CN109789167A - 用于产生细胞衍生的微丝网络的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了细胞衍生的微丝网络。还提供了通过在基质支持物和细胞培养基中培养细胞来产生微丝网络的方法，其中细胞增殖并形成聚集的细胞团，其在细胞团外部和周围产生微丝，并且其中细胞外微丝连接并形成连续的细胞外微丝网络；以及用于治疗医学病症以及促进创伤修复和组织再生的方法，其包括将微丝网络施加于需要治疗的区域。
Description
相关申请数据
本申请要求于2017年4月14日提交的美国临时申请第62/485,422号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。
政府权益的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的批准号第CA68262号下于政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明涉及对创伤愈合和组织再生有用的方法和组合物。
背景技术
创伤修复涉及复杂的生物学过程，并且管理具有大表面积的创伤是巨大的挑战(Singer,A.J.和Clark,R.A；《皮肤创伤愈合》(Cutaneous wound healing)；The NewEngland journal of medicine 341,738-746(1999)。Passier,R.,van Laake,L.W.和Mummery,C.L.《来自心脏的基于干细胞的疗法和知识》Stem-cell-based therapy andlessons from the heart.Nature 453,322-329(2008))。在工业化世界中，每年超过1亿患者受创伤之苦(Takeo，M.，Lee，W.和Ito，M.《伤口愈合与皮肤再生》(Wound healing andskin regeneration).Cold Spring Harbor perspectives in medicine 5，a023267(2015))。在哺乳动物器官中，受伤后，破碎和/或受影响的细胞立即释放各种分子，其在免疫***、血液凝血级联、炎症通路、和任何相邻的未受伤细胞中介导不同的细胞内和细胞间通路(Gurtner，G.C.，Werner，S.，Barrandon，Y.和Longaker，M.T.《创伤修复和再生》(Woundrepair and regeneration).Nature 453，314-321(2008))。在受伤的正常响应期间，许多类型的细胞(包括中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、和干细胞及其衍生物)在信号传导、基因表达、和表型中发生显著变化，其导致细胞迁移、增殖、和分化(Lane，S.W.，Williams，D.A.&Watt，F.M.《调节干细胞生态环境以进行组织再生》(Modulating the stem cell niche for tissue regeneration).Nature biotechnology32，795-803(2014))。动态和往复的细胞-细胞外基质(ECM)以及细胞-细胞相互作用在炎症、新组织形成、和重塑的复杂过程中精确地协调各种通路的活化和关闭。一些真核生物保留了通过再生在它们的成年期完全复制原始组织结构和功能的能力，对其过程仍然知之甚少。出于未知的原因，人类仅在胎儿期发育中表现出该能力(Zielins，E.R.等.《创伤愈合：更新》(Wound healing:an update).Regenerative medicine 9，817-830(2014))。病理生理学会导致如非愈合性溃疡中所见的损害的愈合、或如肥厚性疤痕和瘢痕疙瘩中发现的“过度愈合”。此外，不恰当的干预会引发恶性转化(Chidgey，A.P.，Layton，D.，Trounson，A.和Boyd，R.L.《基于干细胞疗法的耐受性策略》(Tolerance strategies for stem-cell-based therapies).Nature 453，330-337(2008))。尽管干细胞在转化研究中有希望，临床创伤愈合形态中的同种异体和自体干细胞疗法的使用仍然面对许多调节障碍(Rose，L.F.和Chan，R.K.《烧伤创伤微环境》(The Burn Wound Microenvironment).Advances inwound care，106-118(2016))。对人类进行复杂、慢性和大面积创伤的管理仍然是一项挑战。
被认为适用于创伤处理，材料/药剂应促进表皮再生和创伤愈合，其不会引起肿瘤发育，减少疼痛，降低感染风险，减少美容畸形；这些材料的选择是现代创伤管理和再生医学的主要组成部分(Lutolf，M.P.和Hubbell，J.A.《合成生物材料作为组织工程中形态发生的指导性细胞外微环境》(Synthetic biomaterials as instructive extracellularmicroenvironments for morphogenesis in tissue engineering).Naturebiotechnology 23，47-55(2005))。目前可用的人造创伤愈合基质是合成的和/或包含使用各种技术制造的天然仿生材料；这样的材料包括硅树脂、生物膜(biobrane)、纳米原纤、超分子材料、和呈现单个或多个生化ECM衍生信号的支架(Warner，P.M.，Coffee，T.L.和Yowler，C.J.《门诊烧伤管理》(Outpatient burn management).The Surgical clinics ofNorth America 94，879-892(2014)；Hubbell，J.A.《组织工程中的生物材料》(Biomaterials in tissue engineering).Bio/technology 13，565-576(1995))。ECM由细胞分泌蛋白质和葡糖胺聚糖的互锁网组成。天然的ECM具有表面拓扑、体积刚度、弹性、剪切力、和孔径的生物物理特性，它们对于线索引导(cue-guided)的细胞迁移和干细胞分化很重要。另外，ECM还锚定多种可溶性生长因子、信号受体和粘附分子，其影响细胞命运。重建的ECM和ECM衍生材料可能缺乏天然拓扑信息、可溶性生长因子和锚定因子浓度。尽管现有技术持续进步，目前尚没有获得具有完整和天然的ECM生物物理、生物化学、和生物力学特性以使其成为用于创伤修复的理想材料的大面积(平方英尺规模)天然生物材料(Chien，K.R.《再生医学和人类疾病的人体模型》(Regenerative medicine and human models ofhuman disease).Nature 453，302-305(2008))。
创伤感染仍然是一个具有挑战性的问题，并且代表着相当大的医疗负担。用以防止微生物污染和繁殖的创伤处的物理屏障对创伤感染预防而言是必需的。创伤(急性或慢性)通常含有微生物，包括细菌、真菌和病毒(Sood，A.，Granick，M.S.，and Tomaselli，N.L.(2014)《创伤敷料和比较效果数据》(Wound Dressings and Comparative EffectivenessData).Advances in wound care3，511-529，Lall，R.R.，Wong，A.P.，Lall，R.R.，Lawton，C.D.，Smith，Z.A.，和Dahdaleh，N.S.(2014)《脊柱器械术后深部伤口感染的循证管理》(Evidence-based management of deep wound infection after spinalinstrumentation).Journal of clinical neuroscience:official journal of theNeurosurgical Society of Australasia，Misic，A.M.，Gardner，S.E.，和Grice，E.A.(2014)《创伤微生物组：检测慢性创伤愈合受损微生物作用的现代方法》(The WoundMicrobiome:Modern Approaches to Examining the Role of Microorganisms inImpaired Chronic Wound Healing).Advances in wound care 3，502-510)。创伤中细菌的存在会导致创伤污染、繁殖和感染(Adam，E.N.，和Southwood，L.L.(2006)《马的外科和创伤性伤口感染，蜂窝组织炎和肌炎》(Surgical and traumatic wound infections,cellulitis,and myositis in horses).The Veterinary clinics of NorthAmerica.Equine practice 22，335-361，viii)。创伤感染期间，细菌繁殖，愈合被破坏，并且创伤组织受损(局部感染)(Gomathysankar，S.，Halim，A.S.，和Yaacob，N.S.(2014)《综述：脂肪来源的干细胞诱导角质形成细胞在壳聚糖支架上的增殖及其在伤口愈合中的作用》(Proliferation of keratinocytes induced by adipose-derived stem cells on achitosan scaffold and its role in wound healing,a review).Archives of plasticsurgery 41，452-457，Grazul-Bilska，A.T.，Johnson，M.L.，Bilski，J.J.，Redmer，D.A.，Reynolds，L.P.，Abdullah，A.，和Abdullah，K.M.(2003)《创伤愈合：生长因子的作用》(Wound healing:the role of growth factors).Drugs of today 39，787-800)。细菌可能导致附近组织中的感染扩散或全身性感染，这会引起全身性疾病。急性创伤包括手术和外伤创伤、以及烧伤(Palmieri，T.L.，Przkora，R.，Meyer，W.J.，3rd，和Carrougher，G.J.(2014)《测量烧伤结果》(Measuring burn injury outcomes).The Surgical clinics ofNorth America 94，909-916，Jeng，J.，Gibran，N.，和Peck，M.(2014)《在灾难和其他严峻的环境中烧伤护理》(Burn care in disaster and other austere settings).TheSurgical clinics of North America 94，893-907)。例如，仅在美国，每年约有500,000人就烧伤进行治疗(Heard，J.P.，McDonald，K.M.，Xing，Y.，Kluesner，K.M.，Liao，J.，和Wibbenmeyer，L.A.(2014)《烧伤创伤蜂窝组织炎相关因素的区域和国家综述》(Regionaland National Review of Factors Associated With Burn Wound Cellulitis).Journalof burn care&research:official publication of the American Burn Association)。慢性创伤包括糖尿病足溃疡、静脉性腿部溃疡、动脉性腿部/足部溃疡和压力性溃疡(Moran,M.E.(2014)《硬皮病和基于证据的肢端溃疡非药物治疗方式：***性综述》(Scleroderma and evidence based non-pharmaceutical treatment modalities fordigital ulcers:a systematic review).Journal of wound care 23,510-516,Baltzis,D.,Eleftheriadou,I.,和Veves,A.(2014)《糖尿病创伤愈合受损的发病机制和治疗：新见解》(Pathogenesis and treatment of impaired wound healing in diabetesmellitus:new insights).Advances in therapy 31,817-836)。尽管创伤感染的有效管理要求需要多学科的方法，但保护受损组织免受微生物侵害的物理屏障是最佳的感染控制程序(Cheadle，W.G.(2006)《手术部位感染的危险因素》(Riskfactors for surgical siteinfection).Surgical infections 7Suppl 1，S7-11)。
天然细胞的细胞质膜是含有数千种由磷、糖链等修饰的膜蛋白的双脂膜。细胞的细胞质膜可有效地形成对微生物感染的物理屏障(Hahler,B.(2006)《手术创伤开裂》(Surgical wound dehiscence).Medsurg nursing:official journal of the Academyof Medical-Surgical Nurses 15,296-300；quiz 301)。然而，单个细胞的细胞质膜面积太小(μm2水平)而不能被用于临床。细胞膜的易碎性和微小的厚度(5～10nm)使得难以收集多个细胞的细胞质膜并将它们重新组织成用于创伤护理的有用膜。仍然需要可用于创伤修复和有效预防和管理创伤感染的大面积膜。
发明内容
本公开涉及该需求，并且基于以下发现：在基质支持物中生长的天然原代人类上皮细胞产生了大面积微丝网络。根据一个方面，所述微丝网络起到物理屏障的作用，用于保护和管理创伤感染，包括慢性和急性创伤、烧伤护理、急性和手术创伤护理。如本文所述，培养于细胞基质的正常的原代人类上皮细胞产生大面积的微丝网络。根据另一个方面，所述微丝网络被处理以去除细胞或核。根据一个方面，所述微丝网络可被应用于创伤并且作为物理屏障起作用以防止微生物诱导的创伤感染。工程化的大面积微丝网络-基质复合层可有效防止微生物(包括细菌、真菌和病毒)的感染。
微丝作为真核细胞中的主要细胞骨架聚合物，通过肌动蛋白亚基和肌动蛋白结合蛋白质被聚合。微丝对细胞***和胞质***、细胞形状维持、囊泡运输、信号传导和细胞运动而言是必需的。大多数动物细胞保持微米(μm)规模的细胞尺寸，这将细胞骨架微丝网络的面积限制在相同的规模内。根据某些方面，在Matrigel上体外培养的人类上皮细胞团产生超大细胞外微丝网络(EMN)。这样的EMN促进细胞迁移。根据一个方面，这些EMN可生长到平方英尺(ft2)尺寸。根据另一个方面，这些微丝网络具有在通常的创伤愈合疗法中的实用性。根据某些方面，人类上皮细胞团所产生的EMN包括广泛的膜封闭微丝。根据一个方面，对微丝网络进行处理以去除细胞团，以生产人工的、细胞少的、且为ft2-规模的超大型多层格架(UML)。根据另一个方面，这些UML可用于促进表皮再生。根据又一个方面，这些UML可用于小鼠的二度热烧伤创伤的愈合。根据某些方面，人类上皮细胞产生的EMN促进/利于细胞迁移。根据一个方面，细胞去除后获得的UML可被用于促进创伤愈合和组织再生。
在一个方面中，本公开的实施方式涉及包含在多个微丝源区域之间以连续的格架或网结构互连的细胞衍生的微丝的网络。
在另一个方面中，本公开的实施方式涉及产生微丝网络的方法，其包括以下步骤：在基质支持物和细胞培养基中培养细胞，其中细胞增殖并形成聚集的细胞团，且其中细胞团在细胞团外部和周围产生微丝，且其中细胞外微丝连接并形成连续的细胞外微丝网络。在某些实施方式中，对微丝的网络进行处理以从网络中去除细胞的核和/或细胞。在一个实施方式中，细胞团形成于基质支持物的顶部。
在一个实施方式中，所述网络的微丝是细胞外微丝。在另一个实施方式中，所述微丝是膜封闭的。在一个实施方式中，所述微丝包含肌动蛋白。在另一个实施方式中，所述肌动蛋白包括β-肌动蛋白。在一个实施方式中，所述微丝长度为约1-1000μm。在另一个实施方式中，所述微丝是分支的。在又一个实施方式中，所述微丝具有约2-10个分支。在一个实施方式中，多根微丝排列在一起，并形成各种架构结构的束。在另一个实施方式中，所述微丝源区域形成连续格架或网结构的连接节点。在一个实施方式中，所述网络进一步包括粘附材料。在一个实施方式中，所述粘附材料与微丝结合并扩大微丝的直径。在一个实施方式中，所述网络具有约1μm2至约500cm2的面积和约1nm至约0.5cm的厚度。在另一个实施方式中，所述网络是单层或多层。在又一个实施方式中，微丝的表面积大于细胞内细胞骨架微丝网络的表面积的当量单位。
在一个实施方式中，所述网络是多孔的。在一个实施方式中，孔径的直径范围是约0.1至5μm。在一个实施方式中，所述网络进一步包含生物活性剂和/或无生物活性剂。在另一个实施方式中，所述生物活性剂是治疗药物。在一个实施方式中，所述微丝源区域包含细胞。在另一个实施方式中，所述网络存在于基质支持物上。在又一个实施方式中，所述基质支持物是可生物降解的。在一个实施方式中，所述网络存在于Matrigel基质支持物上。在一个实施方式中，所述网络没有来自细胞的核。在另一个实施方式中，所述网络没有细胞。在一个实施方式中，所述微丝源区域包含具有或不具有遗传修饰的真核细胞。在一个实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。在又一个实施方式中，所述人类细胞是人类乳腺上皮细胞。在一个实施方式中，所述微丝被包埋于基质支持物的顶部表面。在一个实施方式中，所述基质是Matrigel。在一个实施方式中，所述基质支持物抑制细胞附着和迁移。
在又一个方面，本公开提供了一种通过将微丝网络施加于需要治疗的区域来治疗医学病症的方法。在一个实施方式中，所述微丝网络与基质一起施加。在另一个实施方式中，所述微丝网络在没有基质的情况下被施加。在一个实施方式中，所述医学病症是创伤或受伤的组织。在另一个实施方式中，所述微丝网络促进愈合和/或保护创伤或受伤的组织不被感染。在一个实施方式中，所述医学病症是烧伤。在一个实施方式中，所述方法包括增强或促进受损皮肤的表皮再生。在另一个实施方式中，所述方法还包括在将微丝网络施加于需要治疗的区域之前、同时或之后给予治疗药物。
在相关的方面中，本公开设想一种在体外产生细胞衍生的微丝的连续网络的方法，包括：在使得细胞簇在细胞簇外部和周围产生微丝、并且细胞外微丝连接并在基质基材的表面上的细胞簇之间形成微丝的连续细胞外网络的条件下，在基质基材的表面上培养多个细胞簇。在一个实施方式中，所述细胞簇间隔开的平均距离为约1微米至约1000微米。在另一个实施方式中，连接细胞簇的微丝具有平均约1微米至约1000微米的长度。在一个实施方式中，所述连续细胞外微丝网络是多层格架。在另一个实施方式中，所述微丝是分支的。在一个实施方式中，所述连续细胞外微丝网络是多层格架，包括长度在约10微米至约1000微米之间的长微丝和长度在约1微米至约10微米之间的短微丝。在另一个实施方式中，微丝的连续细胞外网络具有约0.01cm2至500cm2的表面积。在一个实施方式中，所述连续细胞外微丝网络是网。在另一个实施方式中，所述连续细胞外微丝网络是多孔的。在一个实施方式中，细胞植入在基质基材的表面，在那里细胞迁移和聚集成预聚体(precluster)并增殖以形成细胞簇。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括从连续细胞外微丝网络去除细胞核或细胞簇。在一个实施方式中，所述基质基材抑制细胞的附着和/或迁移。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括从连续细胞外微丝网络分离基质基材。
根据另一个方面，提供一种用于促进创伤修复和/或组织再生的方法，其包括将微丝网络施加于有需要的位置。在某些实施方式中，所述微丝网络在有或没有基质的情况下被施加。在一个实施方式中，所述微丝网络形成平方英尺(ft2)-规模的超大微丝格架(UML)。在另一个实施方式中，所述UML构建了一个用于细胞迁移的环境。在一个实施方式中，所述微丝网络是多层且三维的(3D)。在另一个实施方式中，所述方法包括去除细胞团并产生无细胞的UML(AUML)。在一个实施方式中，所述AUML促进创伤修复。在另一个实施方式中，所述方法包括将AUML施加于受伤处。在一个实施方式中，施加AUML允许角质细胞在表皮再生的上皮中生成大通道。在另一个实施方式中，所述大通道为创伤修复部位提供细胞和营养物质的途径。在某个实施方式中，所述微丝网络保护受伤处不受感染。在一个实施方式中，该方法包括增强或促进受伤皮肤的表皮再生。在另一个实施方式中，所述创伤是二度热烧伤创伤。在又一个实施方式中，该方法还包括在将微丝网络施加于需要治疗的区域之前、同时或之后给予治疗药物。
应注意，在该公开文件以及特别在权利要求和/或段落中，诸如“包含”等的术语具有美国专利法中对其赋予的含义，例如，其可表示“包括”等；且诸如“基本由……组成”的术语具有美国专利法中对其赋予的含义，例如，其允许未明确列出的要素，但排除发现于现有技术中或影响本发明基本或新颖性的要素。公开了这些和其他实施方式，其在下述发明详述中明显并包括于其中。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明的上述和其他特征和其他优点，其中：
图1A-F显示人类乳腺上皮细胞(HMEC)在Matrigel基质上形成的团的图。图1A描绘了2D环境中个体人类乳腺上皮细胞(HMEC)呈现为不规则形状(左)，同时在(右)3D(三维)的Matrigel培养物中始终显示球状形态。HMEC以低细胞密度(6孔板中每孔1×103个细胞)被植入到厚Matrigel基质上(20～30μm深度)。在细胞植入后5小时(h)拍摄反相对比图像。图1B是代表性的甲苯胺蓝图像，显示球形HMEC的横截面，其具有暴露于Matrigel基质(MM)的最小表面积。图1C是细胞群横截面的代表性甲苯胺蓝图像，显示两个球形堆叠的HMEC(白色星号)与Matrigel基质(MM)没有表面接触。图1D是丘状细胞团的横截面的代表性甲苯胺蓝图像，显示多个堆叠的HMEC(白色星号)不与Matrigel基质(MM)接触。图1E是代表性的反相对比图像，显示HMEC在细胞迁移、聚集、增殖和堆叠后形成许多细胞团。图1F是代表性的苏木精和曙红(H&E)染色图像，显示细胞团在细胞团外部产生超大网(红色箭头)，其围绕细胞团并覆盖孔(6孔板)或10cm培养皿中的整个Matrigel表面。超大网中有许多大(直径＞40μm)而圆的孔(蓝色箭头)。显示了孔的边缘(绿色箭头)。比例尺＝10μm。
图2A-B显示了人类细胞团产生超大和连续细胞外微丝网络的荧光图像。图2A显示了组合物的荧光显微镜检查和细胞外微丝网络的架构。将编码增强型绿色荧光蛋白质(EGFP)标记质膜Ca2+-ATP酶2(EGFP-PMCA2)的质粒瞬时转染到原代正常的人类乳腺上皮细胞(HMEC)中。将具有EGFP-PMCA2过表达的HMEC移植到Matrigel基质表面并培养64小时(h)。HMEC迁移、聚集、增殖，并在Matrigel层上形成细胞团(CM)。左图：DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色图像显示细胞团之间和周围没有细胞核材料。中图：细胞团在细胞团的外部产生大量膜封闭的、长的、分支的细胞外微纤维(ECMF，白色箭头)。嵌套的微纤维在细胞团周围形成大网络。长的细胞外微纤维(粗体白色箭头)连接两个细胞团(CM1和CM2)。右图：合并的图像显示嵌套的细胞外微纤维网络位于产生它们的细胞团外部。图2B显示肌动蛋白组成的微丝的荧光图像。将编码EGFP-PMCA2和mCherry标记-β-肌动蛋白(mCherry-β-肌动蛋白)的质粒瞬时共转染到HMEC中。细胞团(CM)产生的微纤维是基于肌动蛋白和膜封闭的细胞外微丝(ECMF，白色箭头)。细胞外微丝形成网络和束(黄色箭头)。显示了细胞外微丝连接节点(EMCN，紫色箭头)、细胞外微丝组装网络空间(EMNS，白色星号)、和微丝粘附材料(AM)。比例尺＝20μm。
图3显示了细胞外微丝的长度分布。总共385个随机选择的HMEC细胞外微丝的长度分布：约51％在1～5μm的范围内，22.6％在5～10μm的范围内，8.9％在10～20μm的范围内，5.2％在20～40μm的范围内，2％在40～100μm的范围内，1％在100～300μm的范围内，并且2％高达1000μm。
图4A-E显示细胞外微丝网络的发育的荧光图像和条形图。经时的HMEC细胞外微丝网络发育的代表性的荧光图像。将具有EGFP-PMCA2过表达的HMEC移植到Matrigel基质表面上并培养一段时间。图4A-D是显示细胞外微丝和微丝连接节点的数量迅速增加、快速形成多层3D细胞外微丝网络的图像。比例尺＝20μm。图4E显示发育期间细胞外微丝中增长的定量分析(平均值±标准差，n＝每个时间点的5个区域，每个区域直接位于两个HMEC团之间)。
图5A-C显示了细胞外微丝网络的架构结构的图像。图5A显示了合并的荧光图像，细胞外微丝(ECMF，红色箭头)通过细胞外微丝连接节点(EMCN，紫色箭头)与规则和不规则形状的空间(星号)连接。示出了细胞外微丝网络中的三角(白色星号)、四边形(紫色星号)和五边形(黄色星号)空间。大束(青色箭头)由几个长的、平行的和扭曲的细胞外微丝形成。带有白色虚线的区域被放大并显示在(b)中。图5B显示两个细胞外微丝扭曲并形成具有两个环的扭曲束(蓝色箭头)。图5C是显示(b)中的具有环的扭曲束的卡通图。比例尺＝10μm。
图6A-B显示细胞外微丝形成超大、多孔、多层且致密的网络的荧光图像。图6A显示由10cm培养皿中的多个网络组成的超大、连续、细胞外微丝网络的一部分的荧光图像。将具有EGFP-PMCA2过表达的HMEC移植到Matrigel基质表面并培养80小时(h)。显示了两个细胞团和围绕它们的细胞外微丝网络。超大网络中散布着几个未知的膜封闭的圆体，没有核材料(白色箭头)。合并的图像中的白色框区域被放大并显示在(b)中。图6B显示(图6A)中白色框区域的放大的图像。两个细胞团的细胞外微丝网络广泛连接并形成连续超大网络复合体，没有中断。示出了在相同的超大网络中的聚焦的顶层和未聚焦的下层。在多层细胞外微丝网络中存在大量的小孔(白色星号，孔径范围：0.1～5μm)。比例尺＝20μm。
图7显示了在超大细胞外微丝网表面上迁移的细胞的图像。将HMEC移植到Matrigel基质表面并培养110h。H&E图像显示了数个HMEC细胞团被拆解(蓝色箭头；DCM，拆解的细胞团)。已经剥离、迁移、和离开细胞团位点的个体细胞(用红色箭头指出)在超大细胞外微丝网络的表面迁移(但不是在Matrigel表面暴露的大洞中)。这些移动细胞具有可变形态但没有球状形态。白色箭头：非拆解细胞团。比例尺＝10μm。
图8A-C显示500cm2、超大规模和少细胞的细胞外微丝组装网络复合体的产生示意图和图像。图8A显示了人工的、500cm2超大且HMEC团产生的微丝网络复合体的产生示意图。将HMEC植入在细胞培养基中的Matrigel基质层上。HMEC迁移、聚集、增殖，并形成细胞团。随后，细胞团产生长、分支、且膜封闭的细胞外微丝。嵌套的细胞外微丝在细胞团外部和周围形成网络。细胞外微丝网络连接并形成覆盖整个Matrigel表面的500cm2的连续、超大格架。在人工去细胞化后，制成500cm2的超大规模、少细胞、细胞外微丝网络(EMN，红色箭头)。图8B显示在500cm2板的Matrigel基质表面上具有细胞团(CM，蓝色箭头)的超大连续HMEC细胞外微丝网络(EMN，红色箭头)的一部分的苏木精和曙红(H&E)染色图像。在此阶段，细胞外微丝网络的分解不会导致大的(直径≥20μm)圆洞。比例尺＝10μm。图8C显示了在人工去细胞化后部分少细胞、500cm2的超大规模细胞外微丝EMN(红色箭头)的H&E染色图像。比例尺＝10μm。
图9A-C显示无细胞的超大微丝格架(AUML)促进深度二度热烧伤创伤的表皮再生和愈合以及表皮再生的上皮中角质形成细胞通道和EMN的产生。(图9A)显示了在烧伤后第14天(dpb)，AUML对深度二度热烧伤创伤愈合的影响的统计学分析。斯氏t检验；双尾；每组n＝5只小鼠。(图9B)显示角质细胞在表皮再生的上皮(RE-ED)中形成大通道。一个代表性的免疫荧光图像显示在AUML处理的创伤中RE-ED中存在多个角质形成细胞通道(KT)。大的KT1内腔包含许多不同类型的细胞。KT2内腔具有角质形成细胞EMN。框住的KT1和KT2区域分别在图11B-C中放大。示出了真皮(DM)和毛囊(HF)。比例尺＝10μm。(图9C)是5个创伤切片标本中角质形成细胞通道总发生率的散点图(每个样本从小鼠的创伤样本中随机选择，每组n＝5只小鼠，Bonferroni校正后的Wilcoxon秩和检验，P＜10-15)。每个黑点代表角质形成细胞隧道。(图9D)图14B中的放大区域。代表性的免疫荧光图像显示了大角质形成细胞通道(KT，用紫色虚线标记)内腔包含大角质形成细胞EMN(KEMN)，其为细胞迁移和行为提供支架和环境(白色箭头)。显示了由角质形成细胞EMN分解引起的角质形成细胞EMN(橙色箭头)和不规则洞(紫色星号)。
图10A-B显示了AUML促进二度热烧伤创伤的再上皮化和愈合，并且允许角质形成细胞通道的产生。(图10A)显示在烧伤后不同日(dpb)，在小鼠中有/无Mepiform或AUML治疗的二度热皮肤烧伤创伤的代表性图像。(图10B)显示来自14dpb的每个小鼠组的烧伤创伤的切片标本的代表性的H&E图像。用AUML治疗的创伤中，在表皮再生的上皮(RE-ED)中存在两个具有多个细胞的大角质形成细胞通道(KT)，但在没有治疗或用Mepiform治疗的组中没有。蓝框区域示于图11A。示出了表皮再生的上皮(RE-ED)和真皮(DE)。
图11A-C显示角质形成细胞通道和EMN在AUML治疗的创伤中的表皮再生的上皮中提供细胞转运的途径。(图11A)示出了图10B中的框住的区域的放大区域。在用AUML治疗的创伤的表皮再生的上皮中有两个大角质形成细胞通道。在角质形成细胞通道-1(KT1)内腔中，有多个红细胞(RBC，黑箭头)和角质形成细胞EMN(KEMN)片段(蓝色箭头)。在KT2内腔中，有角质形成细胞EMN(KEMN，蓝色箭头)，其中有多种类型的细胞在其中/其上迁移，包括红细胞和有核细胞(青色箭头)。(图11B)示出了图9B中的框住的区域(白色)的放大区域。在角质形成细胞通道-1(KT1)的内腔中存在多种不同类型的细胞迁移，包括红细胞(紫色箭头)和正染性正常红细胞(orthochromative normoblast)(ON)，其具有完全成熟的细胞质和小的、紧凑的和固缩的细胞核(白色箭头)。(图11C)示出了图9B中的框住的区域(橙色)的放大区域。在角质形成细胞通道-2(KT2)的内腔中有角质形成细胞EMN(KEMN)。示出了膜封闭的和细胞外微丝组成的角质形成细胞EMN(KEMN，橙色箭头)。有核细胞(白色箭头)在角质形成细胞EMN中迁移。比例尺在(a)中是20μm，在(B-C)中是10μm。
图12A-C显示角质形成细胞通道和EMN在AUML治疗的创伤中的表皮再生的上皮中提供细胞转运和迁移的通路。(图12A)是显示在用AUML处理的创伤中的表皮再生的上皮中有两个角质形成细胞通道(KT1和KT2)的代表性的H&E染色图像。框住的区域(KT1和KT2)被放大并分别在(b)和(c)中示出。示出了表皮再生的上皮(RE-ED)和真皮(DE)。(图12B)显示许多成熟的去核红细胞(RBC，黑箭头)在KT1内腔中的大角质形成细胞EMN(KEMN)中迁移。(图12C)显示在大角质形成细胞通道-2(KT2)中的两个有核细胞迁移。
图13A-C显示角质形成细胞EMN为角质形成细胞通道内腔中的细胞迁移和行为提供支架并且角质形成细胞EMN拆解。(图13A)是显示在用AUML治疗的创伤中，角质形成细胞EMN复合体形成于表皮再生的上皮的大角质形成细胞通道内腔中的代表性的H&E染色图像。示出了表皮再生的上皮(RE-ED)和真皮(DE)。框住的区域被放大并显示在(B)中。(图13B)显示(A)中的放大的区域。在大角质形成细胞通道(KT)的内腔中拆解时，许多细胞(蓝色箭头)位于角质形成细胞EMN(KEMN)复合体中。黑箭头显示角质形成细胞EMN片段，黑色星号显示由角质形成细胞EMN复合体的拆解造成的大洞(或大通道的横截面)。框住的区域被放大并显示在(C)中。(图13C)显示了角质形成细胞EMN的考古学(archeology)。角质形成细胞细胞外微丝组成的EMN(KEMN，黑箭头)包含大量各种尺寸的不规则形状的孔(绿色箭头)。角质形成细胞EMN的拆解导致角质形成细胞EMN中的许多通道(黑星号)。示出了角质形成细胞EMN中的通道的边缘(蓝色箭头)。
图14A-C显示角质形成细胞EMN复合体构建细胞环境，角质形成细胞ECMF拆解导致角质形成细胞EMN分解。(图14A)是代表性的免疫荧光图像，其显示了AUML允许表皮再生的上皮在不同阶段中形成具有角质形成细胞EMN的角质形成细胞通道复合体。示出了表皮再生的上皮(RE-ED)、真皮(DE)和毛囊(HF)。框住的区域示于(b)。(图14B)显示了一个角质形成细胞通道复合体，其包含三个相邻角质形成细胞通道(KT1、KT2和KT3)。在剩余的角质形成细胞EMN中，KT1内腔中的角质形成细胞EMN(KEMN)主要通过小通道(白色星号)分解。KT2内腔中的大部分角质形成细胞EMN是完整的，而该EMN中存在两个通道(青色星号)。KT3内腔中的大角质形成细胞EMN被分解并分成几个大的或小的EMN片段。多个细胞(白色箭头)位于KT3内腔中的角质形成细胞EMN中。白色和橙色的框住区域分别补充显示图12c和图3中。(图14C)是代表性的荧光图像，其显示角质形成细胞膜封闭的微丝的拆解导致在EMN中角质形成细胞EMN(KEMN，橙色箭头)形成通道(青色箭头)的分解。
图15A-B显示了大面积原代正常人类细胞膜的产生。图14A是大面积原代正常人类细胞膜产生的示意图。细胞膜层深度约为40nm。图14B是在10cm(直径)培养皿中Matrigel基质上的部分天然原代正常人类细胞膜(曙红染色)的代表性图像。比例尺＝100μm。
具体实施方式
本公开的方面基于迄今未发现的观察，即在基质支持物中生长的天然原代人类上皮细胞产生大面积微丝网络。根据一个方面，微丝网络可以作为物理屏障用于创伤感染的预防和管理。某些本公开的实施方式涉及细胞衍生的微丝的连续网络以及组织工程改造方法，以产生大面积微丝网络。在本文公开的条件下形成的细胞外微丝不存在于多细胞生物体中。这种微丝网络在创伤愈合中具有实用性，包括例如预防创伤感染，包括烧伤护理、急性和外科创伤护理。根据某些方面，所述微丝网络促进细胞迁移并促进组织再生。根据一个方面，培养于细胞基质的正常原代人类上皮细胞产生大面积的微丝网络。在一个实施方式中，对微丝网络进行处理以去除细胞的核或DNA。在另一个实施方式中，对微丝网络进行物理、化学和/或机械性处理以去除细胞。根据另一个方面，所述微丝网络在创伤愈合中具有实用性，例如作为物理屏障并且施加于创伤以防止微生物诱导的创伤感染。在某些实施方式中，生物工程改造方法产生大面积(高达500cm2)的微丝网络。这样的网络可用于预防创伤感染。在一个实施方式中，细胞衍生的微丝的网络是可生物降解的，并且与患者的组织在生物学上相容。在另一个实施方式中，所述微丝网络能够从创伤部位排除微生物。在又一个实施方式中，所述微丝网络是半渗透性的，用于构建支持组织恢复和/或组织再生中涉及的异质性细胞功能的微环境。在一个实施方式中，细胞衍生的微丝的连续网络的大面积克服了大面积二(或三)度热烧伤创伤患者治疗和愈合的主要障碍之一。
根据一个方面，我们提供了一种用于生成超大、多孔、致密、多层和三维(3D)细胞外微丝网以促进创伤修复的可靠的方法。发现人类上皮细胞团产生长的膜封闭的细胞外微丝(ECMF)。在一个实施方式中，嵌套的ECMF形成超大的细胞外微丝网络(EMN)。在另一个实施方式中，这些EMN连接并可形成平方英尺(ft2)规模的超大微丝格架(UML)。在某些实施方式中，所述UML构建了一个用于细胞迁移的环境。在一个实施方式中，去除细胞团产生无细胞的UML(AUML)，其可用于促进创伤修复。在一个示例性的实施方式中，当施加于二度热烧伤创伤的小鼠时，AUML允许角质形成细胞在表皮再生的上皮中产生大的通道，从而为创伤修复部位提供细胞和营养物的通路。这些大AUML的性质包括生物降解性、生物相容性和半渗透性。在某些实施方式中，AUML含有天然生化、生物物理和生物力学组分，适用于创伤修复和组织再生。
微丝作为真核细胞中的主要细胞骨架聚合物，通过肌动蛋白亚基和肌动蛋白结合蛋白质被聚合。微丝对细胞***和胞质***、细胞形状维持、囊泡运输、信号传导、传感和细胞运动而言是必需的(Gunning，P.W.，Ghoshdastider，U.，Whitaker，S.，Popp，D.和Robinson，R.C.《组成和功能不同的肌动蛋白丝的进化》(The evolution ofcompositionally and functionally distinct actin filaments).Journal of cellscience 128，2009-2019(2015))。细胞骨架肌动蛋白(包括β-和γ-肌动蛋白)的组装和解聚导致微丝网络重塑(Herman,I.M.《肌动蛋白异构体》(Actin isoforms).Currentopinion in cell biology 5,48-55(1993))。成年动物细胞大小的μm规模限制了单个细胞的细胞骨架微丝网络的潜在面积达到μm2规模(Lloyd，A.C.《细胞尺寸的调节》(Theregulation of cell size).Cell 154，1194-1205(2013)，Ginzberg，M.B.，Kafri，R.和Kirschner，M.《细胞生物学：正确的(细胞)大小》(Cell biology.On being the right(cell)size.).Science 348，1245075(2015))。根据一个方面，人类上皮细胞团产生超大的细胞外微丝网络，其促进细胞迁移。根据另一个方面，本公开提供了一种在平方英尺(ft2)水平上产生人工和超大的细胞外微网络的一般策略。根据一个方面，人类细胞团产生通过膜封闭的细胞外微丝组装的超大(ft2)规模的网结构。在一个实施方式中，这些网结构被细胞用作促进细胞迁移的功能性ECM。根据另一个方面，这些天然网在小鼠中有效促进烧伤创伤愈合。在某些实施方式中，这些网格是简单、可靠、超大和3D的细胞外微网格(ft2或更大)。在又一个实施方式中，这些网是多孔、天然、致密、或无细胞的。根据一个方面，这些网可被用于促进创伤修复和组织再生。根据某些方面，人类上皮细胞团在细胞外产生长(长度高达1000μm)肌动蛋白聚合微丝。根据一个方面，所述微丝是膜封闭的。在一个实施方式中，细胞和细胞衍生的细胞外微丝形成超大连续网络，为细胞迁移铺平了道路。在另一个实施方式中，去细胞化产生人工的、少细胞和超大(500平方厘米，cm2)的格架，与同等大小的单个人类上皮细胞中的细胞网络面积相比，微丝网络面积增加了大约十亿倍(1×109倍)。在某一个实施方式中，超大和多孔细胞外微丝网促进了小鼠中的二度热烧伤创伤的表皮再生和愈合。根据某些方面，本发明公开的方法产生促进细胞迁移的超大规模细胞外微丝网络，并且可用于组织再生和创伤愈合。
术语“对象”，“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、竞技动物和宠物。还包括在体内或体外培养获得的生物实体的组织、细胞和它们的后代。
术语“治疗剂”，“可治疗的药剂”或“处理剂”可互换使用，是指在给予对象时赋予某些有益效果的分子或化合物。有益效果包括诊断确定的实现；疾病、症状、障碍或病理状况的改善；疾病、症状、障碍或病症的发作的减少或预防；和疾病、症状、障碍或病理状况的通常抵抗。
如本文所用，“治疗”或“处理”或“缓解”或“改善”可互换使用。这些术语是指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指治疗中对一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改善或作用。为了预防益处，可以将组合物给予具有发育特定疾病、病症或症状的风险的对象，或者报告疾病的一种或多种生理症状的对象，即使疾病、病症、或症状可能尚未表现出来。
术语“有效量”或“治疗上的有效量”是指足以产生有益或所需结果的药剂的量。治疗上的有效量可以根据以下一个或多个而变化：正治疗的对象和疾病状况、对象的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式等，这些都可由本领域普通技术人员容易地确定。该术语还适用于提供图像以供本文所述的任何一种成像方法检测的剂量。具体剂量可以根据以下一个或多个而变化：选择的特定药剂，要遵循的给药方案，是否与其他化合物联合给药，给药时间，待成像的组织，以及携带它的物理递送***。
根据一个方面，产生微丝网络的方法通过在基质支持物和细胞培养基中培养细胞来进行。在一个实施方式中，细胞团形成于基质支持物的顶部。在另一个实施方式中，所述基质是细胞培养基、Matrigel。
在一个实施方式中，网络的微丝包括肌动蛋白，如β-肌动蛋白、γ-肌动蛋白、和肌动蛋白相互作用蛋白质。在一个实施方式中，所述微丝的长度约为1-1000μm、10-900μm、20-800μm、30-700μm、40-600μm、50-500μm、60-400μm、70-300μm、80-200μm、和90-100μm。在另一个实施方式中，所述微丝是分支的。在又一个实施方式中，所述微丝具有约2-10、3-9、4-8、5-7个分支。在一个实施方式中，所述网络进一步包括粘附材料。在一个实施方式中，所述粘附材料与微丝结合并扩大微丝的直径。在一个实施方式中，网络的面积在约1μm2至约500cm2的范围内。在另一个实施方式中，所述网络具有约10μm2至约400cm2、约100μm2至约300cm2、约200μm2至约200cm2、约1000μm2至约100cm2以及约1cm2至约10cm2的面积。在另一个实施方式中，所述网络的厚度在约1nm至约1cm、约10nm至约0.1cm、约100nm至约0.01cm和约1000nm至约0.001cm的范围内。在一个实施方式中，所述网络作为单层施加于需要治疗的区域。在另一个实施方式中，可以将多层网络施加于需要治疗的区域。
在某些实施方式中，所述网络的孔径的直径在约0.1-5μm、约0.2-4μm、约0.3-3μm、约0.4-2μm和约0.1-1μm的范围内。在一个实施方式中，所述网络可包含生物活性剂和/或无生物活性剂。在一些实施方式中，生物活性剂和/或无生物活性剂包括整合素、粘附受体、和膜蛋白质。在另一个实施方式中，所述生物活性剂是治疗药物，包括抗体和微生物抑制剂。在一个实施方式中，所述网络存在于基质支持物上。在某个实施方式中，所述基质支持物是可生物降解的。在一个示例性的实施方式中，所述网络存在于Matrigel基质支持物上。在一个实施方式中，所述微丝源区域包含具有或不具有遗传修饰的真核细胞。
根据另一个方面，本发明提供了一种通过将微丝网络施加于需要治疗的区域来治疗医学病症的方法。在一些实施方式中，医学病症涉及本领域技术人员已知的许多类型的创伤，包括但不限于创伤、急性创伤和慢性创伤、烧伤、热烧伤、化学烧伤和电烧伤。在一个实施方式中，所述微丝网络与基质一起施加。在另一个实施方式中，该方法还包括将基质基材与连续细胞外微丝网络分离，并且在没有基质的情况下施加微丝网络。
可以根据各种方法实现根据发明的各种方法给予本文所述的药剂和组合物。例如，发明的药剂和组合物可以通过任何合适的方式给药，例如肠胃外、静脉内、皮下、肌肉内、眶内、眼、脑室内、颅内、囊内、脊柱内、脑室内、腹膜内、口腔、直肠、***、鼻内或气雾剂给药。给予可以是局部的、即针对特定部位或***性的。给予还可以受到但不限于直接手术植入、内窥镜、导管***或灌洗的影响。如果外科手术期间施加，则本发明的组合物可以流到组织上、喷洒到组织上、涂在组织上、或本领域技术范围内的任何其他手段。或者，可以将在手术期间施加的本发明的组合物掺入合适的基质中。此外，在手术期间施加的本发明的组合物可被植入患者的需要表皮再生的创伤部位。
发明的组合物可以在合适的载体或填充剂中或与之一起给予，包括但不限于生物相容性油，例如芝麻油、透明质酸、环糊精、乳糖、棉子糖、甘露醇、羧甲基纤维素、热或化学反应性凝胶、蔗糖乙酸异丁酸酯。如本领域技术人员所理解的，本发明的组合物中描述的药物/化合物的浓度将根据许多因素而变化，包括但不限于待给予药物的剂量、所用化合物的化学特征(例如，疏水性)、和给药途径。待给予的药物的优选剂量也可能取决于变量，包括但不限于疾病的类型和程度、组织缺失或缺陷、特定患者的总体健康状况、所选择的化合物的相关的生物功效、化合物的配方、制剂中赋形剂的存在和类型、以及给药途径。本发明的治疗分子可以提供给个体，其中典型的剂量范围为每天约10ng/kg至约1g/kg体重；优选的剂量范围为约0.1mg/kg至100mg/kg体重，更特别优选的剂量范围为10-1000μg/剂量。熟练的临床医生将理解，本发明的有效剂量可以根据许多因素进行修改，包括但不限于适应症、疾病/创伤的病理学和个体的物理特征。鉴于任何或所有上述因素，改变、修改或优化剂量也在本领域技术范围内。
实施例
出于说明本发明各种实施方式的目的给出下述实施例，而非旨在以任何方式限制本发明。本发明的实施例以及本文所述的方法目前是优选实施方式的代表，是示例性的，而非旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到包含在由权利要求范围所限定的本发明精神内的本文所述的该改变和其他用途。
实施例I
实验方法
细胞，培养基，质粒，反应剂，和小鼠。从ATCC订购正常原代人类乳腺上皮细胞(HMEC，PCS-600-010TM)。对本研究中使用的所有细胞进行测试，发现其不含支原体污染。MEGMTM乳腺上皮细胞生长培养基BulletKitTM(CloneticsTMMEGMTM乳腺上皮细胞生长培养基加SingleQuotsTM试剂盒包装)从隆萨公司(Lonza)(CC-3150)订购。在含有/不含Matrigel基质层的MEGM BulletKitTM中在37℃，潮湿的5％CO2气氛中培养HMEC。从艾德基因公司(Addgene)订购EGFP-hPMCA2z/b(#47584)和mCherry-β肌动蛋白(#54967)质粒。从阿柏堪穆公司(Abcam)订购抗-γ-肌动蛋白(γ肌动蛋白，单克隆，ab123034)和抗泛钙粘蛋白(多克隆，ab140338)抗体。MatrigelTM膜基质(CB-40234)和基底膜基质，无酚红，*无LDEV(产品#356237)购自康宁公司(Corning)。500cm2方形TC处理过的培养皿(产品编号431110)从康宁订购。从默恩吕克医疗保健公司(Healthcare)订购(用于伤口护理的硅酮膜，Warner，P.M.，Coffee，T.L.和Yowler，C.J.《门诊烧伤管理》(Outpatient burn management).The Surgical clinic ofNorth America 94,879-892(2014)。)。从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)订购6周龄雌性小鼠(品种名称：BALB/cJ)。动物实验在哈佛医学院的机构动物护理和使用委员会的批准下进行。
细胞外微丝发育和瞬时转染。将MatrigelTM膜基质在4℃下解冻过夜。在预冷的6孔板、10cm皿或500cm2方形皿中制备Matrigel层(深度为20～30μm)，然后在25℃、湿润的5％CO2气氛中凝胶化20分钟。对于荧光成像，在6孔板中的VWR-Micro覆盖物上用无酚红Matrigel制备Matrigel层。将HMEC涂布在Matrigel层上，并在MEGM BulletKitTM培养基中于37℃在5％CO2的潮湿气氛中培养。细胞外微丝在细胞培养后48-110h发育。根据手册，使用2000(生命科技公司(Life Technologies)，#11668027)将EGFP-hPMCA2z/b(艾德基因公司，#47584)和mCherry-β-肌动蛋白(#54967)的质粒转染至HMEC。从阿柏堪穆公司(Abcam)订购抗-γ-肌动蛋白(γ肌动蛋白，单克隆，ab123034)和抗泛钙粘蛋白(多克隆，ab140338)抗体。转染后两天，将转染的细胞涂布在指定的培养基中的Matrigel基质层(每孔1×103个细胞的6孔板)上。在指定时间的培养期后，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞和Matrigel。细胞固定后进行苏木精和曙红(H&E)染色。将具有VWR-Micro覆盖物的样品转移到载玻片上，然后进行成像采集。
成像采集。使用尼康公司(Nikon)TMS反相对比显微镜和尼康公司Coolpix auto4300数码相机拍摄对比图像。固定细胞的荧光图像用80i直立显微镜和具有20×或40×镜头的滨松(Hamamatsu)ORCA-ER冷却CCD数码相机和MetaMorph图像采集软件拍摄。固定的细胞或组织切片的苏木精和曙红染色图像用80i直立显微镜和具有20×或40×镜头的滨松ORCA-ER冷却CCD数码相机和NIS元素采集软件拍摄。
甲苯胺蓝染色。将HMEC在Matrigel基质层(深度约60μm)上铺在6孔板中的塑料盘上。使用甲醛-戊二醛-苦味酸固定剂(0.2M二甲胂酸盐缓冲液中的2.5％多聚甲醛，5.0％戊二醛和0.06％苦味酸)：细胞培养基＝1︰1的固定混合物固定HMEC。然后将固定后的HMEC在1％四氧化锇(OsO4)/1.5％亚铁***(KFeCN6)中固定30分钟，在水中洗涤3次，并在1％乙酸双氧铀水溶液中孵育30分钟。然后在水中洗涤2次并用乙醇梯度脱水(每次5分钟；50％，70％，95％，2×100％)(Basler，M.，Pilhofer，M.，Henderson，G.P.，Jensen，G.J.和Mekalanos，J.J.《VI型分泌物需要动态收缩的噬菌体尾状结构》(Type VI secretionrequires a dynamic contractile phage tail-like structure).Nature 483，182-186(2012))。将细胞在环氧丙烷和TAAB Epon(加拿大圣洛朗的Marivac加拿大公司)的1︰1混合物中渗透2小时至过夜。随后将样品包埋在TAAB Epon中并在60℃下聚合48h。使用ReichertUltracut-S切片机切割超薄切片(约60nm)。然后将超切片标本用甲苯胺蓝染色(30秒)。用80i直立显微镜(20×，40×透镜)拍摄图像。
去细胞化。在细胞培养(500cm2培养皿中Matrigel层上有6×104个HMEC)指定的持续时间后，用4％多聚甲醛固定500cm2培养皿(500cm2方形TC处理过的培养皿)中的HMEC和超大规模细胞外微丝网络10分钟，然后用1×PBS洗涤3次并进行H&E染色。用移液管吸头(1mL或100μL)和尼康公司TMS反相对比显微镜取出细胞团和细胞，然后用1×PBS洗涤三次。细胞培养指定时间后，用0.5％KMnO4(1×PBS中,pH 7.1,用于脂质稳定,Zhao,S.等《扩散细胞上固定诱导的细胞起泡与质膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水平呈负相关》(Fixation-induced cell blebbing on spread cells inversely correlates withphosphatidylinositol 4,5-bisphosphate level in the plasma membrane).FEBS OpenBio 4,190-199(2014).)固定细胞和超大细胞外微丝网络1h，然后用10％中性缓冲***固定剂固定15分钟。然后，用1×PBS洗涤三次以除去游离的化学残留物。用移液管吸头(1mL或100μL)和尼康公司TMS反相对比显微镜去除细胞团和细胞，然后用1×PBS洗涤三次以去除剥离的细胞。AUML被定制并与Matrigel基质分离。将没有Matrigel的AUML转移到创伤表面上，其中AUML层的顶侧通过自制的AUML特异性转移装置与创伤表面接触，用于热烧伤创伤愈合分析。
动物热烧伤创伤愈合试验。将6周龄成年BALB/cJ雌性小鼠称重(重量，20～24g)并用10mg/kg甲苯噻嗪(注射液，赛拉嗪无菌溶液)通过腹膜内(IP)注射进行麻醉。从麻醉的小鼠的背部剪下毛发，并用市售的毛发去除剂剥去该区域。通过将皮肤暴露于98℃蒸汽4秒钟，将深二度热烧伤(直径1.5cm)诱导至15只小鼠(Zhang,Y.等.《热休克蛋白90alpha在HaCaT细胞增殖和迁移及小鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合中的作用》(Role for heatshock protein 90alpha in the proliferation and migration of HaCaT cells andin the deep second-degree burn wound healing in mice).PLoS One 9,e103723(2014))。将具有深二度热烧伤的15只小鼠随机分成三组(每组5只小鼠)。每隔一天用/不用或定制的AUML处理创伤。通过尼康相机拍摄创伤图像。在烧伤后14d(天)，处死小鼠并切除伤口，通过H&E染色分析进行组织学评估(切片标本，深度为5μm)。
双免疫组织染色分析。切除皮肤伤口，用MB固定剂(安氏公司(Amresco))固定，并包埋在石蜡中。将切片标本(深度5μm)用抗泛钙粘蛋白抗体(阿柏堪穆公司，ab140338，1:200；生命科技公司，#982425，Alex488山羊抗兔IgG(H+L)二抗，1:1000)、抗γ-肌动蛋白抗体(阿柏堪穆公司，ab123034，1:200；生命科技公司，Alex568山羊抗兔IgG(H+L)二抗，1:1000)和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1：1000)进行双重免疫组织化学染色。用具有20×/40×/60x透镜的尼康公司80i直立显微镜拍摄荧光图像。使用MetaMorph图像采集软件获得所有图像。
统计学分析。如前所述进行统计分析(Yi,T.等.《eIF1A增强了Ago2介导的Dicer非依赖性miRNA生物合成和RNA干扰》(eIF1A augments Ago2-mediated Dicer-independentmiRNA biogenesis and RNA interference).Nat Commun 6,7194(2015).)。数据(误差条)表示为平均值和标准差(n＝3或更大)。使用斯氏t检验(双尾)确定P值。**,P＜0.01；***,P＜0.001。
将正常原代人乳腺上皮细胞(HMEC)接种在指定的厚(3D)Matrigel基质-培养基混合物凝胶层上。与2D培养相反，个体的HMEC没有表现出不规则的形状，但始终呈现球状形态，其中最小的表面积保持与Matrigel接触(图1A-B)。这表明Matrigel是细胞粘附、附着和扩散的不利环境。然而，在更长的时间中，HMEC迁移、聚集、增殖并形成致密的细胞团，其中多个堆叠的细胞保持不与Matrigel基质接触(图1C-D)。在细胞植入后24或36小时(h)，细胞团周围没有细胞产生的物质(图1C-D)。但是，在苏木精和曙红(H&E)染色成像时，我们发现，在植入后102h，细胞团在细胞团外部和周围产生超大网结构，并在孔(6孔板)或10cm培养皿中覆盖整个Matrigel表面(图1E-F)。
为了研究超大网是否由膜封闭单元构建，检测了膜相关分子标记。质膜钙运输ATP酶-2(PMCA2)起到钙离子泵的作用，可从细胞中去除Ca2+(参见,Street,V.A.,McKee-Johnson,J.W.,Fonseca,R.C.,Tempel,B.L.和Noben-Trauth,K.《质膜Ca2+-ATPase基因的突变导致deafwaddler小鼠的耳聋》(Mutations in a plasma membrane Ca2+-ATPasegene cause deafness in deafwaddler mice).Nature genetics 19,390-394(1998))并调节许多细胞类型的Ca2+含量，包括乳腺上皮细胞(参见VanHouten,J.等.《PMCA2在乳腺退化期间调节细胞凋亡并预测乳腺癌的结果》(PMCA2 regulates apoptosis duringmammary gland involution and predicts outcome in breast cancer).Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 107,11405-11410(2010))。因此，用编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)标记的PMCA2(EGFP-PMCA2)的质粒瞬时共转染HMEC。在荧光成像时，发现EGFP-PMCA2分布在整个细胞质膜中并沿着细胞团周围的大部分嵌套微纤维的表面分布。这表明细胞团急剧地产生大量的连接细胞团的膜封闭的细胞外微纤维(图2A)。长和短细胞外微纤维致密地连接，从而构成连续网络(图2A)。
两种非肌肉和高度保守的异构肌动蛋白β-和γ-肌动蛋白都是微丝组分，并且在细胞***(参见Pollard,T.D.等《肌动蛋白和肌球蛋白生物化学与胞质***有关》(Actinand myosin biochemistry in relation to cytokinesis).Annals of the New YorkAcademy of Sciences 582,120-130(1990))、细胞器运输(参见Bretscher,M.S.《在移动细胞中获得膜流和细胞骨架以使其协同》(Getting membrane flow and the cytoskeletonto cooperate in moving cells).Cell 87,601-606(1996))、信号转导(参见Janmey,P.A.《细胞骨架和细胞信号传导：组件定位和机械耦合》(The cytoskeleton and cellsignaling:component localization and mechanical coupling).Physiologicalreviews 78,763-781(1998))、细胞运动(参见Theriot,J.A.和Mitchison,T.J.《运动细胞中的肌动蛋白微丝动力学》(Actin microfilament dynamics in locomoting cells).Nature 352,126-131(1991)；Mitchison,T.J.和Cramer,L.P.《基于肌动蛋白的细胞运动和细胞移动》(Actin-based cell motility and cell locomotion).Cell 84,371-379(1996)；Pollard,T.D.和Borisy,G.G.《由肌动蛋白丝的组装和拆卸驱动的细胞运动》(Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments).Cell 112,453-465(2003))以及细胞形状的维持和改变(参见Gardel,M.L.等.《交联和捆绑肌动蛋白网络的弹性行为》(Elastic behavior of cross-linked and bundled actinnetworks).Science 304,1301-1305(2004)；Herman,I.M.《肌动蛋白异构体》(Actinisoforms).Current opinion in cell biology 5,48-55(1993)；Keren,K.等.《运动细胞形态测定的机制》(Mechanism of shape determination in motile cells).Nature 453,475-480(2008))中发挥多重作用。此外，研究了β-肌动蛋白是否参与细胞外微纤维的组成。将编码mCherry标记的β-肌动蛋白(mCherry-β-肌动蛋白)和EGFP-PMCA2的两种质粒瞬时共转染到HMEC中，之后发现β-肌动蛋白分布在整个细胞质中并沿着所有细胞外微纤维分布(图2B)。这表明微丝是膜封闭的细胞外微纤维的结构组分(图2A-B)。嵌套的细胞外微丝通过微丝连接节点形成网络，在它们之间留下可变尺寸的大多边空间(图2B)。然后，多孔(多边孔)的细胞外微丝组装网络连接，形成围绕细胞团的超大、连续、多孔的细胞外微丝网络(图2A-B)。细胞外微丝具有分支形态发生的强大能力(图2A-B和图3)。细胞外微丝的数量迅速增加，快速形成致密的网络(图4A-E)。上述数据表明这些稳固的、长的、高度分支的、膜封闭的细胞外微丝的超大网是首次在此被创建的，其在我们目前的知识中不存在于多细胞生物体中。这些以前未被认可的结构具有高的网络形成能力，并且不同于细胞骨架微丝和应力纤维(参见Tojkander,S.,Gateva,G.和Lappalainen,P.《肌动蛋白应力纤维-组装，动力学和生物学作用》(Actin stress fibers--assembly,dynamics and biological roles).Journal of cell science 125,1855-1864(2012))，基底膜(参见Nelson,D.A.和Larsen,M.《分支形态发生过程中基底膜动力学的异型控制》(Heterotypic control of basementmembrane dynamics during branching morphogenesis).Developmental biology 401,103-109(2015))，未分支的上皮桥(参见Zani,B.G.,Indolfi,L.和Edelman,E.R.《用于支气管上皮细胞迁移和通讯的管状桥》(Tubular bridges for bronchial epithelial cellmigration and communication).PloS one 5,e8930(2010))，或短的和/或短暂的丝状伪足(参见Matti la,P.K.和Lappalainen,P.《丝状伪足：分子结构和细胞功能》(Filopodia:molecular architecture and cellular functions).Nature reviews.Molecular cellbiology 9,446-454(2008))，纤毛、微绒毛(参见Cutz,E.等.《微绒毛包涵体疾病：刷状缘组装和分化的遗传缺陷》(Microvillus inclusion disease:an inherited defect ofbrush-border assembly and differentiation).The New England journal ofmedicine 320,646-651(1989))，小体和侵袭性伪足(参见Murphy,D.A.和Courtneidge,S.A.《小体和侵袭性伪足的“内”和“外”：特征，形成和功能》(The'ins'and'outs'ofpodosomes and invadopodia:characteristics,formation and function).Naturereviews.Molecular cell biology 12,413-426(2011))。
多个长细胞外微丝排列在一起形成厚束。两个或更多个细胞外微丝可以一起扭曲以产生具有环的扭曲束(图2B和5A-C)。这些观察表明，有组织的细胞外微丝网络(EMS)的架构结构高度多样化。上述结果表明，HMEC细胞团的主要特性之一是它们产生细胞外膜封闭的微丝，通过它们可以有力地产生超大、连续和多孔的EMN(图2A-B和4A-E至5A-C)。
经时地(80h)，多个EMN复合体连接并组合成围绕细胞团的超大、连续、多孔、多层格架，并扩散穿过Matrigel表面(图6A-B)。在这些超大型3D EMN中散布有不同尺寸的未识别的膜封闭圆点(图6A-B)。
为了鉴定这些超大EMN的潜在功能，在Matrigel层上植入细胞后，将HMEC连续培养110h。在110h，细胞团开始拆解，并且个体细胞剥离、迁移、离开细胞团位点，并且沿着超大EMN的表面保留或行进，避开了由EMN的拆解引起的大圆洞中的Matrigel表面(图7)。另外，源自拆解的细胞团的个体细胞具有不规则的形态，没有观察到球状细胞(图7)。这些结果表明超大型EMN的表面促进细胞粘附、附着、扩散、迁移和其他行为。总之，上述数据表明，细胞团产生超大连续EMN，创造有利于细胞活动的环境，为细胞迁移铺平了新的途径(图1A-F，2A-B，3,4A-E，5A-C，6A-B和7)。
为了检查细胞团是否能够有效地发育ft2规模的MN，我们将HMEC植入在500cm2培养板的Matrigel层。细胞团产生覆盖整个500cm2Matrigel表面的超大EMN(图8A-B)，证明了细胞群产生超大规模EMN的出色能力，这表明细胞被移除时在创伤愈合中的潜在应用。通过去细胞化去除异种和同种异体细胞遗传物质导致产生用于组织再生的最小免疫原性天然结构26。为了实现这一点，在固定后，除去细胞团和细胞，以产生人工的500cm2(ft2水平)超大和无细胞的细胞外微丝网(图8C)。这些数据表明这些无细胞超大规模细胞外微丝格架(AUML)的潜在大小不受任何结构固有特征的限制。
据估计，全球每年有超过660万人遭受各种烧伤，每年全球致命烧伤人数从1990年的280,000人增加到2010年的338,000人(Lozano,R.等.《1990年和2010年20个年龄组的235个死亡原因造成的全球和区域死亡率：对2010年全球疾病负担研究的***分析》(Globaland regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and2010:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010).Lancet 380,2095-2128(2012))。对于具有大面积二(或三)度热烧伤的患者而言，表皮再生和创伤愈合是一个挑战。治疗和愈合的主要障碍之一是缺乏具有所需特征的大面积连续材料：该材料必须是可降解的，与患者组织在生物学上相容，能够从伤口部位排除微生物，并且半渗透性以构建支持组织修复(参见Braun,K.M.和Prowse,D.M.《不同的表皮干细胞区室由独立的小生境微环境维持》(Distinct epidermal stem cell compartments aremaintained by independent niche microenvironments).Stem cell reviews 2,221-231(2006)；Solanas,G.和Benitah,S.A.《再生皮肤：异质干细胞池和周围生态位的任务》(Regenerating the skin:a task for the heterogeneous stem cell pool andsurrounding niche).Nature reviews.Molecular cell biology 14,737-748(2013)；Nowak,J.A.,Polak,L.,Pasolli,H.A.和Fuchs,E.《毛囊干细胞被特化并在早期皮肤形态发生中起作用》(Hair follicle stem cells are specified and function in early skinmorphogenesis).Cell stem cell 3,33-43(2008))中涉及的异质细胞功能(参见Taylor,G.,Lehrer,M.S.,Jensen,P.J.,Sun,T.T.和Lavker,R.M.《卵泡和表皮的形成中的卵泡干细胞的参与》(Involvement of follicular stem cells in forming not only thefollicle but also the epidermis).Cell 102,451-461(2000)；Watt,F.M.,Lo Celso,C.和Silva-Vargas,V.《表皮干细胞：更新》(Epidermal stem cells:an update).Currentopinion in genetics&development 16,518-524(2006)；Watt,F.M.和Jensen,K.B.《表皮干细胞多样性和静止》(Epidermal stem cell diversity and quiescence).EMBOmolecular medicine 1,260-267(2009))的微环境(参见Heng,M.C.《成人皮肤伤口愈合：为了完美再生》(Wound healing in adult skin:aiming for perfect regeneration).International journal of dermatology 50,1058-1066(2011))。
为了研究超大、连续、多孔、多层和天然AUML是否可以创造促进烧伤创伤愈合的环境，在有/无Mapiform(Warner,P.M.,Coffee,T.L.和Yowler,C.J.《门诊烧伤管理》(Outpatient burn management).The Surgical clinics of North America 94,879-892(2014))或AUML治疗的小鼠中进行二度热皮肤烧伤。在烧伤后14d，发现AUML比缺乏治疗或用Mepiform治疗更有效地促进二度热烧伤创伤的表皮再生和愈合(图9A和图10A)。
虽然表皮是无血管的，但真皮通过其血管网络为无血管表皮提供营养(Reinke,J.M.和Sorg,H.《创伤修复和再生》(Wound repair and regeneration).Europeansurgical research.Europaische chirurgische Forschung.Recherches chirurgicaleseuropeennes 49,35-43(2012),Yamaguchi,Y.和Yoshikawa,K.《皮肤创伤愈合：更新》(Cutaneous wound healing:an update).The Journal of dermatology 28,521-534(2001))。钙粘蛋白是跨膜蛋白，具有广泛的功能，包括角质形成细胞粘附和迁移(Lecuit,T.和Yap,A.S.《E-钙粘蛋白连接作为组织动力学中的主动机械整合器》(E-cadherinjunctions as active mechanical integrators in tissue dynamics).Nature cellbiology 17,533-539(2015))。有趣的是，发现AUML治疗显著促进了表皮再生的上皮内许多大通道的产生(图9B-C和图10B，图12A和图13A)。组织化学和免疫组织化学染色分析表明，这些角质形成细胞通道含有许多不同类型的细胞，包括红细胞，这表明这些角质形成细胞通道在功能上为细胞、可溶性生长因子和营养素提供了途径(图9B和图11A-C，12A-C和13A-C)。更重要的是，发现角质形成细胞在角质形成细胞通道内腔产生EMN，并且多种细胞(包括红细胞)在角质形成细胞EMN中迁移，证明角质形成细胞在体内产生EMN，为细胞迁移和其他行为提供支架(图9D和图11A-C，12A-C和13A-C和14A-C)。角质形成细胞EMN被拆解并且细胞填充角质形成细胞通道，这与后期表皮再生的上皮中角质形成细胞通道和EMN消失的事实相符，这表明AUML为角质形成细胞通道和EMN的协调产生和分解创造了适当的环境(图9D，图10B和图11A-C，12A-C和13A-C和14A-C)。总之，这些数据表明，AUML构建了适当的环境，其允许角质形成细胞产生大的角质形成细胞通道，这充当了细胞、可溶性生长因子和营养物的途径，并在体内产生大的角质形成细胞EMN，为细胞迁移和其他行为提供支架，从而促进创伤修复。
ft2规模的AUML完全由人类细胞产生，自然地被细胞用作细胞迁移和其他行为的支架和环境，在保持原生生物物理、生物化学和生物力学信号完整的同时去细胞化，使得AUML的施加能够促进创伤修复。细胞膜封闭的细胞外微丝的特征使AUML可用作可生物降解的、生物相容的、半渗透性的和最小的免疫原性生物材料，用于促进创伤修复和组织再生。创建非常大面积AUML的潜力使它们可以轻松地适应任何大小的创伤。AUML促进提供细胞和营养物的途径的大角质细胞通道的产生、以及提供用于细胞体内迁移和行为的支架的角质形成细胞EMN的产生。以这种方式，角质形成细胞通道和EMN满足表皮区域中对细胞、可溶性生长因子和营养素的高需求，其中细胞迁移、增殖、分化和分层在组织修复期间发生。
预计这些可生物降解的、生物相容的、半渗透性和无限的AUML及其天然生物物理、生物化学和生物力学信号将被用作治疗广谱创伤和促进组织再生的方法，因为大面积的天然网在高度有组织的组织中促进了线索引导的细胞迁移、增殖和分化。
本文提供的数据显示，由在Matrigel中生长的细胞产生的先前未识别的细胞外微丝网络促进了细胞迁移。本公开内容考虑了无细胞和超大规模(ft2规模)的细胞外微丝网络，其促进二度热烧伤的表皮再生和愈合。
实施例II
描述了新型组织工程改造方法，其产生大面积天然原代正常人细胞膜，用于预防和控制创伤感染，包括烧伤护理、急性和手术创伤护理。在细胞基质上培养的正常原代人上皮细胞产生大面积(高达500cm2)的原代正常人细胞膜而没有核或DNA，其可以应用于创伤并且充当物理屏障以防止微生物诱导的创伤感染。工程化的大面积细胞膜-基质复合层可有效防止微生物(包括细菌、真菌和病毒)的感染。
材料和方法
大型原代正常人细胞膜的生长。在具有Matrigel TM膜基质(CB-40234，康宁公司)和预冷盘的薄塑料膜上制备各种尺寸(75cm2，或300cm2，或500cm2，或更多)的培养皿中的Matrigel TM基质层(Yi,T.,Kabha,E.,Papadopoulos,E.,和Wagner,G.(2014)《4EGI-1通过选择性抑制持续存在于CSC维持、增殖和转移中的翻译来靶向乳腺癌干细胞》(4EGI-1targets breast cancer stem cells by selective inhibition of translation thatpersists in CSC maintenance,proliferation and metastasis).Oncotarget 5,6028-6037)，然后在37℃的培养箱中孵育20分钟。将原代正常人乳腺上皮细胞(HMEC)(Scheel,C.,Eaton,E.N.,Li,S.H.,Chaffer,C.L.,Reinhardt,F.,Kah,K.J.,Bell,G.,Guo,W.,Rubin,J.,Richardson,A.L.,和Weinberg,R.A.(2011)《旁分泌和自分泌信号诱导并维持***中的间充质和干细胞状态》(Paracrine and autocrine signals induce and maintainmesenchymal and stem cell states in the breast).Cell 145,926-940)在DMEM培养基中的Matrigel基质层上培养。在37℃，5％CO2下培养哺乳动物细胞。培养50小时后，HMEC形成细胞团和大面积原代正常人细胞膜。通过吸头除去细胞团，并产生没有核遗传物质的大面积原代正常人细胞膜。除去DMEM培养基后，将细胞膜用1×PBS洗涤3次。
结果
通过该方法产生的大面积天然原代正常人细胞膜(图15A-B)具有包括以下的特征：1)具有超大面积(高达500cm2或更多)无核天然细胞膜；与单个细胞面积相比，面积增加了十亿倍(1010倍)；2)双天然原代正常人细胞膜层；3)没有DNA的遗传物质；4)具有天然膜蛋白的天然脂质膜；5)细胞膜和Matrigel基质易降解；并且6)创伤感染预防。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。下列权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。
Claims (94)
1.一种网络，其包括在多个微丝源区域之间以连续格架或网结构互连的细胞衍生的微丝。
2.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝是细胞外微丝。
3.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝是膜封闭的。
4.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝包含肌动蛋白。
5.如权利要求4所述的网络，其中，所述肌动蛋白包括β-肌动蛋白。
6.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝的长度为约1-1000μm。
7.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝是分支的。
8.如权利要求7所述的网络，其中，所述微丝具有约2-10个分支。
9.如权利要求1所述的网络，其中，多根微丝排列在一起，并形成各种架构结构的束。
10.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝源区域形成连续格架或网结构的连接节点。
11.如权利要求1所述的网络，其进一步包含粘附材料。
12.如权利要求11所述的网络，其中，所述粘附材料与微丝结合并扩大微丝的直径。
13.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络具有约1μm2至约500cm2的面积和约1nm至约0.5cm的厚度。
14.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络是单层或多层。
15.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝的表面积大于细胞内细胞骨架微丝网络的表面积的当量单位。
16.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络是多孔的。
17.如权利要求16所述的网络，其中，孔径的直径范围是约0.1至5μm。
18.如权利要求1所述的网络，其进一步包含生物活性剂和/或无生物活性剂。
19.如权利要求18所述的网络，其中，所述生物活性剂是治疗药物。
20.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝源区域包含细胞。
21.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络存在于基质支持物上，其中所述基质支持物是可生物降解的。
22.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络存在于Matrigel基质支持物上。
23.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络没有来自细胞的核。
24.如权利要求1所述的网络，其中，所述网络没有细胞。
25.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝源区域包含具有或不具有遗传修饰的真核细胞。
26.如权利要求25所述的网络，其中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
27.如权利要求26所述的网络，其中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
28.如权利要求27所述的网络，其中，所述人类细胞是人类乳腺上皮细胞。
29.如权利要求1所述的网络，其中，所述微丝被包埋于基质支持物的顶部表面。
30.如权利要求1所述的网络，其中，所述基质支持物抑制细胞附着和迁移。
31.一种制造微丝的网络的方法，所述方法包括以下步骤：
在基质支持物和细胞培养基中培养细胞，其中细胞增殖并形成聚集的细胞团，且其中细胞团在细胞团外部和周围产生微丝，且其中细胞外微丝连接并形成连续的细胞外微丝网络，以及
从网络中去除细胞的核和/或细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述细胞团形成于基质支持物的顶部。
33.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝被包埋于基质支持物的顶部表面。
34.如权利要求31所述的方法，其中，所述基质支持物抑制细胞附着和迁移。
35.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝是细胞外微丝。
36.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝是膜封闭的。
37.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝包含肌动蛋白。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述肌动蛋白包括β-肌动蛋白。
39.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝的长度为约1-1000μm。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述微丝是分支的。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述微丝具有约2-10个分支。
42.如权利要求31所述的方法，其中，多根微丝排列在一起，并形成各种架构结构的束。
43.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝源区域形成连续格架或网结构的连接节点。
44.如权利要求31所述的方法，其进一步包含粘附材料。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述粘附材料与微丝结合并扩大微丝的直径。
46.如权利要求31所述的方法，其中，所述网络具有约1μm2至约500cm2的面积和约1nm至约0.5cm的厚度。
47.如权利要求31所述的方法，其中，所述网络是单层或多层。
48.如权利要求31所述的方法，其中，所述微丝的表面积大于细胞内细胞骨架微丝网络的表面积的当量单位。
49.如权利要求31所述的方法，其中，所述网络是多孔的。
50.如权利要求49所述的方法，其中，孔径的直径范围是约0.1至5μm。
51.如权利要求31所述的方法，其中，所述网络进一步包含生物活性剂和/或无生物活性剂。
52.如权利要求51所述的方法，其中，所述生物活性剂是治疗药物。
53.如权利要求31所述的方法，其中，所述基质是生物可降解的。
54.如权利要求31所述的方法，其中，所述基质是Matrigel。
55.如权利要求31所述的方法，其中，所述细胞是具有或不具有遗传修饰的真核细胞。
56.如权利要求55所述的方法，其中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其中，所述人类细胞是人类乳腺上皮细胞。
59.一种治疗医学病症的方法，其包括将权利要求1所述的微丝网络施加于需要治疗的区域。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述微丝网络与基质一起施加。
61.如权利要求59所述的方法，其中，所述微丝网络不与基质一起施加。
62.如权利要求59所述的方法，其中，所述医学病症是创伤或受伤的组织。
63.如权利要求59所述的方法，其中，所述微丝网络保护创伤或受伤的组织不被感染，并且促进创伤愈合和组织再生。
64.如权利要求59所述的方法，其中，所述医学病症是烧伤。
65.如权利要求59所述的方法，其包括增强或促进受损皮肤的表皮再生。
66.如权利要求59所述的方法，其还包括在将微丝网络施加于需要治疗的区域之前、同时或之后给予治疗药物。
67.一种在体外产生细胞衍生的微丝的连续网络的方法，其包括：
在使得细胞簇在细胞簇外部和周围产生微丝、并且细胞外微丝连接并在基质基材的表面上的细胞簇之间形成微丝的连续细胞外网络的条件下，在基质基材的表面上培养多个细胞簇。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述细胞簇间隔开的平均距离为约1微米至约1000微米。
69.如权利要求67所述的方法，其中，连接细胞簇的微丝具有平均约10微米至约100微米的长度。
70.如权利要求67所述的方法，其中，所述连续细胞外微丝网络是多层格架。
71.如权利要求67所述的方法，其中，所述微丝是分支的。
72.如权利要求67所述的方法，其中，所述连续细胞外微丝网络是多层格架，包括长度在约10微米至约1000微米之间的长微丝和长度在约1微米至约10微米之间的短微丝。
73.如权利要求67所述的方法，其中，所述微丝的连续细胞外网络具有约0.01cm2至500cm2的表面积。
74.如权利要求67所述的方法，其中，所述连续细胞外微丝网络是网。
75.如权利要求67所述的方法，其中，所述连续细胞外微丝网络是多孔的。
76.如权利要求67所述的方法，其中，细胞植入在基质基材的表面，在那里细胞迁移和聚集成预聚体并增殖以形成细胞簇。
77.如权利要求67所述的方法，其进一步包括从连续细胞外微丝网络去除细胞核或细胞簇。
78.如权利要求67所述的方法，其中，所述基质基材抑制细胞的附着。
79.如权利要求67所述的方法，其进一步包括从连续细胞外微丝网络分离基质基材。
80.一种促进创伤修复和/或组织再生的方法，其包括将权利要求1所述的微丝网络施加于需要的部位。
81.如权利要求80所述的方法，其中，所述微丝网络与基质一起施加。
82.如权利要求80所述的方法，其中，所述微丝网络不与基质一起施加。
83.如权利要求80所述的方法，其中，所述微丝网络形成平方英尺(ft2)-规模的超大微丝格架(UML)。
84.如权利要求80所述的方法，其中，所述UML构建了一个用于细胞迁移的环境。
85.如权利要求80所述的方法，其中，所述微丝网络是多层且三维的(3D)。
86.如权利要求80所述的方法，其包括去除细胞团并产生无细胞的UML(AUML)。
87.如权利要求86所述的方法，其中，所述AUML促进创伤修复。
88.如权利要求86所述的方法，其包括将AUML施加于受伤处。
89.如权利要求88所述的方法，其中，施加AUML允许角质形成细胞在表皮再生的上皮中生成大通道。
90.如权利要求89所述的方法，其中，所述大通道为创伤修复部位提供细胞和营养物质的途径。
91.如权利要求80所述的方法，其中，所述微丝网络保护受伤处不受感染。
92.如权利要求80所述的方法，其包括增强或促进受伤皮肤的表皮再生。
93.如权利要求80所述的方法，其中，所述创伤是二度热烧伤创伤。
94.如权利要求80所述的方法，其还包括在将微丝网络施加于需要治疗的区域之前、同时或之后给予治疗药物。
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