CN114380764B - 一种噻唑啉铁载体类型化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噻唑啉铁载体类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC No:M2020953的放线菌通过发酵培养来获取噻唑啉铁载体化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，在此基础上将该粗浸膏经正相硅胶柱层析，反向中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该噻唑啉铁载体类具有抗金黄色葡萄球菌的作用，用于开发预防和治疗由金黄色葡萄球菌所引起的病害和感染的药物。

Description

一种噻唑啉铁载体类型化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种铁载体类化合物，尤其是涉及一种从海洋放线菌中提取的噻唑啉铁载体类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
铁是细菌生存的基本元素，在脊椎动物感染期间，当铁浓度较低时，铁限制了细菌的生长。在铁饥饿条件下，微生物通过上调相关酶的产生来生物合成和分泌铁载体，从而促进细胞从外部微环境中摄取铁。对Fe3+的高亲和力是铁载体的关键功能属性。此外，铁载体在维持病原菌的毒力方面也起着重要作用。一般来说，海洋微生物的生存需要微摩尔浓度的铁，然而，海洋中地表水的铁含量仅为0.01–2nM。因此，海洋微生物已经进化出从周围环境中吸收铁的策略，而铁累积最常见和有效的策略之一就是产生铁载体。
本发明人在对海洋放线菌Streptomyces diastaticus NBU2966在大米发酵下的乙酸乙酯提取物的化学调查中，发现了一个噻唑啉铁载体类型新天然产物，将其命名为thiazostatin C。此外通过抗菌活性的筛选，发现其具有一定程度的抗金黄色葡萄球菌生物活性，因此可用于防控和治疗由金黄色葡萄球菌所引起的感染和病害的抗菌先导药物的开发和利用。目前尚未见该化合物的化学结构及抗金黄色葡萄球菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对金黄色葡萄球菌具有抑制作用的噻唑啉铁载体类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种噻唑啉铁载体类化合物，该噻唑啉铁载体类化合物的结构式如(I)所示；
Figure GDA0003527541460000021
2、一种噻唑啉铁载体类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌(Streptomyces sp.4-7)在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，加入由体积比为1：1的乙酸乙酯和水组成的混合溶液重复萃取3次，合并三次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到9个组分；将收集的第7个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为20-100％的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到18个组分；将得到的第14个组分用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化，流动相为乙腈与水按体积比50:50的比例混合而成，分离纯化得到的化合物，其结构如(I)所示：
Figure GDA0003527541460000022
步骤(1)中所述的大米培养基的配制方法如下：将80g大米和4.2g海盐溶于120mL海水中配制而成。
步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0mL/min。
3、上述噻唑啉铁载体类化合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明分离出一种噻唑啉铁载体类化合物，通过微生物发酵培养来获取噻唑啉铁载体类的发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经正相中压硅胶柱层析，反相中压柱层析，及反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该化合物具有中等抗金黄色葡萄球菌活性，可用于抑制由金黄色葡萄球菌引起的相关病害的药物开发方面的用途。
上述海洋放线菌(Streptomyces sp.4-7)，该菌为NBU2966菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2020953，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种噻唑啉铁载体类化合物的结构式如(I)所示：
Figure GDA0003527541460000031
实施例2
如实施例1结构式(I)所示的噻唑啉铁载体类化合物的分离制备方法，具体包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌(Streptomyces sp.4-7)在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，加入由体积比为1：1的乙酸乙酯和水组成的混合溶液重复萃取3次，合并三次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到9个组分；将收集的第7个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为20-100％的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到18个组分；将得到的第14个组分用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化，流动相为乙腈与水按体积比50:50的比例混合而成，分离纯化得到的化合物，其结构如(I)所示：
Figure GDA0003527541460000041
本发明化合物Ⅰ为白色粉末，正离子模式下的高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出其准分子离子峰m/z 338.0997[M+H]+。结合13C NMR谱确定其分子式为C15H19N3O2S2，该化合物的1H和13C NMR谱数据见表1：
表1.化合物Ⅰ的1D NMR数据(DMSO-d6)
No. δH.multi.(J in Hz) δc，tYpe
1 - 115.7，C
2 - 158.3，C
3 6.96，d(8.1) 116.8，CH
4 7.43，t(7.7) 133.4，CH
5 6.95，t(7.7) 119.3，CH
6 7.41，d(8.0) 130.4，CH
2’ - 171.6，C
4’ 5.30，td(9.2，3.5) 78.0，CH
5’ 3.62，t(10.4)：3.50，t(10.4) <![CDATA[31.2，CH<sub>2</sub>]]>
2” 4.64，d(3.5) 72.8，CH
4” - 73.5，C
5” 3.04，d(10.5)；2.72，d(10.5) <![CDATA[40.2，CH<sub>2</sub>]]>
6” - 174.8，C
7” 2.34，s <![CDATA[34.9，CH<sub>3</sub>]]>
8” 1.26，s <![CDATA[13.1，CH<sub>3</sub>]]>
<![CDATA[NH<sub>3</sub>]]> 7.15，s -
<![CDATA[NH<sub>h</sub>]]> 7.27，s -
2-OH 1234，s -
注1：s-单重峰、d-二重峰、t-三重峰、m-多重峰。
注2：1H在600MHzNMR获得；13C在150MHzNMR获得。
实施例3
实施例1所述噻唑啉类化合物活性及应用
(1)实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物I纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测试抗菌活性。该实验使用的指示菌为金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)。
(2)实验方法
96孔板抗菌测试方法：在96孔板中，终体积为100μL/孔的Müeller-Hinton肉汤作为基本培养基，其中化合物的浓度为以二倍肉汤稀释法稀释至浓度256至1μg/mL，并以5×105CFU/mL的浊度添加细菌培养物。将板在37℃下孵育过夜，然后观察板，将肉眼不能观察到细菌的孔所对应的化合物浓度确定为该化合物的最低抑制浓度MIC。同时以庆大霉素作阳性对照。
(3)实验结果
在96孔板抗弧菌测试中，化合物Ⅰ对金黄色葡萄球菌的MIC被确定为64μg/ml。
Figure GDA0003527541460000061
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种噻唑啉铁载体类化合物，其特征在于该噻唑啉铁载体类化合物的结构式如(I)所示；
Figure FDA0004071305660000011
2.一种权利要求1所述的噻唑啉铁载体类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌(Steptomyces sp.4-7)在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物，其中所述的大米培养基的配制方法如下：将80g大米和4.2g海盐溶于120mL海水中配制而成；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，加入由体积比为1：1的乙酸乙酯和水组成的混合溶液重复萃取3次，合并三次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到9个组分；将收集的第7个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为20-100％的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到18个组分；将得到的第14个组分用半制备反相高效液相色谱进行分离纯化，流动相为乙腈与水按体积比50:50的比例混合而成，分离纯化得到的化合物，其结构如(I)所示：
Figure FDA0004071305660000021
3.根据权利要求2所述的一种噻唑啉铁载体类化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的反相MPLC梯度洗脱中乙腈从20～100％，洗脱时间120min。
4.根据权利要求2所述的一种噻唑啉铁载体类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0mL/min。
5.一种权利要求1所述的噻唑啉铁载体类化合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂方面的用途。
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