CN109776550B - 一种海洋真菌来源的生物碱化合物及其在制备食品防腐剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品防腐和抗菌领域，公开了一种海洋真菌来源的生物碱化合物及其制备方法和在制备食品防腐剂中的应用。生物碱化合物的结构式如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示。该类化合物具有显著抑菌的活性，可用于制备食品防腐剂。因此，本发明提供的生物碱化合物具有防腐的食品应用前景。

Description

一种海洋真菌来源的生物碱化合物及其在制备食品防腐剂中 的应用

技术领域

本发明属于食品防腐和抗菌领域，特别涉及一种海洋真菌来源的生物碱化合物及其在制备食品防腐剂中的应用。

背景技术

食品腐败变质主要是指以微生物为主的作用导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化。食品本身含有的丰富的营养成分最易使微生物滋生且大量繁殖,并最终导致食品的腐败变质。因此人们尝试用各种方法去阻止食品腐败,如低温保存、隔绝空气、干燥、使用防腐剂等,其中最为普遍和有效的方法就是添加防腐剂来抑制或杀灭微生物,从而达到防腐的目的。常用的防腐措施是添加食品防腐剂,食品防腐剂分为化学防腐剂、天然防腐剂和复合型防腐剂,其中化学防腐剂的抑菌效果好、性能稳定、价格低廉等原因，使用最为广泛。

国际上开发新型的食品化学防腐剂，其防腐剂的效果研究多集中于其抑菌作用。随着国民经济的迅猛发展和人民生活水平的不断提高，食品添加剂更趋向于开发新型的抗菌性强、安全性能高、价格便宜的防腐剂就成了必然的趋势。本发明通过微生物发酵法产生的防腐剂原料，进一步以人工修饰的方式获得新型食品防腐剂，通过抑菌实验结果显示，与食品有关的多种革兰阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，抑制微生物的生长非常迅速，人、畜食后无毒副作用，并且在酸性条件下活性很强，适于大多数酸性食品，尤其是饮料的防腐，有良好的溶解性和稳定性。而新型防腐剂大多来源于天然产物，或是防腐剂先导化合物的重要来源。海洋真菌代谢产物来源的天然产物，具有可持续性，对环境友好，代谢产物丰富多样等特点，是新型有机分子或防腐小分子的新型源头。真菌的代谢产物具有广泛的生理活性，如抗菌，抗肿瘤，免疫调节，抗炎，酶抑制等多种活性。从中发现的新型具有抑菌活性的代谢产物为开发海洋来源的食品防腐剂和应用具有重要的现实意义。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种海洋真菌来源的生物碱化合物。

本发明的另一目的在于提供一种上述海洋真菌来源的生物碱化合物的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种海洋真菌来源的生物碱化合物，所述生物碱化合物的结构式如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示：

所述生物碱化合物是从海洋真菌Penicillium sp.JX-2-1的发酵液中分离获得的；海洋真菌Penicillium sp.JX-2-1于2019年1月10日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：60525。

上述的一种海洋真菌来源的生物碱化合物的制备方法，包括如下操作步骤：

S1.将海洋真菌Penicillium sp.JX-2-1接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；

S2.将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养，获得发酵产物；

S3.将发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇提取三次，浓缩提取液得到浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取得粗提物，将乙酸乙酯粗提物用硅胶正相色谱层析进行分离；用石油醚/乙酸乙酯进行洗脱，收集10％～30％乙酸乙酯/石油醚馏分，再采用柱层析分离技术，得到结构式如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的生物碱化合物。

优选地，S1所述种子培养液平均每升包括以下组分：葡萄糖30克，酵母提取物1克，蛋白胨2-5克，琼脂1-3克，氯化钠1-5克，水1L。

优选地，S1所述摇床培养的条件为摇床转速80～150rpm，25～30℃培养5～15天。

优选地，S2所述发酵培养基为固体大米发酵培养基，其组成为大米与海水按照1：1.2的体积比混合。

优选地，S2所述静置培养的条件为25～30℃静置25～50天。

优选地，S3所述柱层析分离技术硅胶柱层析、凝胶柱层析、C-18反相柱层析。

上述的一种海洋真菌来源的生物碱化合物在制备食品防腐剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供一类海洋真菌来源的生物碱化合物，该类化合物具有显著抑制抑菌活性，分别对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、大肠杆菌或沙门氏菌等有显著抑制活性，可用于制备防腐剂用于食品防腐。因此，本发明提供的生物碱化合物具有食品防腐的应用潜力。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1：真菌Penicillium sp.JX-2-1的分离与鉴定

1、材料：从广州市南沙区滨海公园采集的红树林秋茄叶子的内生真菌样品。

2、经过菌株的培养、分离、鉴定，获得纯红树林秋茄叶子的内生真菌菌株，经过鉴定为青霉真菌Penicillium sp.JX-2-1。青霉真菌Penicillium sp.JX-2-1于2019年1月10日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：60525，分类命名为Penicillium sp.。保藏单位的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2：生物碱化合物的制备

1、从青霉真菌Penicillium sp.JX-2-1代谢产物中分离制备生物碱化合物，步骤如下：

(1)青霉真菌Penicillium sp.JX-2-1的种子培养：

培养基组成按平均每升包括以下组分：葡萄糖30克，酵母提取物1克，蛋白胨2-5克，琼脂1-3克，氯化钠1-5克，水1L；

培养基制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30℃摇床培养3天，得种子培养液。

(2)青霉真菌Penicillium sp.JX-2-1的发酵培养：

固体大米发酵培养基配方为大米和海水按照体积比为1:1.2混合；

将种子液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，始终控制温度25～30℃，培养时间25～50天。

(3)将上述培养好真菌菌丝用甲醇提取三次，浓缩提取液，将获得的浓缩浸膏利用柱层析色谱分离；收集10～30％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，再以硅胶、凝胶、C-18反相等柱层析分离技术进行分离，得到生物碱化合物。

2、生物碱化合物的结构测试解析

对上述得到的生物碱化合物进行结构测试解析，得到以下试验数据：

生物碱化合物：C₁₈H₁₄N₂O₅；HRESIMS：338.0907[M+H]+(理论计算值338.0903)；m.p.174–175℃；一维核磁共振数据：¹HNMR(400MHz,CDCl3)及碳谱¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)如下表1。

经过鉴定，该化合物为生物碱化合物，其结构式如下所示：

表1抑菌活性生物碱核磁数据表

实施例3：生物碱化合物的抑菌实验

1、材料：

菌种：大肠杆菌标准株(ATCC29522)、金黄色葡萄球菌标准株(ATCC29213)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、白色假丝念珠球菌标准株(ATCC10231)；

阳性对照：环丙沙星(细菌对照物)和氟康唑(真菌对照物)；

溶剂配制：二甲基亚砜(dimethyl smLfoxide,DMSO)为溶剂(Sigma,St.Lo uis,Mo.)。

2、实验方法——测量最低抑菌浓度(MIC)

(1)细菌悬液的制备：

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌分别接种于肉汤和LB培养基中，37℃摇菌24h；

白色念珠菌挑取一个菌落，加入1mL沙保罗培养基，混匀后35℃摇菌24h～48h；***临用前挑取数个菌落用MH肉汤稀释，麦氏比浊仪(DENSIMAT,Bio-Merieux公司)调整试管内菌液浓度为0.5麦氏比浊度，相当于5×10^7,8集落形成数(CFU)/mL的含菌量，1:10稀释备用，10min内接种。

(2)采用二倍稀释法在96孔板进行药物体外抑菌活性定以无菌肉汤稀释样品及阳性对照药物至4倍最大期望最终检测浓度，加入检测孔中，然后对药物进行2倍系列稀释，并设有无药对照孔，将稀释好的菌液加入所有检测孔中以及无药对照孔中，每孔所含菌量约为5×10⁵cfu/孔。

3、实验结果

结果测得生物碱化合物的抑菌MIC₅₀值(g/mL)见表2。

表2生物碱化合物(I)的抑菌试验结果(MIC₅₀值g/mL)

表3生物碱化合物(II)的抑菌试验结果(MIC₅₀值g/mL)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种海洋真菌来源的生物碱化合物，其特征在于：所述生物碱化合物的结构式如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示：

2.根据权利要求1所述的一种海洋真菌来源的生物碱化合物在制备食品防腐剂中的应用。