEQ ID NO:1，获得重组质粒PEE12.4-gB。具体操作为：使用HindIII、EcoRI双酶切PEE12.4载体和gB基因，T4DNA连接酶将双酶切的载体和片段连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选抗性LB平板的阳性菌，提取质粒，用HindIII、EcoR I双酶切对质粒进行鉴定，将鉴定为阳性的克隆菌进行gB基因测序。
3、细胞转染及单克隆制备
(1)转染前准备：将含重组表达载体的E.coli菌株接种于200mL LB液体培养基中，置36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16小时，取培养的菌液进行质粒提取。
(2)质粒提取：按照Invitrogen公司生产的质粒提取试剂盒进行操作。方法如下：将200mL菌液以4000r/min离心10分钟，去除上清液，加入10mL Buffer R3，菌体悬浮后，将混合液移至50mL离心管中，再加入10mL Buffer L7，并上下翻转数次至液体变透明黏稠，加入10mL Buffer N3，缓慢摇晃数次，以12000r/min离心10分钟。吸取上清加入Spin Column中，重力作用滴落，至不再自然滴落；加入60mL Washing Buffer，重力自然滴落，至不再自然滴落；在重力管下放置一个50mL离心管，加入15ml Elution Buffer自然滴落至下面放置的S0ml离心管内，至不再自然滴落。50mL离心管内加入10.5mL异丙醇，颠倒混匀，以12000r/min离心30分钟，丢弃上清，加入70％乙醇，以12000r/min离心5分钟，丢弃上清液，加入200μL灭菌双蒸水，静置1分钟使质粒DNA充分溶解，收集质粒，检测质粒浓度，根据浓度计算质粒用量。
(3)转染：按细胞密度2×105VC/mL，接种六孔板，每孔2mL，放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育过夜；当细胞交汇度达到80％～90％时开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12；用OPTI-MEM培养基稀释PEE12.4-gB载体线性化质粒，室温静置5分钟；用OPTI-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX，室温静置5分钟；将稀释好的Lipofectamine LTX缓慢加入质粒中轻轻混匀，室温放置5分钟，然后逐滴均匀加入六孔板；37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4～6小时，然后更换成DMEM/F12(含10％FBS，1％青霉素和链霉素)。
(4)单克隆制备：用培养基DMEM/F12(含10％FBS，1％青霉素和链霉素，5μg/mlPuromycin)加压筛选，当阴性对照细胞死亡达到90％以上时，开始单克隆筛选调整活细胞浓度至5VC/mL，接种96孔板，每孔200μL，放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4～6小时，然后置于倒置显微镜下观察，记录单个细胞集落孔，待96孔板中单个细胞株扩增至50％以上时，将细胞消化并转移至48孔板，获得单克隆细胞。
实施例2 CHO-gB细胞驯化
采用逐步降血清的方式，将高效表达的细胞株驯化成适应EX-CELL 302培养基悬浮培养的细胞株。具体步骤为：将阳性细胞接种于摇瓶中，体积为30mL，细胞密度为5×105VC/mL，37℃，5％CO2，100r/min摇床培养，每24小时检测细胞密度及活力。当第一轮驯化细胞存活率达到94％，细胞密度达8×105VC/mL时，进行第二轮驯化培养，培养基为50％(DMEM/F12+10％FBS)+50％EX-CELL 302，细胞免疫密度为5×105VC/mL。第二轮驯化细胞传代培养2代，细胞存活率大于94％时进行第三轮驯化培养，所用培养基为25％(DMEM/F12+10％FBS)+75％EX-CELL 302。第三轮驯化细胞培养3代后，进行第四轮细胞驯化培养。将第四轮驯化细胞再传3代，当细胞密度达到1×106VC/ml，同时细胞存活率达到94％，可进行悬浮培养。
实施例3 5L反应器培养参数筛选
将悬浮驯化后的细胞转移至5L反应器中培养，使用60％Dynamis+40％EX-CELL302培养基培养，具体培养参数筛选见下文，最后将收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测。具体HPLC检测方法为：
(1)材料
a.HPLC仪器液相色谱仪(厂家Waters corporation，型号e2695型或其它厂家生产的适宜型号)。
b.色谱柱选择凝胶过滤色谱柱(厂家Tosoh corporation，型号TSKgel G3000SWXL或其它厂家生产的适宜型号)，分辨范围10～500kD。
c.流动相20mM磷酸盐，200mM NaCl，pH 6.8。
d.标准品：将纯化后的BHV-4gB蛋白进行倍比稀释，浓度梯度为1200μg/mL、300μg/mL、75μg/mL、37.5μg/mL、18.75μg/mL，1mL/管，过0.22μm滤膜后，备用。
e.待检样品：不同培养条件下的BHV-4gB蛋白样品，待检样品过0.22μm滤膜，1ml/管，备用。
(2)HPLC检测
a.确认仪器状态正常，而后用超纯水清洗***与色谱柱。用配置好的流动相平衡色谱柱。
b.进样体积50μL，流速0.5mL/min，样品温度4℃，柱温25℃，单波长280nm采样，采样速率2点/秒，运行时间20min。并将相应样品放入样品盘，开始运行。
c.标准品蛋白与待样品检测完之后，5个标准品根据浓度与紫外吸收峰面积建立标准曲线(R2值应不低于0.999)，各待检样品峰面积代入标准曲线公式，算出相应浓度。
d.关机：用合适的溶剂清洗并保存色谱柱，彻底清洗进样器和***，最后用100％甲醇充满***的所有管路。
3.1培养温度筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为7.2，DO值为40，转速为55r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在2.5g/L，培养到第6日时，降温至30-36℃不同温度培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的10％；继续培养直至第12天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表2。
当培养到第6日时，降温培养温度在32-34℃时，表达量均能高于0.5mg/mL，其中到培养第6日降温至33℃培养时，表达量最高，达0.95mg/mL。
表2降温培养温度对gB蛋白表达量的影响
3.2转速筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为7.2，DO值为40，转速为20～110r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在2.5g/L，培养到第6日时，降温至33℃培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的10％；继续培养直至第12天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表3。
当培养转速在30～100r/min时，表达量均能高于0.5mg/mL，其中转速为55r/min，表达量最高，达0.95mg/mL。
表3不同转速对gB蛋白表达量的影响
转速 20r/min 30r/min 55r/min 70r/min 100r/min 110r/min
表达量 0.4mg/mL 0.55mg/mL 0.95mg/mL 0.9mg/mL 0.58mg/mL 0.46mg/mL
3.3 pH值筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为6.8～7.6，DO值为40，转速为55r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在2.5g/L，培养到第6日时，降温至33℃不同温度培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的10％；继续培养直至第12天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表4。
当PH在7.0～7.4时，表达量均能高于0.5mg/mL，其中PH为7.2时，表达量最高，达0.95mg/mL。
表4不同pH值对gB蛋白表达量的影响
3.4 DO值筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为7.2，DO值为10～110，转速为55r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在2.5g/L，培养到第6日时，降温至33℃不同温度培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的10％；继续培养直至第12天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表5。
当DO在20～100时，表达量均能高于0.5mg/mL，其中DO为40时，表达量最高，达0.95mg/mL。
表5不同DO值对gB蛋白表达量的影响
3.5葡萄糖浓度筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为7.2，DO值为40，转速为55r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于1.5g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在1.5～3.5g/L，培养到第6日时，降温至33℃不同温度培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的10％；继续培养直至第12天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表6。
当葡萄糖浓度维持在2.0g/L以上时，表达量均能高于0.5mg/mL，综合考虑成本，当葡萄糖浓度维持在2.0～3.0g/L时，有较高的表达量，其中维持在2.5g/L时，表达量最高，达0.95mg/mL。
表6不同葡萄糖浓度培养对gB蛋白表达量的影响
葡萄糖浓度 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
表达量 0.45mg/mL 0.8/mL 0.95mg/mL 0.8mg/mL 0.79mg/mL
3.6补料培养基添加体积筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为7.2，DO值为40，转速为55r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于1.5g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在2.5g/L，培养到第6日时，降温至33℃不同温度培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的2％～20％；继续培养直至第12天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表7。
当补料添加体积在5％～15％时，表达量均能高于0.5mg/mL，其中补料培养基添加体积为10％时，表达量最高，达0.95mg/mL。
表7不同补料培养基添加体积对gB蛋白表达量的影响
3.7收获时间筛选
取驯化后细胞进行培养表达，细胞密度为0.25×106VC/ml，培养温度37℃，pH值为7.2，DO值为40，转速为55r/min培养；每隔24小时检测细胞密度、活力及葡萄糖含量，当葡萄糖浓度低于1.5g/L时，单独另外补充葡萄糖，使葡萄糖浓度始终维持在2.5g/L，培养到第6日时，降温至33℃不同温度培养，并添加补料培养基CD Efficient Feed C，补料培养基添加体积为原始培养基的10％；继续培养直至第8～18天收获细胞，收获的细胞上清使用HPLC方法进行蛋白含量检测，结果见表8。
当收获时间在10～15天时，表达量均能高于0.5mg/mL，其中收获时间为15天时，表达量最高，达1.0mg/mL。
表8不同收获时间对gB蛋白表达量的影响
收获时间 8天 10天 12天 15天 18天
表达量 0.4mg/mL 0.6/mL 0.95mg/mL 1.0mg/mL 0.4mg/mL
综上所述，当CHO-gB细胞株在培养温度37℃，转速为30～100r/min，pH值为7.0～7.4、DO值为20-100，葡萄糖浓度控制在2.0～3.0g/L的条件下培养，培养至第6日时，降温至32～34℃，并添加补料培养基CD Efficient Feed C培养，添加体积为原培养基的5～15％，继续培养至第10～15天收获蛋白，蛋白含量均能维持在较高水平，均高于0.5mg/mL；而当CHO-gB细胞株在培养温度37℃，转速为55r/min，pH值为7.2、DO值为40，葡萄糖浓度控制在2.5g/L的条件下培养，培养至第6日时，降温至33℃，并添加补料培养基CD Efficient FeedC培养，添加体积为原培养基的10％，继续培养至第15天收获蛋白，蛋白表达量最高，可达1.0mg/mL。
实施例4 BHV4-gB亚单位疫苗蛋白含量筛选
本实施例使用实施例1-2的构建方法，在实施例3最优培养条件下培养、收获获得的蛋白进行不同蛋白含量疫苗的制备，具体如下。
1、蛋白的离心、纯化
将CHO-gB表达蛋白、细胞混悬液1000r/min离心后收获离心上清液。将上清液进行镍柱纯化，收集纯化后的液体用HPLC方法进行蛋白含量和纯度检测，结果蛋白含量为2.5mg/mL，纯度为95％。
2、蛋白的稀释
将纯化的蛋白用PBS稀释成80μg/mL、160μg/mL、300μg/mL、500μg/mL四种不同浓度溶液备用。
3、不同含量蛋白疫苗的配制
将上述四种不同蛋白含量的溶液分别和双向佐剂混合乳化，配制成40μg/mL、80μg/mL、150μg/mL、250μg/mL四种蛋白含量的疫苗。按佐剂:水相(质量比)＝1:1的比例混合，具体为：提前将水相和佐剂都置于33±1℃水浴锅中预热30分钟，先将预热好的佐剂倒入2L烧杯中搅拌，转速为400r/min，然后将水相缓慢加入到佐剂中，搅拌30分钟，使水相与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂疫苗。乳化结束后，将烧杯置于10～12℃水浴锅中静置1小时；分装前，调整转速10～20r/min，搅拌5分钟，搅拌结束后定量分装，加盖密封、贴签，于2～8℃保存。
4、疫苗检验
4.1疫苗无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录对制备的不同蛋白含量进行无菌检验，应符合规定。
4.2安全检验
选取3月龄牛疱疹病毒4型抗原阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感犊牛25头，将实验用动物分成5组，1～4作为免疫组，每组5头，免疫组分别颈部肌肉注射四种不同蛋白含量疫苗2mL/头，另取5头作为对照组，注射生理盐水2ml/头，观察14日，无任何临床症状，无死亡。
4.3效力检验
4.3.1中和抗体检测
选取3月龄牛疱疹病毒4型抗原阴性，中和抗体不高于1:4的健康易感犊牛25头，将实验牛分成5组，1～4作为免疫组，每组5头，免疫组分别肌肉注射四种不同蛋白含量疫苗1ml/头，另取5头作为对照组，注射生理盐水1ml/头，21日后以相同的途径和剂量进行加强免疫。免疫前和加强免疫后21日进行采血，进行中和抗体测定。结果见表9。
其中中和抗体测定方法为：
(1)材料：MDBK细胞，购自中国兽医药品监察所,由天康生物制药有限公司传代与保存；“牛疱疹病毒4型CJ株”检验用毒，由本实验室分离鉴定、保存；胎牛血清、马血清，购自Hyclone公司；DMEM细胞培养液，购自Hyclone公司；检测用96孔U型板，购自BD公司。
(2)方法
a.将待检血清、阳性血清和阴性对照血清56℃水浴灭活30分钟。
b.用DMEM(含2％马血清)对灭活后的待检样品、阳性对照和阴性对照血清在96孔U型板内进行2倍(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32…1:256稀释)系列稀释。每个稀释度4孔，每孔100μL。
c.用DMEM(含2％马血清)将检验用毒病毒稀释成病毒含量为2000TCID50/ml的病毒液。
d.将稀释好的病毒液按每孔100μL加到含有血清的96孔U型板中，置37℃5％CO2培养箱内中和1小时。
e.取培养24～48小时的96孔培养板细胞，弃去培养液，将中和1小时的病毒与血清的混合物转移至96孔培养板相应的孔内，每孔100μL，置37℃5％CO2培养箱中培养并观察5日，用Spearman Karber法计算血清中和抗体效价。
f.病毒反滴定：另取一新的96孔板进行病毒含量的反滴定，每孔加入100μL DMEM(含2％马血清)。在第1排每孔加入100μL(含200TCID50/ml)病毒液，从第1排连续2倍梯度稀释病毒液到11排，12排为阴性对照；从第12排到第1排加入100μL的无血清的DMEM(含2％马血清)。第12排为阴性对照组(N)，置37℃5％CO2培养箱中约1小时。将上述病毒液每孔吸取100μL，分别免疫于已长成良好单层、弃去培养液的MDBK细胞96孔培养板，置37℃5％CO2培养箱中培养并观察5日，用Spearman Karber法计算中和抗原的TCID50。
(3)试验成立判定条件
a.阴性细胞对照应无细胞病变；b.中和抗原的滴度范围应在500～3000TCID50/ml；c.阳性对照血清抗体效价与原测定效价相差1个滴度以内；d.阴性对照血清效价不高于1∶4。
4.3.2攻毒
加强免疫后21日攻击强毒，毒株为天康生物制药有限公司分离保存的牛疱疹病毒4型CJ株，攻毒剂量为5×107.0TCID50/mL/头，***给毒，攻毒后观察7天，结果见表9。
表9攻毒观察结果
由表9数据结果表明，应用本发明提供的牛疱疹病毒4型gB蛋白的培养表达方法得到的牛疱疹病毒4型亚单位疫苗免疫犊牛，当亚单位疫苗蛋白含量在80-250μg/mL时，能达到5/5保护，同时考虑成本，亚单位疫苗蛋白含量为80μg/mL时为最优。
对比例1不同序列蛋白疫苗、全病毒疫苗对比
一、不同序列蛋白疫苗
从不同的BHV4病料中扩增BHV-4gB’序列、BHV-4gH序列和BHV-4gL序列，用实施例1的方法分别构建得到BHV-4gB’蛋白(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)、BHV-4gH蛋白(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)和BHV-4gL蛋白(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，分别用实施例3筛选得到的最佳条件进行培养，各序列蛋白表达量见表10，而后按实施例4的方法，分别配制成80μg/mL蛋白含量的不同疫苗备用。
表10各序列蛋白表达量
蛋白 BHV-4gB’蛋白 BHV-4gH蛋白 BHV-4gL蛋白
表达量 0.2mg/mL 0.15mg/mL 0.4mg/mL
可见，在相同的方法下获得的BHV-4gB’蛋白、BHV-4gH蛋白和BHV-4gL蛋白，他们的表达量均低于本发明获得的BHV-4gB蛋白。
二、全病毒BHV-4灭活疫苗
1、BHV4 CJ株全病毒培养方法
将牛疱疹病毒4型CJ株接种到长满单层的Hela细胞，至细胞病变达95％时收获冻融，8000r/min离心，收获上清液获得牛疱疹病毒4型全病毒。
2、病毒含量检测
用DMEM细胞培养液将牛疱疹病毒4型CJ株作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8四个稀释度，分别接种已长成良好Hela细胞单层、弃去培养液的96孔培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔0.1mL，同时设正常细胞对照8个孔，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察4日，按Spearman-Karber法计算TCID50。病毒含量应不低于107.0TCID50/mL，结果见表11。
表11对比例提供病毒含量检测结果
组别 病毒含量(TCID50/ml)
全病毒BHV-4灭活疫苗 107.0
3、纯净按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
4、灭活向牛疱疹病毒4型(CJ株)液中加入经无菌过滤的BEI溶液，使其终浓度为0.003mol/L，37℃灭活36～40小时，期间每1～2小时搅拌一次，每次5分钟。
5、灭活阻断灭活后的病毒液分别加入终浓度0.03mol/L的硫代硫酸钠溶液，充分混匀室温静置1小时，置2～8℃保存，同时进行灭活检验和无菌检验。
6、灭活检验将灭活阻断后样品加入Hela细胞中，分别接种3瓶长满Hela细胞单层的5ml细胞培养瓶，24小时后换液，3～4日后进行传代培养，观察CPE，连续2代应无CPE。
7、灭活疫苗的制备将灭活检验合格的病毒液和经过过滤除菌的Montanide ISA206VG佐剂，按质量比1︰1混合，混合温度不低于31℃，以350r/min搅拌乳化5分钟，制成水包油包水型(W/O/W)油乳剂疫苗。
8、疫苗检验
8.1疫苗无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录对五种疫苗进行无菌检验，应符合规定。
8.2安全检验
选取3月龄牛疱疹病毒4型抗原阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感犊牛30头，将实验用动物分成6组，1～5作为免疫组，每组5头，免疫组分别颈部肌肉注射对比例中四种不同序列蛋白含量疫苗及提供的牛疱疹病毒4型全病毒灭活疫苗2ml/头，另取5头作为对照组，注射生理盐水2ml/头，观察14日，无任何临床症状，无死亡。
8.3效力检验
8.3.1中和抗体检测
选取3月龄牛疱疹病毒4型抗原阴性，中和抗体不高于1:4的健康易感犊牛30头，将实验牛分成6组，1～5作为免疫组，每组5头，免疫组分别肌肉注射对比例中四种不同序列蛋白含量疫苗及提供的牛疱疹病毒4型全病毒灭活疫苗1ml/头，另取5头作为对照组，注射生理盐水1ml/头，21日后以相同的途径和剂量进行加强免疫。免疫前和加强免疫后21日进行采血，进行中和抗体测定，结果见表12。
8.3.2攻毒
按实施例4相同攻毒方法，攻毒后观察7天，结果见表12。
表12攻毒观察结果
由表11数据结果表明，全病毒BHV-4灭活疫苗组和不同序列蛋白疫苗组免疫牛只，所产生的中和抗体水平和攻毒保护效果均没有本发明构建的BHV-gB蛋白(核苷酸序列SEQID NO.1)疫苗组保护效果好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.牛疱疹病毒4型gB蛋白，其特征在于，编码所述gB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的gB蛋白，其特征在于，所述蛋白由CHO细胞表达。
3.如权利要求1所述gB蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将含有编码权利要求1所述gB蛋白的核苷酸***到PEE12.4载体上，并在其下游***6×His标签，得到重组质粒PEE12.4-gB质粒；
(2)将重组质粒PEE12.4-gB质粒转染至CHO细胞，获得CHO-gB细胞株；
(3)培养获得的CHO-gB细胞株，收获上清纯化后获得牛疱疹病毒4型gB蛋白抗原。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养步骤(3)具体为：CHO-gB细胞株在37℃下培养至第6日时，降温至32～34℃，继续培养至第10-15天收获gB蛋白抗原；
优选地，所述培养步骤(3)具体为：CHO-gB细胞株在37℃下培养至第6日时，降温至33℃，继续培养至第15天收获gB蛋白抗原；
更优选地，所述培养转速为30～100r/min，pH值为7.0～7.4、DO值为20～100。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，使用60％Dynamis+40％EX-CELL 302培养基培养，培养第6日添加补料培养基CD Efficient Feed C，所述补料培养基的添加体积为原培养基的5％～15％。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述补料培养基的添加体积为原培养基的10％。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，培养过程中控制葡萄糖的浓度，使葡萄糖浓度维持在2.0～3.0g/L，优选地，所述葡萄糖浓度维持在2.5g/L。
8.一种牛疱疹病毒4型gB蛋白亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗由权利要求3-7任一项所述制备方法制备得到。
9.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中牛疱疹病毒4型gB蛋白的含量为80～250μg/mL；优选地，所述牛疱疹病毒4型gB蛋白的含量为80μg/mL。
10.如权利要求1-8中任一项所述的牛疱疹病毒4型gB蛋白在制备牛疱疹病毒4型亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
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