CN107849530A - 血管化组织、皮肤或黏膜等效物 - Google Patents

血管化组织、皮肤或黏膜等效物 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及使干细胞分化成内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和角质化细胞的方法；其在产生器官型血管化皮肤或黏膜模型或组合物中的用途；与其相关的方法；所述模型或组合物在测试药物和/或美容剂中的用途；并且包括通过其开发或测试的治疗性和美容性皮肤组合物。

Description

血管化组织、皮肤或黏膜等效物
技术领域
本公开内容涉及使干细胞分化成内皮细胞、血管平滑肌细胞(和/或周细胞)、成纤维细胞和角质化细胞的方法；其在产生器官型任选血管化组织、皮肤或黏膜等效物(equivalent)或组合物中的用途；与其相关的方法；所述等效物或组合物在测试药物和/或美容剂中的用途；并且包括通过其开发或测试的治疗性和美容性皮肤组合物。
背景技术
人皮肤是内脏器官抵御病原体和微生物入侵的第一道防线。因此，皮肤充当了人体防止水流失以及潜在的外源机械和化学危害的重要保护层。皮肤和口腔黏膜(oralmucosa)的上皮表面是复层鳞状组织，其由彼此紧密连接的细胞组成并排布成许多不同层(基底、棘细胞、颗粒和角质化层)。皮肤的最外面部分由多层分化的角质化细胞构成，以形成自角质化结构，被称为表皮。表皮与下面的支持性成纤维细胞层(称为真皮层)结合。
由于衰老和疾病对皮肤屏障功能的破坏，在开发皮肤治疗产品中存在极大的兴趣。此外，考虑这一点并鉴于皮肤固有的屏障功能，治疗性化合物的有效表面递送需要穿透组织的表面可渗透性屏障。新治疗剂的成功转化需要在实际模型***中评价测试剂的皮肤和黏膜递送能力。可以再现正常组织的适当机械和可渗透性特征的体外模型或等效物的开发对治疗性化合物的配制和递送以及研究皮肤和口腔黏膜的保护性表面的屏障特性是关键的，并且代表了用于临床前检测和用于促进治疗性化合物向临床使用转化的重要工具。
存在多种皮肤模型用以研究皮肤和口腔黏膜的渗透性和屏障特性，包括离体人组织活检或外科手术标本，但是存在与其相关的大量困难，包括道德问题、供应和实验变异性。此外，由于固有的跨物种变异性，虽然证明有用的动物研究却具有许多对于研究屏障特性的缺点。还期望摆脱药剂的动物测试。目前的角质化复层组织的体外器官型模型可以展现出一些体内观察到的结构特征，但是它们是昂贵的、高度可变的并且无法再现亲本组织的屏障特性。
或者，细胞和组织培养模型可以在组织的可用性、成本和安全性方面提供优势。然而，目前的细胞培养物单层不显示伴随着体内皮肤组织分层的分化，因此不显示正常组织的屏障特性。
使分层的分化的人上皮细胞生长形成器官型3D培养物潜在地克服了细胞单层的缺点。3D培养***在生物化学和生理学上更类似于体内组织。然而，在实践中，已经证明了生长可以有效再现正常皮肤移植物的屏障功能的器官培养物并不容易。例如，器官型皮肤培养物的渗透性测量已经表明对多种化合物的渗透性比正常皮肤大3至100倍(Robert等1997；Garcia等，2002；Barai等，2008)。此外，目前的技术需要通过外科手术方法从个体不利地采集皮肤活检，并在实验室条件下使获得的细胞扩增以提供用于这些模型足够量的细胞，这可导致这些细胞的形态和功能丧失。此外，这些技术还需要使用源自动物的蛋白质(血清)，这可妨碍其临床使用并且根据使用的血清批次而影响过程的可再现性；使用来自不同供体的细胞，这由于涉及细胞的有限可用性、供体-供体变异性和免疫原性的问题而限制了技术的临床应用；开发涉及复杂制造过程的微流控支架；以及使用限制临床应用的经基因修饰的细胞。
因此，目前的模型既昂贵又受批次变异性影响。由于在全厚皮肤模型(fullthickness skin model)中期望两种不同类型的细胞(即，真皮和表皮)，故对于全厚皮肤模型，这些问题变更糟。
因此，对忠实地重现人皮肤的特征的代表性的可再现的器官型皮肤模型的需要尚未满足，这样的器官模型可以促进治疗剂和美容剂的鉴定和对皮肤病的研究。
本公开内容涉及器官型皮肤/黏膜组织等效模型或等效物，其是全厚的，任选但有利地血管化的并且是真正分化的以提供更具代表性的(即在人组织/皮肤的形态学和功能性上的)等效物。此外，所述等效物是使用已知遗传来源的材料制备的——与现有等效物相比，其在功能上稳定并且限制外来感染剂的引入以提供优越的稳定性和长寿，其用于筛选、开发和评价美容剂、药剂和治疗剂的有效性。
发明详述
根据本发明的一个方面，提供了用于制备器官型血管化组织、皮肤或黏膜等效物或组合物的方法，其包括以下步骤：
i)获得哺乳动物多能干细胞的制备物，并在细胞培养条件下培养细胞以诱导形成以下分化的细胞类型：内皮细胞(SC-EC)、血管平滑肌细胞和/或周细胞(统称为SC-vSMC)、成纤维细胞(SC-Fib)和角质化细胞(SC-KC)；
ii)将部分i)中的SC-EC、SC-vSMC和任选地SC-Fib接种在支架中或支架上，并在细胞培养条件下进一步培养细胞以诱导形成血管化真皮层；
iii)将部分i)中的SC-KC接种到部分ii)中的血管化真皮层上，并在细胞培养条件下进一步培养细胞以诱导在所述血管化真皮层上形成角质化表皮复层(stratified layerof keratinized epidermis)，以提供器官型血管化皮肤或黏膜等效物；以及
iv)将通过步骤i)至iii)制备的所述器官型血管化皮肤或黏膜等效物维持在细胞培养物中。
在某些实施方案中，所述角质化细胞为真皮角质化细胞(SC-KC)和/或口腔黏膜角质化细胞(SC-口腔-KC)，并且在前者仅使用真皮角质化细胞的情况下，获得真皮模型，在后者仅使用口腔角质化细胞的情况下，获得口腔模型。
在某些实施方案中，所述哺乳动物多能干细胞是起源于胚胎的，例如人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)或人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cell，hEGC)。作为替代或补充，所述哺乳动物多能干细胞为诱导多能干细胞，例如人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)。有利地，这允许通过潜在地提供无限的皮肤细胞源来产生具有必需的屏障特性的、填充(populate)有真皮和表皮细胞的一致表皮和全厚的皮肤或黏膜等效物。此外，通过将人hESC/hEGC/hiPSC来源的细胞系并入皮肤等效物(skin equivalent，SE)中，它们提供了体内观察到的更真实的细胞表型反映。
本文中提及的细胞培养条件包括涉及根据本发明的设计用于支持细胞(特别是干细胞或由其来源的细胞)生长的培养基。可以使用许多不同类型的化学培养基来支持培养物中的干细胞或祖细胞或者由其来源的细胞的生长，例如但不限于补充有胎牛血清或血清替代物的饲养层支持***培养基(feeder support system medium)和补充有限定培养基的无饲养层***，例如mTeSRTM1和TeSRTM8。
然而，与要求保护的方法结合使用的所有细胞培养物可以任选地为无血清细胞培养物，并且还任选地为无饲养层的(最低限度使用源自动物的细胞和蛋白质)。在某些实施方案中，使用这样的方法，其中无血清培养基由补充有血清替代物和无饲养层***中的生长补充物的基础培养基构成。
此外，在又一些方法中，所述细胞培养基包含可用于支持正常细胞存活、代谢或分化的至少一种其他化合物、试剂或药物，例如但不限于视黄酸、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、氢化可的松、转铁蛋白、抗坏血酸、氯化钙、胰岛素、抑肽酶、糖原合酶-3的抑制剂(其包括但不限于CHIR99021、BIO、SB 216763、SB 415286、CHIR-98014)或骨形态发生蛋白4(bonemorphogenetic protein 4，BMP4)。
在某些方法中，所述细胞培养条件包含另外的细胞类型，例如但不限于黑素细胞或巨噬细胞。细胞与黑素细胞的共培养提供了表现出色素沉积的上皮皮肤等效物，其允许评估UV暴露和抗UV材料对皮肤的影响。同样地，使用巨噬细胞允许开发用于测试药物的免疫致敏作用(immune sensitization)的有免疫活性的体外皮肤等效物并建立体外疾病等效物；在某些实施方案中，所述另外的细胞类型是自体的或由干细胞来源的。
另外地，根据某些方法，所述另外的细胞类型是由人胚胎干细胞(hESC)来源的。
在另一些实用iPSC的方法中，所述细胞是自体的，因此器官型的理想血管化皮肤或黏膜等效物是对特定的人定制的。
在另一些方法中，所述方法包括在步骤iii)之前，培养步骤ii)中的所述细胞至少1至20天，或2至14天，或选自包括以下组的许多天数：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14天。
在另一些方法中，使所述哺乳动物多能干细胞分化以诱导形成选自包括以下组的分化的细胞类型：内皮细胞(hESC-EC)、血管平滑肌细胞和/或周细胞(统称为hESC-vSMC)、成纤维细胞(hESC-Fib)和角质化细胞(hESC-KC)，这包括使用如本文中所述方法部分所述的细胞培养基，特别是其部分1至4中所述的细胞培养基，和/或如本文中所述方法部分所述的方法，特别是其部分1至4中所述的方法，包括其中所述的范围，特别是其中使用的典型的量/浓度/比例。
在另一些方法中，所述皮肤角质化细胞和口腔角质化细胞分别是通过使用方法部分的部分2和3中所述的细胞培养基和/或方法制备的，包括其中所述的范围，特别是其中使用的典型的量/浓度/比例。
在另一些方法中，将部分i)中的SC-EC、SC-vSMC和任选地SC-Fib接种在支架中或支架上，并在细胞培养条件下进一步培养细胞以诱导形成血管化真皮层，这包括使用如本文中所述方法部分所述的细胞培养基，特别是其部分6和7中所述的细胞培养基，和/或如本文中所述方法部分所述的方法，特别是其部分6和7中所述的方法，包括其中所述的范围，特别是其中使用的典型的量/浓度/比例。
本文中提及的支架是指能够通过复制体内细胞环境(包括细胞附着、细胞信号传导和扩散以及机械支撑)支持三维组织细胞培养的任何材料。如本领域技术人员将理解的，存在许多不同类型的支架并且可以根据本文中所述的方法使用，例如具有必需的孔隙率以有利于细胞接种以及细胞和营养物二者在整个结构中的扩散的细胞培养支架。
细胞培养支架的一个实例在US2010/048411中公开，其内容通过引用并入本文。这些基底包含被描述为“聚HIPE”聚合物的微孔聚合物材料。这些聚合物形成彼此相互连接的具有孔的网状结构以提供细胞可以附着和增殖的基底。形成聚HIPE的方法允许准确地控制孔体积，孔体积从75％到97％地变化。孔径可以在0.1至1000微米之间变化，相互连接的构件的直径为几微米至100微米。此外，聚HIPE可以与有利于细胞增殖和/或分化的另外的组分结合。因此，聚HIPE是细胞培养***中细胞可以附着和增殖的多功能基底。用于制备聚HIPE的方法在本领域中是公知的，还在WO2004/005355和WO2004/004880中公开。聚HIPE可商购并且包含例如油相单体苯乙烯、二乙烯基苯和表面活性剂，例如Span 80山梨聚糖单油酸酯。此外，在加工聚HIPE期间形成的聚合物的刚性可受所包含的单体(例如丙烯酸2-乙基己酯)的影响。由乳液形成聚HIPE的方法通过添加催化剂(例如过硫酸铵)来起始。
在某些方法中，所述支架包含基于生物相容性聚合物的支架，例如但不限于聚酯，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚-dl-乳酸-乙醇酸共聚物等。细胞支持基底可以是可降解的或不可降解的。
在另一些方法中，所述支架是基于纤维蛋白的支架，其有利地克服了与其他公开的和可商购的皮肤等效物有关的限制，例如皮肤收缩、短期培养和缺乏血液供应。
在另一些方法中，所述支架为凝胶支架，例如但不限于聚乙二醇-纤维蛋白、纤维蛋白、I型胶原蛋白胶支架等。支架可以在如本文中所述方法部分，特别是其部分6中所述的细胞培养基中培养，和/或如本文中所述方法部分，特别是其部分6中所述的制备的细胞培养基中培养，包括其中所述的范围，特别是其中使用的典型的量/浓度/比例。
在某些实施方案中，将hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib以约10∶1∶1至约40∶1∶1、约10∶1∶1至约35∶1∶1、约10∶1∶1至约30∶1∶1、约10∶1∶1至约25∶1∶1、约15∶1∶1至约25∶1∶1、约17∶1∶1至约25∶1∶1、约17∶1∶1至约22∶1∶1、约18∶1∶1至约22∶1∶1、约18∶1∶1至约21∶1∶1或约19∶1∶1至约21∶1∶1的比例设置在支架中。在某些实施方案中，将hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib以约20∶1∶1的比例提供在支架中。在某些实施方案中，支架为PEG-纤维蛋白胶支架。
在以下的一些实施例中，用3D血管化培养基(如下所述)滋养具有hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib的PEG-纤维蛋白胶10天，每24小时更换培养基。在10天的3D三重培养(tri-culture)期后，进行上述步骤iii)。
在又一些方法中，将部分i)中的hESC-KC接种到部分ii)中的血管化真皮层上，并在细胞培养条件下进一步培养细胞以诱导在所述血管化真皮层上形成角质化表皮复层，以提供器官型血管化皮肤或黏膜等效物，这包括使用如本文中所述方法部分的无血清细胞培养基，特别是其部分7和8中所述的无血清细胞培养基，和/或使用如本文中所述方法部分所述的方法，特别是其部分7和8中所述的方法，包括其中所述的范围，特别是其中使用的典型的量/浓度/比例。
在某些实施方案中，可以将角质化细胞以约10×104至约40×104、约10×104至约35×104、约10×104至约30×104、约15×104至约30×104、约20×104至约30×104、约20×104至约29×104、约21×104至约29×104、约21×104至约28×104、约22×104至约28×104、约22×104至约27×104、约23×104至约27×104、约23×104至约26×104或约24×104至约26×104的接种密度接种在血管化真皮层的顶部。在某些实施方案中，可以将角质化细胞以25×104细胞/cm2的接种密度接种在血管化真皮层的顶部上。对于产生体外血管化皮肤等效物，可以接种hESC-KC，而对于产生体外血管化黏膜等效物，可以接种hESC-口腔KC。在该角质化细胞培养阶段中，用3D上皮培养基(如下所述)滋养PEG-纤维蛋白胶2至3天，每24小时更新培养基。
在另一些方法中，在气-液界面处培养所述哺乳动物角质化细胞。这可以通过将培养物转移到(例如12孔的)深孔板(Griener BioOne)并仅从底部表面供应培养基(而顶部表面暴露于空气)来完成。在该阶段使用的理想培养基可以为4mL/孔的3D角质化(cornification)培养基(如下所述)。在使用气-液界面培养的第三周结束时，得到完成的等效物。
本文中提及的术语气-液界面(Air-Liquid Interface，ALI)是指这样培养细胞使得其基底膜与液体接触或浸没在液体中，其顶端膜与空气接触。有利地，角质化细胞因此在其分化中显示出顶端-基底极性，导致如体内所见的功能性角质化表面的发育。
根据另一个方面，提供了通过根据本发明的方法获得或获得时或可获得的经分离的分化的内皮细胞(hESC-EC)、血管平滑肌细胞和/或周细胞(统称为hESC-vSMC)、成纤维细胞(hESC-Fib)或者真皮或口腔角质化细胞(hESC-KC)。
根据另一个方面，提供了通过根据本发明的方法获得或获得时或可获得的经分离的器官型血管化组织、皮肤或黏膜等效物。
根据另一个方面，提供了用于制备器官型组织或皮肤或黏膜等效物或组合物的方法，其包括以下步骤：
i)将内皮细胞和血管平滑肌细胞/周细胞和任选地成纤维细胞接种在支架中或支架上以提供血管化真皮层；
ii)在部分i)中的血管化真皮层上接种角质化细胞，并在细胞培养条件下进一步培养细胞以诱导在所述血管化真皮层上形成角质化表皮复层，以提供器官型皮肤或黏膜等效物；以及
iii)将通过步骤i)至ii)制备的所述器官型组织、皮肤或黏膜等效物维持在细胞培养物中。
在某些实施方案中，所述角质化细胞为真皮角质化细胞(SC-KC)和/或口腔黏膜角质化细胞(SC-口腔KC)，并且在前者仅使用真皮角质化细胞的情况下，获得真皮等效物，在后者仅使用口腔角质化细胞的情况下，获得口腔等效物。
在某些方法中，所述细胞是自体的，因此器官型组织、皮肤或黏膜等效物是对特定的人定制的。
根据另一个方面，提供了通过根据本发明的任一方法获得或获得时或可获得的器官型组织、皮肤或黏膜等效物。
根据另一个方面，提供了包含通过根据本发明的任一方法获得或获得时或可获得的器官型皮肤组合物的治疗性组织/皮肤移植物或植入物。
根据本发明的又一个方面，提供了根据本发明的器官型组织/皮肤移植物或植入物，其用于治疗皮肤损伤。
在某些实施方案中，皮肤损伤包括由感染或创伤，包括伤口、瘢痕形成或烧伤引起的损伤；或者响应于疾病，例如由于在癌症中或者在治疗糖尿病性或非糖尿病性溃疡中移除组织而需要的皮肤移植物。
根据另一个方面，提供了美容性组织/皮肤移植物或植入物，其包含通过根据本发明的任一方法获得或可获得的器官型皮肤组合物。
根据另一个方面，提供了治疗方法，其包括将根据本发明的任一方法的组织/皮肤移植物或植入物施用或植入在哺乳动物的待治疗部位处或部位之中。
根据又一个方面，提供了美容外科手术方法，其包括将根据本发明的任一方法的组织/皮肤移植物或植入物植入在哺乳动物的待治疗部位中。
根据另一个方面，提供了细胞培养物容器，其包含有根据本发明的器官型组织、皮肤或黏膜等效物。
在某些实施方案中，所述细胞培养物容器包含有任选可移除的细胞培养物***物，所述细胞培养物***物包含有与细胞培养基流体接触的所述器官型组织、皮肤或黏膜等效物。
在某些实施方案中，所述培养物容器包含有如本文所述的方法中所述的细胞培养基。
根据另一个方面，提供了根据本发明的器官型组织、皮肤或黏膜等效物，其用于对测试剂的皮肤细胞功能和渗透性进行测试，所述测试剂例如但不限于治疗剂、药物、真皮软膏、口腔/牙科产品、美容剂、化合物或生物活性异生物质剂(xenobiotic agent)。
在本文中为术语“异生物质剂”给出了宽泛的定义，不仅包括化合物，还包括气体剂。通常，异生物质剂包括用于人和兽医的药物活性剂以及人美容剂。
在又一些实施方案中，所述测试剂可以通过将其添加至所述细胞培养基中来接触细胞培养物。或者，所述测试剂可以通过将其添加至所述器官型等效物的顶端表面来接触细胞培养物。有利地，这允许递送除了可溶性测试剂之外的测试剂，包括蒸汽、气体和干燥的气载(air-borne)粉末，这是体内发生的更具代表性的事件，其中皮肤上皮是对多种不同试剂的第一道防线之一。
根据另一个方面，提供了细胞阵列，其中所述阵列包含根据本发明的多个细胞培养物容器。
大量试剂的筛选需要制备细胞阵列用于进行操作细胞和施用试剂。例如，测定装置包括通常与自动化加样和机器人操作***兼容使用的具有例如6、12、24、48、96和384孔的形式的标准多孔微量滴定板。通常，高通量筛选使用试剂与指示剂化合物的均匀混合物，该指示剂化合物被转化或修饰导致产生信号。信号通过合适的方式(例如检测荧光发射、光密度或放射性)测量，然后整合来自每个包含细胞、试剂和指示剂化合物的孔的信号。
在某些实施方案中，在气-液界面处培养所述哺乳动物角质化细胞。
根据另一个方面，提供了用于高通量筛选测试剂的方法，其包括以下步骤：
i)提供根据本发明的阵列；
ii)使阵列与多种待测试的试剂接触；
iii)整理在上述(ii)后获得的活性数据；
iv)将所整理的数据转换成数据可分析形式；以及任选地
v)提供所分析数据的输出。
在某些方法中，使器官型等效物与至少一种治疗剂、美容剂、化合物或异生物质剂接触。
在某些方法中，在气-液界面处培养所述哺乳动物角质化细胞。
培养方法可以导致在细胞支持基底中有利地形成稳定的真皮层。此外，在所述成纤维细胞/支持基底真皮层上在气-液界面处培养角质化细胞可以导致角质化细胞在其分化中显示出顶端-基底极性，导致如体内所见的具有表皮分层的功能性角质化或非角质化表面的发育。此外，已经发现在没有将成纤维细胞包埋在封闭的基底中的情况下，可以探索皮肤层之间的细胞相互作用。因此，这导致形成具有优越的稳定性和长寿命的可靠且真实的皮肤等效物，其在重建皮肤外科手术中具有应用。
在某些实施方案中，任何另外的方面可包括任何前述特征或以其为特征。
如本文中使用的，当与数值结合使用时术语“约”意指涵盖和包括所述数值的±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或±0％的数值。
贯穿本说明书的描述和权利要求书，词语“包括/包含”和“含有”以及这些词语的变体意指“包括但不限于”，并且不旨在(并且不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。
贯穿本说明书的描述和权利要求书，除非上下文另有要求，否则单数包括复数。特别地，在未指明数量的情况下，除非上下文另有要求，否则本说明书应理解为考虑复数以及单数。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
此外，除非另有说明，否则本文中公开的任何特征可以由用于相同或相似目的的替代性特征所替代。
不承认本文中参考的任何参考文献构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。
现在将仅通过示例并参考以下附图来描述本发明的一个实施方案：
图1：在基质胶(Matrigel)上培养的hESC的多能性状态的分析。左上的显微照片示出了在基质胶和mTeSR1上培养时hESC集落的紧密的明确的形态。免疫荧光显微照片示出了多能性标志物OCT4、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)的表达。比例尺：500μm。
图2：(a)使hESC分化成hESC来源的上皮祖细胞的示意图，通过在限定性角质化细胞无血清培养基(defined keratinocyte serum-free medium，DKSFM)中依次用BMP4、视黄酸(RA)和抗坏血酸(ascorbic acid，AA)处理48小时然后用RA和AA处理来进行分化。将hESC来源的上皮祖细胞在IV型胶原蛋白(1μg/cm2)/0.1％明胶包被的板上传代并在DKSFM中增殖以产生hESC-KC。(b)示出了hESC、hESC来源的上皮祖细胞和hESC-KC的相差图像的代表性显微照片。(c)示出了对角质化细胞标志物K14和p63染色的hESC-KC的免疫荧光图像的代表性显微照片。比例尺：(b)-200μm，(c)-100μm。
图3：(a)使hESC分化成hESC来源的上皮祖细胞的示意图，通过在限定性角质化细胞无血清培养基(DKSFM)中依次用视黄酸(RA-1μM)和抗坏血酸(AA-50μg/ml)处理48小时然后用RA(0.5μM)和AA(50μg/ml)处理来进行分化。将FACS分选出的α6-整联蛋白高和CD71低群在IV型胶原蛋白(1μg/cm2)/0.1％明胶包被的板上传代并在DKSFM中增殖以产生hESC-口腔KC。(b)示出了hESC、α6-整联蛋白高和CD71低群和hESC-口腔KC的相差图像的代表性显微照片。(c)示出了对角质化细胞标志物K14和p63染色的hESC-口腔KC的免疫荧光图像的代表性显微照片。比例尺：(b)-200μm，(c)-100μm。
图4：(a)使hESC分化成hESC内皮祖细胞(CD34+CD31+细胞)的示意图，通过依次用CHIR99021(+GSKi)、bFGF和VEGF处理来进行分化。在分化5天后使用流式细胞术分选hESC来源的内皮祖细胞，并使其进一步向hESC-EC分化。(b，c)针对CD31+CD34+PDGFRβ-细胞，对hESC-内皮祖细胞进行基于流式细胞术的分选。(d)显微照片示出了在相差显微术下hESC-EC的鹅卵石(cobblestone)形态。与内皮(e)和vSMC(f)谱系相关的转录物的实时RT-PCR分析。(g)示出了内皮谱系相关标志物的表达、与凝集素UEA-1的结合和PDGFRβ表达的缺少的流式细胞术直方叠加图。(h)示出了CD31和VE-CAD的表面表达、vWF的胞质表达和在基质胶上形成管状结构的免疫荧光显微照片。比例尺：100μm。
图5：(a)在饲养层和无血清条件下使hESC分化成hESC-轴旁中胚层祖细胞并然后分化成hESC-周细胞的方案。以下的代表性流式细胞术叠加图：(b)CD34、CD31、VEGFR2和PDGFRβ的表达；(c)CD34、CD31和PDGFRβ的共表达，以及PDGFRβ+CD34-CD31-细胞的分选。(d)示出了hESC-vSMC的纺锤形形态的相差显微照片。与vSMC/周细胞(e)和内皮(f)谱系相关的转录物的实时RT-PCR分析。(g)示出了与内皮谱系(CD34、CD31)、vSMC/周细胞谱系(PDGFRβ、NG2)和间充质谱系(CD73、CD90、CD105)相关的表面标志物的表达的流式细胞术叠加图。(h)示出了与vSMC谱系相关的胞质细胞骨架蛋白的表达的流式细胞术直方叠加图。(i)示出了αSMA和钙调理蛋白(calponin，CNN1)的胞质表达的免疫荧光显微照片。比例尺：100μm。
图6：(a)3D体外血管化皮肤的苏木精和伊红(H-E)染色切片的代表性显微照片。表皮由角质化细胞复层和角质化区域(cornification)组成，而真皮显示存在微血管***和成纤维细胞。(b)3D体外血管化皮肤的***固定的石蜡包埋切片的免疫荧光显微照片，其示出了K14的表达。(c)3D体外血管化皮肤的真皮层的H-E染色切片的显微照片，其示出了存在微血管通道。(d)3D体外血管化皮肤的***固定的石蜡包埋切片的免疫荧光显微照片，其示出了存在腔化的微血管通道以及分别由hESC-EC和hESC-vSMC表达的vWF和CNN1。
图7：(a)3D体外血管化黏膜等效物的苏木精和伊红(H-E)染色切片的代表性显微照片。组织等效物由非角质化鳞状上皮复层和下方的血管化组织组成。箭头标记微血管***的存在。(b)3D体外血管化黏膜的***固定的石蜡包埋切片的免疫荧光显微照片，其示出了K14和K10的表达。(c)3D体外血管化黏膜的***固定的石蜡包埋切片的免疫荧光显微照片，其示出了存在腔化的微血管通道(箭头)以及IV型胶原蛋白(Col-IV)和纤连蛋白的表达。
图8：示出了以下的免疫荧光染色：(A)显示成纤维细胞中的波形蛋白、内皮细胞中的冯·维勒布兰德因子(Von Willebrand Factor，VWF)、平滑肌细胞/周细胞中的平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)、口腔角质化细胞中的K19和皮肤-角质化细胞中的K14的原代细胞。(B)血管化前的黏膜和血管化前的皮肤组织等效物的苏木精和伊红(H&E)染色切片的显微镜图像。组织等效物由非角质化复层(黏膜模型)和角质化复层(皮肤模型)组成。箭头展示血管的存在。
图9：(a)在PEG-纤维蛋白胶中3D培养1、4和6天后由hESC-EC(没有hESC-周细胞)形成的微血管网络的代表性3D投影共焦z-堆叠图像。这一系列图像示出了在培养4天后形成融合带(anastomosing cord)的EC的发芽(sprouting)，但是在6天后经历退化。(b)在PEG-纤维蛋白胶中3D共培养1、4、6、9、12、15和21天后由hESC-EC(绿色)和hESC-周细胞(红色)形成的微血管网络的代表性3D投影共焦z-堆叠图像。这一系列图像示出了在培养4至6天后形成融合带的EC的发芽，并且在延长的培养下在内皮网络的厚度和相互连接性上经历成熟。比例尺：200μm。(c)条形图表明了随着hESC-EC接种密度的变化的血管参数的变化。误差条：s.d.(N≥3)。＊P＜0.05。
图10：体外血管渗透性的评估。(a-c)微血管通道不透过葡聚糖分子(红色)，即看到葡聚糖分子在血管壁外侧，而腔是清澈的。(d-f)然而，当用组胺预孵育血管通道时，导致葡聚糖分子渗透到微血管通道的腔内(白色箭头)，表明响应组胺而泄漏。微血管的横截面图示出了腔内存在葡聚糖(黄色箭头)。比例尺：50μm。
材料和方法
1.人胚胎干细胞(hESC)增殖：将hESC细胞系在完全mTeSRTM1培养基中在基质胶包被的组织培养板上培养。针对多能性标志物OCT4、SSEA4和碱性磷酸酶的表达对细胞系进行常规表征。每5至7天，通过在37℃下暴露于1mg/ml分散酶5至10分钟使细胞传代。收集hESC集落并通过温和吹打分成小片集落，将其以5至6集落每10cm2铺在基质胶预包被的板上。
2.使hESC分化成hESC-KC：如上所述使hESC增殖。在无血清培养基条件下进行hESC向hESC-KC的分化。用在限定性角质化细胞无血清培养基(DKSFM)中的BMP4(10至50ng/ml，通常为25ng/ml)、视黄酸(0.1至1uM，通常为0.5μM)和抗坏血酸(10至100ug/ml，通常为50μg/ml)的混合物制备角质化细胞分化培养基。提供分化培养基用于进行首先的48至96小时(通常为48小时)的分化，在此期间神经外胚层谱系被抑制，此后用不含BMP4的新鲜制备的分化培养基更新培养基。在接下来的7至8天继续分化过程，每48小时更新培养基一次1，2。一旦汇合达到80％，将细胞分成1∶3比例并接种到IV型胶原蛋白(0.5至2μg/cm2，通常为1μg/cm2)或0.1％明胶包被的板上。使用DKSFM培养细胞并增殖。传2至4代后，通过免疫荧光染色表征成熟的角质化细胞(hESC-KC)并用于进一步的功能研究。
3.使hESC分化成hESC-口腔KC：如上所述，使hESC增殖。在无血清培养基条件下进行hESC向hESC-口腔KC的分化。用在DKSFM中的视黄酸(0.1至2μM，通常为1μM)和抗坏血酸(10至100μg/ml，通常为50μg/ml)的混合物制备角质化细胞分化培养基。提供分化培养基用于进行首先的48至72小时(通常48小时)的分化，在此期间神经外胚层谱系被抑制，此后用具有视黄酸(0.1至2μM，通常为0.5μM)和抗坏血酸(10至100μg/ml，通常为50μg/ml)的新鲜制备的角质化细胞分化培养基更新培养基。在接下来的7至8天继续分化过程，每48小时更新培养基一次1，2。分化10天后，使用流式细胞术辅助分选(flow cytometry assistedsorting，FACS)针对α6-整联蛋白高和CD71低细胞群对细胞进行分选。将分选出的α6-整联蛋白高和CD71低细胞群接种到IV型胶原蛋白(1μg/cm2)上。将细胞在DKSFM中培养并在IV型胶原蛋白(1μg/cm2)或0.1％明胶包被的板上增殖。传2至4代后，通过实时PCR、免疫荧光染色表征成熟的口腔角质化细胞(hESC-口腔KC)，并用于进一步的功能研究。
4.使hESC分化成成纤维细胞：如我们研究组以前描述的，使hESC分化成hESC-Fib3 ，4。
5.使hESC分化成血管细胞：将在无饲养层条件下增殖的hESC接种在纤连蛋白预包被的板上。允许24小时的hESC集落附着。此后将培养基更换为STEMdiffTM APEL培养基(化学限定性无动物组分培养基)。通过使用BIO/CHIR 98014或CHIR99021(2至6μM，通常为5μM)抑制GSK-3(糖原合酶激酶-3，glycogen synthase kinase-3)路径导致多能性和外胚层标志物下调，将hESC导向原条。随后，通过用通常50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF 10至100ng/ml)处理细胞24小时进行分化，此后用VEGF(10至100ng/ml，通常为50ng/ml)孵育细胞72小时。在分化的第5天，针对CD34+CD31+细胞(hESC-内皮祖细胞)和PDGFβ+CD34-CD31-细胞(hESC-vSMC祖细胞)对细胞进行FACS分选。将FACS分选出的hESC内皮祖细胞接种在纤连蛋白预包被(1至5μg/cm2，通常为1.5μg/cm2)的板上，并在补充有VEGF(25至25ng/ml，通常为0ng/ml)、bFGF(0至50ng/ml，通常为10ng/ml)和EGF(0至20ng/ml，通常为5ng/ml)的内皮无血清培养基(ESFM，GIBCO)中培养2至5代。类似地，FACS分选出hESC-vSMC祖细胞，将其接种在纤连蛋白预包被的板(1至5μg/cm2，通常为1.5μg/cm2)上，并在补充有PDGFbb(1至20ng/ml，通常为10ng/ml)、bFGF(0至20ng/ml，通常为10ng/ml)和EGF(0至20ng/ml，通常为5ng/ml)的平滑肌细胞无血清培养基中培养3至10代5，6。在培养2至4代后，针对内皮细胞和vSMC标志物的表达分别对hESC-EC和hESC-vSMC进行表征，并用于功能研究。使用基质胶管形成测定研究hESC-EC的体外功能性，如我们研究组以前公开的5。
6.PEG-纤维蛋白胶的制造：通过公开方案7的修改方案制造聚乙二醇(PEG)-纤维蛋白胶。使用来自人或牛血浆的纤维蛋白原、琥珀酰亚胺基戊二酸酯封端的PEG-4-臂、凝血酶和氯化钙。所有四种化学品的工作原液都是通过按照制造商的说明书制备的。简而言之，纤维蛋白原是在0.1M碳酸氢钠(pH-8.3)中以80mg/ml的浓度重构的，并在室温下轻轻摇动混合1小时，在等分后将原液储存在-80℃下。PEG是以8mg/ml的浓度重构的，将等分试样储存在-20℃下。人凝血酶或牛凝血酶以100U/ml的浓度等分并储存在-20℃下。考虑到纤维蛋白原和PEG的最终浓度分别为10mg/ml和0.25mg/ml，通过以10∶1至50∶1(通常为40∶1)的比例混合PEG-纤维蛋白原制造了支架。将该混合物在37℃下孵育20至30分钟。将凝血酶和CaCl2(40mM)分别以1∶3的比例混合，并置于冰上20至30分钟。将所需的多种细胞类型添加至PEG-纤维蛋白原溶液。将等体积的凝血酶-CaCl2和PEG-纤维蛋白原-细胞悬浮液混合用于制造血管化真皮等效物。在37℃下孵育10分钟后，用3D血管化皮肤培养基滋养3D细胞支架。
7.3D血管化皮肤培养基：
考虑到不同的培养阶段，将培养基分为三种不同的培养基。
A.3D血管化培养基：由无血清内皮培养基组成，以作为基础培养基，向其中与抗生素一起添加血管生长补充物，例如血管内皮生长因子(VEGF，5至50ng/ml，通常为20ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF 1至25ng/ml，通常为20ng/ml)和表皮生长因子(EGF，1至20ng/ml，通常为10ng/ml)。还包括抑制纤维蛋白降解的抑酶肽(25至200KIU/ml，通常为100KIU/ml)。
B.3D上皮培养基：在血管化真皮等效物的顶部上接种hESC-KC后，将该培养基添加至培养物。该培养基由具有VEGF(5至50ng/ml通常为20ng/ml)、bFGF(1至25ng/ml，通常为20ng/ml)、EGF(1至20ng/ml，通常为10ng/ml)、抑肽酶(25至200KIU/ml，通常100KIU/ml)、抗坏血酸(10至100ug/ml，通常为50μg/ml)、胰岛素(5至20ug/ml，通常10μg/ml)、硒(1至10ug/ml，通常为5μg/ml)、转铁蛋白(1至10ug/ml，通常为5.5μg/ml)和抗生素的无血清内皮培养基组成。
C.3D角质化培养基：该培养基用于在气-液界面处培养血管化皮肤等效物。该培养基由具有VEGF(5至50ng/ml，通常为20ng/ml)、bFGF(1至25ng/ml，通常为20ng/ml)、EGF(1至20ng/ml，通常为10ng/ml)、抑酶肽(25至200KIU/ml，通常为100KIU/ml)、抗坏血酸(10至100μg/ml，通常为50μg/ml)、胰岛素(5至20μg/ml，通常为10μg/ml)、硒(1至10μg/ml，通常为5μg/ml)、转铁蛋白(1至10μg/ml，通常为5.5μg/ml)、CaCl2(1至1.8mM，通常为1.2mM)、氢化可的松(0.1至1μg/ml，通常为0.5μg/ml)、三碘代L-甲状腺氨酸(1至5nM，通常为2nM)和抗生素的无血清内皮培养基组成。
8.体外3D血管化皮肤/黏膜的形成：
通过考虑PEG-纤维蛋白水凝胶作为支架来发育出3D体外构建体，所述支架充当细胞在其内和其上生长的平台。通过依次使血管化真皮等效物然后使表皮生长制造了体外血管化皮肤等效物。通过将hESC-EC(1x106至5x106，通常为2.5x106hESC-EC/PEG-纤维蛋白胶mL)、hESC-vSMC和hESC-Fib(在EC的浓度为1x106至5x106 hESC-EC/mL下以10∶1∶1至40∶1∶1的比例，通常为20∶1∶1的比例)包封在PEG-纤维蛋白胶中制造了血管化真皮等效物。简而言之，使用来自人或牛血浆的纤维蛋白原、琥珀酰亚胺基戊二酸酯封端的PEG-4-臂、人凝血酶和氯化钙。所有四种化学品的工作原液都是通过按照制造商的说明书制备的。纤维蛋白原是在0.1M碳酸氢钠(pH-8.3)中以80mg/ml的浓度重构的，在室温下轻轻摇动混合1小时，并在等分后将原液储存在-80℃下。PEG是以8mg/ml的浓度重构的，等分试样储存在-20℃下。人或牛凝血酶是在无菌蒸馏水中以100U/ml的浓度重构的，并将等分试样储存在-20℃下。考虑到纤维蛋白原和PEG的最终浓度分别为10mg/ml和0.25mg/ml，通过在纤维蛋白原固定在10mg/ml的浓度下以10∶1至50∶1的比例(通常为40∶1的比例)混合PEG-纤维蛋白原制造了支架。将该混合物在37℃下孵育20至30分钟。将凝血酶(100U/ml)和CaCl2(40mM)分别以1∶3的比例混合，并置于冰上。将细胞(hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib)悬浮在100μl PEG-纤维蛋白原溶液中并与100μl凝血酶-氯化钙溶液混合，立即移液至12孔培养物***物中以形成PEG-纤维蛋白胶，在培养时导致形成血管化真皮等效物。用3D血管化培养基(如上所述)滋养具有hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib的PEG-纤维蛋白10天，每24小时更换培养基。在10天3D三重培养期后，将角质化细胞以10至40x104/cm2(通常25x104细胞/cm2)的接种密度接种在血管化真皮等效物的顶部上。对于产生体外血管化皮肤等效物，接种hESC-KC，而对于产生体外血管化黏膜等效物，接种hESC-口腔KC。在该角质化细胞培养阶段，用3D上皮培养基滋养PEG-纤维蛋白胶2至3天，每24小时更新培养基。然后，通过将培养物***物转移至12孔深孔板(Griener BioOne)并仅从底部表面供应培养基(而顶部表面暴露于空气)在气-液界面处培养3D共培养物。在此阶段使用的培养基为4mL/孔的3D角质化培养基。在气-液界面处培养第三周结束时，使用4％多聚甲醛(PFA)将3D培养物在4℃下固定过夜并进行石蜡包埋。使用***固定的石蜡包埋样品的切片进行针对血管标志物和上皮标志物的常规的使用苏木精-伊红染色和免疫荧光染色的常规组织学分析。类似地，在单独的实验设置中，考虑基于原代细胞的模型作为对照3D皮肤/黏膜模型，用原代细胞(即内皮、周细胞、成纤维细胞、真皮角质化细胞和口腔角质化细胞)制造PEG-纤维蛋白支架以形成3D血管化皮肤/黏膜(图8中描绘的)。
结果
1.hESC的培养和表征：
针对多能性标志物对在基质胶上培养的hESC进行常规表征，如图1中描绘的。
2.使hESC分化成hESC-KC：
如上述的和图2中描绘的，使hESC分化成hESC-KC。如图2a中描绘的在DKSFM中依次用BMP4、视黄酸(RA)和抗坏血酸(AA)处理生长在基质胶包被的板上的hESC，导致出现hESC来源的上皮祖细胞的集落。hESC来源的上皮祖细胞的分离和在IV型胶原蛋白或明胶包被的板上连续传代导致hESC上皮祖细胞成熟为hESC-KC(图2b)。这些hESC-KC针对基底角质化细胞标志物K14和p63是阳性的，证实了角质化细胞谱系的身份(图2c)。
3.使hESC分化成hESC-口腔KC：
如上所述的和图3中描述的，使hESC分化成hESC-KC。如图3a中描绘的在DKSFM中依次用视黄酸(RA)和抗坏血酸(AA)处理生长在基质胶包被的板上的hESC导致出现hESC来源的上皮祖细胞的集落。针对α6-整联蛋白高和CD71低群对这些祖细胞进行FACS分选，将其接种到IV型胶原蛋白包被的板上并在DKSFM中培养。在IV型胶原蛋白或明胶包被的板上连续传代导致成熟为hESC-口腔KC(图3b)。这些hESC-口腔KC针对基底角质化细胞标志物K14和p63是阳性的，证实了角质化细胞谱系的身份(图3c)。
4.使hESC分化成hESC-EC：
如图4中描绘的，使hESC分化成hESC-EC。我们早先已经建立了一种新的有效驱动hESC分化成原条样阶段(primitive streak-like stage，PS)的方案，通过短期抑制糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3)，其通过调节BMP4和VEGF6可以被诱导成外侧和轴旁中胚层亚型。我们修改了我们早先的方案，通过在使用VEGF诱导成血管谱系(外侧板中胚层来源物)之前使hESC在人血浆纤连蛋白作为基质(而不是基质胶)上分化并通过短期bFGF脉冲(24小时)驱动hESC来源的PS细胞向中胚层分化(使用CHIR99021的24小时GSK3抑制)，如图4a所概括的。分化5天后，FACS分选CD34+CD31+细胞(hESC-内皮祖细胞)并接种到纤连蛋白包被的板上，在补充有VEGF、bFGF和EGF的ESFM中进一步分化为hESC-EC(图4b至图4c)。终止分化的细胞获得鹅卵石形态，表达内皮标志物CD31、VE-钙黏蛋白和冯·维勒布兰德因子(vWF)(图4d至图4h)。此外，EC显示出自组织以在基质胶上形成血管索状结构的能力(图4h)。总之，这些发现表明在无饲养层和无血清条件下hESC分化成hESC-EC。
5.使hESC分化成hESC-vSMC：
如图5中描绘的，使hESC分化成hESC-vSMC(或hESC-周细胞)。如图5a所示的，通过依次用CHIR99021(5μM)、bFGF和VEGF处理使hESC向血管谱系分化。在分化5天后，FACS分选PDGFRβ+CD34-CD31细胞(hESC-轴旁中胚层祖细胞)(图5b至图5c)，接种到纤连蛋白包被的板上，在补充有PDGFbb、bFGF和EGF的SFM中进一步分化成hESC-vSMC/周细胞。终止分化的细胞获得纺锤形形态，表达vSMC标志物α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和钙调理蛋白(CNN1)(图5d至图5i)。总之，这些发现表明在无饲养层和无血清条件下hESC分化成hESC-vSMC(或hESC-周细胞)。
6.3D体外血管化皮肤等效物的制造：
如方法部分中提及的，通过依次使血管化真皮等效物然后使表皮生长制造了3D体外血管化皮肤等效物。通过将hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib包封在作为支架的PEG-纤维蛋白胶中制造了血管化真皮等效物。然后，通过接种hESC-KC并在气-液界面处培养使血管化真皮等效物上皮化。在气-液界面处培养3周后，将3D共培养物以***固定并包埋在石蜡中。苏木精和伊红(H-E)染色的横切片显示存在表皮和真皮。表皮由角质化细胞复层和角质化区域组成，而真皮显示存在微血管***和成纤维细胞(图6a)。3D体外血管化皮肤等效物的***固定的石蜡包埋横切片的免疫荧光染色显示K14的表达(图6b)。为了使血管***的存在可视化，将3D体外血管化皮肤等效物在真皮侧横向切片。这些横切片的H-E染色显示存在相互连接的微血管通道网络(图6c)。此外，这些横切片的免疫荧光染色显示沿着微血管通道外周存在表达vWF的hESC-EC和在真皮的细胞外基质中的微血管通道外存在表达钙调理蛋白(CNN1)的hESC-vSMC(图6d)。
7.3D体外血管化黏膜等效物的制造：
如方法部分中提及的，通过依次使血管化组织等效物然后使黏膜上皮生长制造了3D体外血管化黏膜等效物。如上所述，通过将hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib包封在作为支架的PEG-纤维蛋白胶中制造了血管化组织等效物。然后，通过接种hESC-口腔KC并在气-液界面处培养使血管化组织等效物上皮化。在气-液界面处培养3周后，将3D共培养物***固定并包埋在石蜡中。苏木精和伊红(H-E)染色的横切片显示存在代表口腔黏膜的非角质化复层鳞状上皮。上皮下面的组织显示存在微血管***和成纤维细胞(图7a)。3D体外血管化黏膜等效物的***固定的石蜡包埋横切片的免疫荧光染色显示K14和K10的表达(图7b)。为了使血管***的存在可视化，针对基底膜标志物IV型胶原蛋白和纤连蛋白，对3D体外血管化黏膜等效物进行免疫染色。免疫荧光染色显示沿着微血管通道的壁以及上皮和上皮下组织的接合处的IV型胶原蛋白和纤连蛋白的表达(图7c)。
8.基于原代细胞系的模型：
图8(A)展示了原代细胞单层的免疫荧光染色，高亮显示成纤维细胞中的波形蛋白、内皮细胞中的冯·维勒布兰德因子(VWF)、平滑肌细胞/周细胞中的平滑肌肌动蛋白(SMA)、口腔角质化细胞中的K19和皮肤角质化细胞中的K14的表达。图8(B)代表血管化前的黏膜和血管化前的皮肤组织等效物的苏木精和伊红(H&E)染色切片的显微镜图像。组织等效物由非角质化复层(黏膜模型)和角质化复层(皮肤模型)组成。箭头指示血管的存在，表明组织血管化。
9.
实施例1：体外血管化组织等效物作为研究内皮退化的模型
在血管发育中，募集壁细胞(周细胞)的不存在与早期内皮血管的退化有关9。为了研究和模拟内皮退化，我们在PEG-纤维蛋白胶中单独培养hESC-EC(eGFP标记的)。这与以下形态变化有关(图9a)。在培养1天后，大多数hESC-EC主要是圆形的，而小百分比的EC显示伸长的细胞质，表明内皮发芽。虽然，hESC-EC在培养4天后通过细胞间组织形成了EC的短的融合带，但是到培养的第6天，内皮带的数量、长度和相对于非常小的内皮带和圆形细胞的复杂性开始降低(图9b)。到培养的第8天至第9天，通过共焦显微术目测没有可见的细胞，表明缺少hESC-EC以维持血管通道的形成，证明内皮带的退化。因此，这种体外人血管化组织等效模型为研究在胚胎发育和肿瘤血管生成中观察到的内皮退化铺平道路。
实施例2：血管发育的动力学的证明
已知将壁细胞募集到发育中的内皮血管对血管网络的形成、成熟和稳定是重要的9。为了研究血管发育的动力学，在PEG-纤维蛋白胶内将hESC-EC(eGFP标记的)与hESC-周细胞(DsRed2标记的)共培养并使用共焦显微术在3周内成像。在共培养胶中，hESC-EC形成了稳健的微血管网络，到第4天其以少量伸长的内皮带开始，然后随着培养天数的增加，数量、长度、分支、融合和复杂性明显增加(图9c)。此外，这些两细胞微血管网络具有几乎连续的连通腔形成的证据，并且在培养物中稳定3周(图9b)。
因此，这种体外人血管化组织等效模型为研究血管发育的动力学铺平道路。此外，它可以用于研究靶向血管生成的药物(抑制剂/刺激剂)对血管发育和形态发生的动力学的影响。综上所述，这些发现建立了3D体外血管化组织等效物作为用于定量和定性评估微血管网络的分形尺寸的体外模型的用途。体外3D血管类器官可潜在地用作组织微血管***的生理学3D模型以用于进行新的促血管生成化合物和抗血管生成化合物的体外高通量筛选。
实施例3：研究内皮细胞对血管发育的影响
我们还通过改变hESC-EC的接种密度同时保持hESC-EC与hESC-周细胞的比例恒定(20∶1)分析内皮细胞对血管形态发生的影响。据报道EC与vSMC/周细胞的比例根据机体内组织而从1∶1至100∶1变化。在该研究中，我们在所有实验中使用20∶1的固定比例(EC与周细胞)。hESC-EC在约6天内形成了器官型微血管通道的融合网络。根据hESC-EC的初始接种密度，微血管结构延伸、分支并融合成网络。使用与微血管网络有关的多种参数(包括血管网络的总长度、管的总数量和网络内的分支点的数量)缩小用于进一步的实验的hESC-EC的最佳密度。内皮接种密度研究表明随着hESC-EC初始接种密度的增加，总管长度、管数量和分支点的数量显著增加(图9c)。在高于3×106hESC-EC/mL的浓度下，在培养4天后hESC-EC形成许多细长的带，但不能存活；并且基质显示出分解的迹象。这些观察显然可能是由于对生长因子和营养物的竞争，还可能由于hESC血管细胞对基质的过度重塑。在另一方面，在低浓度(＜100,000细胞/mL)下，仅观察到局限于整个基质内某些区域的血管结构的集中生长物。
综上所述，这些结果证明了使用这些体外血管化组织等效物模型体外研究人血管发育的能力。这些应用证明了这些血管化组织等效物作为用于测试靶向血管生成的药物(抑制剂和刺激剂)的新的体外工具的能力。
实施例4：研究血管渗透性
EC的一个重要作用是维持紧密的动态屏障来调节血管的腔内和腔外隔室之间的流体、分子和细胞的运输。EC单层对大分子(1至100kDa)是相对不可透过的，＜1％的通量11。为了评估植入的微血管的体内渗透性，研究使用荧光示踪剂和/或非侵入活体成像12。体外等效物的渗透性测试通常测量在跨孔***中穿过2D EC单层(在没有支持壁细胞的存在下)的跨内皮抗性13。或者，可以使用荧光/放射性同位素标记的化学物质的渗透来评估化学物质穿过内皮单层的移动。
10.作为在3D血管化组织等效物内评估血管通道渗透性的概念证据，我们使用了反渗透原理。反渗透的原理是成熟的微血管对大于65kDa分子量的葡聚糖不透过，示踪剂能够进入漏血管通道的腔内，而不能进入具有成熟的感受态细胞-细胞内皮细胞接合的血管通道内部。当暴露于多种化合物(例如组胺、***素E2、2-磷酸鸟苷和环状肾上腺髓质素)时，对大分子的内皮渗透性显著增加。我们采用反渗透法来在hESC来源的体外3D血管化组织等效物内评估微血管网络的屏障特性。使用与德克萨斯红(70kDa)缀合的葡聚糖作为示踪染料以评估微血管的渗透性。
在与示踪染料孵育后的3D构建体的共焦成像揭示了大部分微血管对染料是不透过的，如通过红色示踪染料限制于血管外空间(血管外侧)所证明的(图10a至图10c)。在另一方面，构建体与组胺的预孵育导致微血管通道的渗透性显著增加，如通过血管腔内存在的示踪染料的聚集体所证明的(图10d至图10f)。微血管通道对示踪染料的不渗透性和响应生理刺激(例如组胺)的泄漏增加也揭示了3D体外血管化组织等效物的成熟和功能。
综上所述，这些发现建立了3D体外血管化组织等效物作为用于定性评估血管渗透性的体外模型的用途，并且可以潜在地用作用于高通量筛选血管药物的组织微血管***的生理学3D模型。
结论
综上所述，使用从单一来源(hESC)分化的四种不同细胞类型在PEG-纤维蛋白胶内的共培养，我们已经证明了制造3D体外血管化皮肤和黏膜等效物的能力。我们第一个开发出了hESC来源的3D体外血管化皮肤和黏膜等效物。其次，我们第一个证明了培养用于产生3D体外血管化皮肤和黏膜等效物所需的四种不同的细胞类型的能力。此外，我们已经将我们的模型与基于原代细胞系的模型比较，其证明了基于hESC的3D组织等效物更可靠并且提供可接受的组织生理学。我们坚信，这项技术可以用原代细胞、人成体干细胞和诱导多能干细胞进行模拟。
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Claims (31)

1.制备器官型血管化组织、皮肤或黏膜等效物或组合物的方法，其包括以下步骤：
i)获得哺乳动物多能干细胞的制备物，并在细胞培养条件下培养所述细胞以诱导形成以下分化细胞类型：内皮细胞(SC-EC)、血管平滑肌细胞/周细胞(SC-vSMC)、成纤维细胞(SC-Fib)和角质化细胞(SC-KC)；
ii)将部分i)中的所述SC-EC、SC-vSMC和任选地SC-Fib接种在支架中或支架上，并在细胞培养条件下进一步培养所述细胞以诱导形成血管化真皮层；以及
iii)将部分i)中的所述SC-KC接种到部分ii)中的所述血管化真皮层上，并在细胞培养条件下进一步培养所述细胞以诱导在所述血管化真皮层上形成角质化表皮复层，以提供器官型血管化皮肤或黏膜等效物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物多能干细胞是人的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述哺乳动物多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)或人胚胎生殖细胞(hEGC)或人诱导多能干细胞(hiPSC)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述细胞培养条件包含另外的细胞类型，例如但不限于黑素细胞或巨噬细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述另外的细胞类型来源于人胚胎干细胞(hESC)、人胚胎生殖细胞(hEGC)或人诱导多能干细胞(hiPSC)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物内皮细胞(SC-EC)、血管平滑肌细胞(SC-vSMC)、成纤维细胞(SC-Fib)和角质化细胞(SC-KC)是自体的。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物内皮细胞(SC-EC)、血管平滑肌细胞(SC-vSMC)、成纤维细胞(SC-Fib)和角质化细胞(SC-KC)是同种异体的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括在进行步骤iii)之前，培养步骤ii)中的所述细胞至少1至20天，包括之间的所有一天间隔。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述支架包含基于天然或杂化聚合物的支架，例如但不限于聚乙二醇-纤维蛋白、纤维蛋白、1型胶原蛋白、透明质酸凝胶支架等。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述支架包含基于生物相容性聚合物的支架，例如但不限于聚酯，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚-dl-乳酸-乙醇酸共聚物等。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述hESC-EC、hESC-vSMC和hESC-Fib以约10∶1∶1至约40∶1∶1的比例设置在所述支架中。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在气-液界面处培养所述哺乳动物角质化细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述角质化细胞以约10×104至约40×104细胞/cm2的接种密度接种在所述血管化真皮层的顶部。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对于产生体外血管化皮肤等效物，所述角质化细胞是hESC-KC，或对于产生体外血管化黏膜等效物，所述角质化细胞是hESC-口腔KC。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养条件包含无血清培养基。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将通过步骤i)至iii)制备的所述器官型血管化组织、皮肤或黏膜等效物维持在细胞培养物中。
17.经分离的分化哺乳动物内皮细胞(hESC-EC)、血管平滑肌细胞/周细胞(hESC-vSMC)、成纤维细胞(hESC-Fib)或角质化细胞(hESC-KC)，其是通过根据权利要求1至3和5至7中任一项所述的方法获得或可获得的。
18.器官型血管化组织、皮肤或黏膜等效物或组合物，其是通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法获得或可获得的。
19.治疗性组织/皮肤移植物或植入物，其包含通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法获得或可获得的器官型组织或皮肤组合物。
20.根据权利要求19所述的治疗性组织/皮肤移植物或植入物，其用于治疗皮肤损伤。
21.根据权利要求20所述的治疗性组织/皮肤移植物或植入物，其用于治疗由以下造成的皮肤损伤：感染或创伤，包括伤口、瘢痕形成或烧伤；或者响应于疾病，例如在癌症中或者在治疗糖尿病性或非糖尿病性溃疡中由于移除组织而需要的皮肤移植物。
22.美容性组织/皮肤移植物或植入物，其包含通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法获得或可获得的器官型皮肤组合物。
23.治疗方法，其包括将根据权利要求19或20或21所述的组织/皮肤移植物或植入物施用或植入在哺乳动物的待治疗部位处或部位之中。
24.美容外科手术方法，其包括将根据权利要求22所述的组织/皮肤移植物或植入物植入在哺乳动物的待治疗部位处或部位之中。
25.细胞培养物容器，其包含有根据权利要求18所述的器官型组织、皮肤或黏膜等效物或组合物。
26.根据权利要求25所述的细胞培养物容器，其中所述细胞培养物容器包含有任选可移除的细胞培养物***物，其包含与细胞培养基流体接触的所述器官型组织、皮肤或黏膜等效物。
27.根据权利要求18所述的器官型血管化组织、皮肤或黏膜等效物或组合物，其用于对测试剂的测试，所述测试剂例如但不限于治疗剂、美容剂、化合物或生物活性异生物质剂。
28.细胞阵列，其中所述阵列包含多个根据权利要求25或26中任一项所述的细胞培养物容器。
29.用于高通量筛选测试剂的方法，其包括以下步骤：
i)提供根据权利要求28所述的阵列；
ii)使所述阵列与多种待测试的试剂接触；
iii)整理在上述(ii)后获得的活性数据；
iv)将所整理的数据转换成数据可分析形式；以及任选地
v)提供所分析数据的输出。
30.制备器官型组织、皮肤或黏膜等效物或组合物的方法，其包括以下步骤：
i)将内皮细胞和血管平滑肌细胞以及任选地成纤维细胞接种在支架中或支架上以提供血管化真皮层；以及
ii)将角质化细胞接种在部分i)中的所述血管化真皮层上，并在细胞培养条件下进一步培养所述细胞以诱导在所述血管化真皮层上形成角质化表皮复层，以提供器官型组织、皮肤或黏膜等效物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中将通过步骤i)至ii)制备的所述器官型组织、皮肤或黏膜等效物维持在细胞培养物中。
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