CN108753829B - 骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其包括树形高分子骨架、骨靶向肽基团以及含萘酰亚胺功能基团，所述骨靶向肽基团和萘酰亚胺功能基团以共价键连接在树形高分子表面；所述树形高分子为聚酰胺‑胺树形高分子。本发明还提供所述基因转染载体的制备方法及树形高分子转基因载体作为核酸分子输送载体中的应用。本发明采用全新的修饰方法和功能基团修饰树形高分子，反应简单高效，产率高，在细胞转染过程中达到高效转染效果，而且具有较好的骨靶向性能。材料生产简易且成本低，转染过程细胞毒性较低，能有效且安全地将基因分子输送到细胞中，本发明的树形高分子转基因载体具有高效、低毒、价格低廉、合成简易的优点。

Description

骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备 方法及应用
技术领域
本发明属于高分子化学及生物材料技术领域，具体涉及一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用。
背景技术
基因治疗作为一种新型的治疗手段，已经在癌症、艾滋病、骨质疏松症等重大疾病的治疗中显示出巨大的应用潜力。但由于缺乏安全高效的靶向性基因载体，骨质疏松症等骨骼疾病的基因治疗还未见突破性进展。
基因治疗是指借助基因载体将外源正常的基因导入靶细胞，用于纠正或者补偿因基因缺陷或者异常引起的疾病，从而达到治疗的目的。然而，裸露的DNA一般以舒展的线型螺旋形式存在，体积松散，并且DNA分子本身为带负电的阴离子，进入细胞时会与细胞膜外层的阴离子之间产生静电排斥作用。这些不利因素都使得DNA分子在不借助其它技术手段的情况下，无法独立穿过细胞膜，即使有少量的DNA能够进入细胞膜，进入细胞后也很容易被核酸酶所降解。因此，基因载体的开发在基因治疗的过程中起着至关重要的作用。
基因载体包括病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体是一种高效的转染试剂，能够高效地将外源的DNA或RNA转入细胞，但是它存在一些明显的缺陷，如免疫原性、致癌性，基因的大小容易受到病毒所容纳的大小限制、不能大量生产、同时存在变异的可能性，安全性差。因此，病毒载体在应用中受到了极大的限制。与病毒载体相比，结构易于修饰的非病毒载体完全克服病毒载体的上述缺点。非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子聚合物、金属纳米粒子以及多肽等。其中高分子聚合物具有安全性高、免疫性低、结构易于修饰以及转染效率高等特点，因此，近些年来高分子聚合物成为了具有良好应用前景的非病毒基因载体。
树形高分子是一类人工合成的具有树形扑拓结构的化合物，具有可控的分子量和尺寸，良好的单分散性，和表面易于多官能团修饰等特点。聚阳离子树形高分子(PAMAM)可以与DNA结合后形成纳米复合物，将DNA或 RNA转运至细胞内，而且在运输过程中还可以保护DNA或RNA免受核酸酶的降解。树形高分子内部存在大量的三级胺起到“质子海绵”的作用，可促进核酸复合物内涵体逃逸，并进入细胞质高效的转录、翻译以及表达等。但是，未经修饰的树形高分子细胞毒性大，而且转染效率低，极大的限制了树形高分子的应用。为了增加生物相容性，提高转染效率，各种各样的功能分子被应用于树枝状分子的表面修饰，如氨基酸，疏水烷基链、多肽、环糊精、聚乙二醇(PEG)以及壳聚糖等。其中，有许多修饰后的树枝状分子已经成为了商业化的转染试剂如PolyFect、SuperFect以及ProFect等。但是，目前的大部分树形高分子的修饰过程比较复杂、修饰后细胞毒性较大，转染效率并不理想，这些因素极大地限制了它们在基因治疗中的应用。因此，通过简单方法合成生物相容性好、转染效率高的转基因载体是解决这些问题的关键。此外，由于目前的大多数载体缺乏靶向基团，对细胞的选择性比较差且转染效率低。因此，开发低毒高效具有靶向基团修饰的非病毒基因载体具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种基于骨靶向肽和萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体以及制备方法。萘酰亚胺类化合物合成简单且具有良好的结构修饰多样性，具有大π键共轭体系的化学结构特征，是新型功能染料的中间体。
萘酰亚胺类化合物具备特殊的理化性质及光学性质，具备较强的DNA结合能力，良好的生物相容性、优良的体内体外成像性能等特点，在癌症诊疗以及基因治疗等领域中呈现出了广阔的应用前景。基于萘酰亚胺修饰的树形高分子合成工艺十分成熟，并且操作简单，合成速度快，产率高，无需繁琐的纯化步骤即可快速的获得高产率的转基因载体，为新型载体的设计开发提供了一种全新的思路。
骨靶向肽具有良好的亲骨性，生物相容性好，体内所引起的免疫原性较小，不会产生体内不良反应。其次，骨靶向肽分子内部之间以酰胺键作为连接键，性质稳定，而在体内水解体系能保证核酸分子的释放，从而达到基因治疗的作用。而且，寡肽的合成已经具备了非常成熟的方法，合成成本低，合成效率高。
因此，此类骨靶向肽和萘酰亚胺修饰的树形高分子载体具有细胞毒性低、转染效率高、合成方法简单、易于操作等优点，可以开发为一类新型的转基因材料并具有商业化的潜力。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明克服现有技术的树形高分子转基因材料的不足，创新地将骨靶向肽化合物和萘酰亚胺化合物同时与聚酰胺-胺树形高分子通过共价键连接合成转基因载体，用于安全、高效以及低毒的靶向性基因转染、本发明以骨靶向肽、萘酰亚胺化合物和树形高分子为原料，合成成本较低，材料易得，可获得反应高效、安全、合成步骤简单，获得细胞毒性低，同时具备高转染效率的骨靶向转基因载体。
本发明还有一个目的是提供骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的制备方法及应用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式 (I)如下：
Figure BDA0001697996130000031
式(I)中，R为树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺基团的数量，b为与树形高分子表面共价连接的骨靶向肽的数量。
优选的是，其中，R的结构式(II)如下：
Figure BDA0001697996130000041
式(II)中，M为乙二胺；n＝6；m＝2。
优选的是，其中，a＝1～128，b＝1～128。
本发明的目的还可以进一步由骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的制备方法来实现，该方法的合成路线如下：
Figure BDA0001697996130000042
其中，所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取树形高分子R与式2化合物，加入溶剂溶解，室温搅拌反应，反应结束后，减压浓缩，分离得到式3化合物；
步骤二、所述步骤一得到的式3化合物、式4化合物、催化剂、缩合剂与有机碱在有机溶剂中反应，反应结束后，冷分离得到式5化合物；
步骤三、将所述步骤二得到的式5化合物、对甲基苯酚、三氟乙酸和乙二硫醇在有机溶剂或水中反应，反应结束后，减压浓缩，分离得到骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体(I)。
优选的是，其中，在所述步骤一中，所述树形高分子R和式2化合物的物质的量的比为1:10，反应时间为8小时，溶剂为乙醇，分离具体为：采用乙醇和水为溶剂利用分子量为3500的层析袋层析。
优选的是，其中，在所述步骤二中，所述式3化合物与所述式4化合物摩尔比分别为1:20，1:40或1:60，反应时间为20小时。
优选的是，其中，在所述步骤二中，所述催化剂为1-羟基苯并***，所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸，所述有机碱为三乙胺。
优选的是，其中，在所述步骤三中，所述三氟乙酸、对甲基苯酚、乙二硫醇与水的质量比为92.5:2.5:2.5:2.5。
本发明的目的还可以进一步由骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体在作为核酸分子输送载体中的应用来实现。
优选的是，其中，核酸分子为miRNA。
本发明基于骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的树形高分子骨靶向转基因载体，萘酰亚胺化合物为式(Ia)所示4-氨基-1,8-萘酸酐化合物修饰的树形高分子转基因载体。骨靶向肽化合物为式(Ib)所示氨基、羧基和羟基被保护的丝氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-天冬氨酸五肽修饰的树形高分子转基因载体。
Figure BDA0001697996130000051
本发明基于骨靶向肽、萘酰亚胺化合物修饰的树形高分子转基因载体，包括树形高分子骨架、骨靶向肽以及萘酰亚胺化合物功能基团，所述骨靶向肽和萘酰亚胺化合物功能基团通过共价键连接在树形高分子表面。包括聚酰胺-胺树形高分子、骨靶向肽以及萘酰亚胺化合物修饰的功能基团，所述聚酰胺-胺树形高分子表面的伯胺基团与所述骨靶向肽、4-氨基-1,8-萘酸酐化合物通过酰胺化反应以酰胺键相连接。
本发明中，“萘酰亚胺化合物”是指4-氨基-1,8-萘酸酐，结构如(Ia) 所示，可以与树形高分子表面的氨基发生酰胺化反应。“骨靶向肽”是指序列为丝氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的五肽，结构如(Ib)所示，可以与树形高分子表面的氨基发生酰胺化反应。
本发明(I)式中，由聚酰胺-胺树形高分子和萘酰亚胺化合物、骨靶向肽化合物通过共价键连接，且在树形高分子表面进行修饰，合成一种新型的高分子骨靶向转基因载体，所述聚酰胺-胺树形高分子以乙二胺和丙烯酸甲酯作为单体合成树形高分子，该聚酰胺-胺树形高分子的末端为伯胺基团，n＝6， m＝2。
目前的树形高分子转基因载体合成工艺复杂，价格昂贵，细胞毒性大，靶向性差，而且转染效果不理想。本发明式(I)基于聚酰胺-胺的树形高分子载体经萘酰亚胺化合物和骨靶向肽修饰后，能够安全高效地将基因运输的细胞中，而且对骨组织具有好的靶向性。本材料具有合成周期短，制备方法简单，细胞毒性低以及转染效率高等优点。
本发明还提供了一种基于骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的聚酰胺-胺树形高分子基因载体及其复合物在体内体外作为核酸分子的运输载体的应用。所述核酸包括DNA和miRNA.
本发明还提供了一种复合物，其包含如式(I)所示骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的转基因载体以及核酸。
本发明还提供了一种利用式(I)所示骨靶向肽和萘酰亚胺修饰的树枝状分子转基因载体输送核酸的方法。即骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的树形高分子转基因载体与核酸在室温孵育后形成稳定的核酸复合物，再与细胞共孵育，完成基因转染过程。
本发明采用全新的修饰方法和功能单元修饰树形高分子，原料廉价易得，反应高效，产物易于纯化，转染过程中对细胞的毒性小，对骨组织靶向性好，能高效的进行基因转染，是兼具低廉、安全、高效、合成简单等优点的转基因载体。
以Antagomir-138-5p作为沉默miR-138-5p的沉默基因为例，利用本发明转基因载体运输miRNA，实验表明本发明具有以下优点：本发明中基因载体不仅具有良好生物相容性，而且具有高效的基因转染效率。通过基因转染实验发现，在优化的条件下对RNA的转染中，转染效率要高于商业化的转染试剂Lipofectamine2000。在细胞毒性实验中，本发明中的转基因载体细胞毒性低，在所测试的浓度下，细胞成活率大于95％，具有良好的生物相容性。本发明转基因载体，合成所需原料廉价易得，合成步骤简单，合成产品易于纯化。在细胞转染中，细胞毒性低，转染效率高，可作为一种兼具安全、高效、价格低廉等优点的转基因载体。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的制备骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的合成路线以及转基因载体的结构示意图；
图2为本发明其中一个实施例中制备化合物5-1的1H NMR图；
图3为本发明其中一个实施例中制备化合物5-2的1H NMR图；
图4为本发明其中一个实施例中制备化合物5-3的1H NMR图；
图5为本发明制备的转基因载体G5-1、G5-2和G5-3对羟基磷灰石的吸附结果示意图；
图6为本发明制备的转基因载体G5-1、G5-2和G5-3与RNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验结果示意图；
图7为本发明制备的转基因载体G5-1、G5-2和G5-3与RNA的复合物在E1细胞中的细胞毒性图；
图8是本发明制备的转基因载体与Antagomir-138-5p复合物在E1细胞中的转染效率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>
以骨靶向肽与萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体为例：如图1所示为本发明的制备骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的合成路线，
一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
Figure BDA0001697996130000081
式(I)中，R代表的G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000082
其中，a的理论预期为10，b的理论预期为20；
骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体材料，其合成路线如下：
Figure BDA0001697996130000091
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取50毫克树形高分子R与3.7毫克化合物2 4-氨基-1,8- 萘酸酐溶于5毫升乙醇中。将反应溶液加热到70度，搅拌8小时后，冷却至室温。再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料化合物3。本步骤中所用原料树形高分子与4-氨基-1,8-萘酸酐化合物摩尔之比为1:10。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面联接了8个萘酰亚胺基团，即式(3)中a为8；
Figure BDA0001697996130000092
其中，a的理论预期为10，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核 M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000093
步骤二、以摩尔比为1:20的比例制备活性官能团被保护的骨靶向树形高分子，所述步骤一得到的60毫克式3化合物、44毫克式4化合物、14毫克 1-羟基苯并***催化剂、20毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂与16毫克有机碱三乙胺，加入到10mL二甲基亚砜溶剂中溶解，室温反应8小时后，再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的化合物5-；
以1H NMR法表征检测上述产物：取10毫克上述步骤合成的转基因载体，溶于0.5毫升氘代二甲基亚砜中，将溶液进行核磁共振测试，根据1H NMR 谱图，如图2所示，计算树形高分子的修饰效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面联接了8个萘酰亚胺基团，19个官能团保护的骨靶向肽基团，即式(5-1)中a为8，b为19。
Figure BDA0001697996130000101
其中，a的理论预期为10，b的理论预期为20，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000102
步骤三、将所述步骤二得到的50毫克式5-1化合物加入到含有3.7克三氟乙酸、0.1克对甲基苯酚、0.1克乙二硫醇和0.1克水的混合溶液中，室温搅拌反应10小时后，再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于骨靶向肽和萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料化合物G5-1，结构如下式所示：
Figure BDA0001697996130000111
其中，a为8，b为19，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000112
<实例2>
一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
Figure BDA0001697996130000113
式(I)中，R代表的G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000114
其中，a的理论预期为10，b的理论预期为40；
骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体材料，其合成路线如下：
Figure BDA0001697996130000121
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取50毫克树形高分子R与3.7毫克化合物2 4-氨基-1,8- 萘酸酐溶于5毫升乙醇中。将反应溶液加热到70度，搅拌8小时后，冷却至室温。再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料化合物3。本步骤中所用原料树形高分子与4-氨基-1,8-萘酸酐化合物摩尔之比为1:10。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面联接了8个萘酰亚胺基团，即式(3)中a为8；
Figure BDA0001697996130000122
其中，a的理论预期为10，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核 M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000123
步骤二、以摩尔比为1:40的比例制备活性官能团被保护的骨靶向树形高分子。所述步骤一得到的60毫克式3化合物、88毫克式4化合物、28毫克 1-羟基苯并***催化剂、40毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂与32毫克有机碱三乙胺，加入到10mL二甲基亚砜溶剂中溶解，室温反应8小时后，再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的化合物5-2。
以1H NMR法表征检测上述产物：取10毫克上述步骤中中合成的转基因载体，溶于0.5毫升氘代二甲基亚砜中，将溶液进行核磁共振测试，根据1H NMR谱图，如图3所示，计算树形高分子的修饰效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面联接了8个萘酰亚胺基团，39个官能团保护的骨靶向肽基团，即式(5-2)中a为8，b为39。
Figure BDA0001697996130000131
其中，a的理论预期为10，b的理论预期为40，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000132
步骤三、将所述步骤二得到的50毫克式5-2化合物加入到含有3.7克三氟乙酸、0.1克对甲基苯酚、0.1克乙二硫醇和0.1克水的混合溶液中，室温搅拌反应10小时后，再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于骨靶向肽和萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料化合物G5-2，结构如下式所示：
Figure BDA0001697996130000141
其中，a为8，b为39，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000142
<实例3>
一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
Figure BDA0001697996130000143
式(I)中，R代表的G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000144
其中，a的理论预期为10，b的理论预期为80；
骨靶向肽和萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体材料，其合成路线如下：
Figure BDA0001697996130000151
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取50毫克树形高分子R与3.7毫克化合物2 4-氨基-1,8- 萘酸酐溶于5毫升乙醇中。将反应溶液加热到70度，搅拌8小时后，冷却至室温。再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料化合物3。本步骤中所用原料树形高分子与4-氨基-1,8-萘酸酐化合物摩尔之比为1:10。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面联接了8个萘酰亚胺基团，即式(3)中a为8；
Figure BDA0001697996130000152
其中，a的理论预期为10，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核 M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000153
步骤二、以摩尔比为1:80的比例制备活性官能团被保护的骨靶向树形高分子。所述步骤一得到的60毫克式3化合物、176毫克式4化合物、56毫克 1-羟基苯并***催化剂、80毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂与64毫克有机碱三乙胺，加入到10mL二甲基亚砜溶剂中溶解，室温反应8小时后，再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的化合物5-3。
以1H NMR法表征检测上述产物：取10毫克上述步骤中合成的转基因载体，溶于0.5毫升氘代二甲基亚砜中，将溶液进行核磁共振测试，根据1H NMR 谱图，如图4所示，计算树形高分子的修饰效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面联接了8个萘酰亚胺基团，59个官能团保护的骨靶向肽基团，即式(5-3)中a为8，b为59。
Figure BDA0001697996130000161
其中，a的理论预期为10，b的理论预期为80，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000162
步骤三、将所述步骤二得到的50毫克式5-3化合物加入到含有3.7克三氟乙酸、0.1克对甲基苯酚、0.1克乙二硫醇和0.1克水的混合溶液中，室温搅拌反应10小时后，再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于骨靶向肽和萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料化合物G5-3，结构如下式所示：
Figure BDA0001697996130000171
其中，a为8，b为59，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核M为乙二胺，末端伯胺基团为128，其结构式(II)所示：
Figure BDA0001697996130000172
<实例4>
对实施例1，2，3中制备得到的树形高分子转基因载体进行了如下方面的检测：
(1)转基因载体与RNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
转基因载体与RNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体和RNA，其中转基因载体G5-1 与RNA的质量比分别为0.1:1，0.2:1，1:1，5:1，G5-2与RNA的质量比分别为40:1，60:1，80:1，100:1，G5-3与RNA的质量比分别为40:1，60:1，80:1， 100:1，RNA的浓度为9μg/mL。然后，加入相应体积的超纯水，使反应液的最终体积保持在20μL，离心混合均匀。放入37℃恒温水浴中，保温0.5小时后，加入2μL的10×Loading Buffer上样缓冲液终止反应。其中，RNA为 miRNA，本文中提到的RNA均为miRNA。
复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
分别取上述制备的转基因载体与RNA复合物10μL加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳盖，电压100V条件下电泳30分钟后停止，取出凝胶在凝胶电泳成相***中曝光采样。
如图5所示，利用琼脂糖凝胶电泳实验，我们观察了转基因载体与RNA 的作用情况。转基因载体G5-1对RNA的凝聚效果最好，G5-1与RNA的质量比为5:1时，所有RNA都滞留在上样孔。随着转基因载体中骨靶向肽含量的增高，对RNA的凝聚效果逐渐降低。
(2)转基因载体对羟基磷灰石的吸附实验
将转基因载体G5-1、转基因载体G5-2和转基因载体G5-3配成浓度为30 μg/mL的超纯水溶液，用荧光分光光度计测定载体溶液的初始荧光值。然后取1.5mL载体溶液加入30mg羟基磷灰石，在室温避光条件下，缓慢磁力搅拌平衡2h后离心，取上清液用荧光分光光度计测定其荧光值(EX:447.0nm， EM:536.6nm)。以羟基磷灰石平衡2h后上清液荧光值与初始荧光值的比值，计算得出该载体对羟基磷灰石的吸附百分率。
如图6所示，吸附率(G5-1)＝△F/F0＝(732-89)/732＝88％，吸附率(G5-2) ＝△F/F0＝(604-420)/604＝30％，吸附率(G5-3)＝△F/F0＝(536-437)/536＝18％，转基因载体G5-1、转基因载体G5-2和转基因载体G5-3对羟基磷灰石的吸附百分率分别为88％、30％和18％。
(3)转基因载体细胞毒性实验
转基因载体与RNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体，其中转基因载体与RNA的质量比分别为1:1,5:1,10:1,20:1，RNA的浓度为9μg/mL，加入相应体积的α-MEM，使反应液的最终体积保持在500μL。放入37℃恒温水浴中，保温 1个小时。
细胞毒性实验
用胰酶消化收取对数生长期的E1细胞将大约每孔7000个细胞种入96 孔板中，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至 70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同浓度的转基因载体与RNA复合物100μL，每个浓度设置五个平行孔；采用不含转基因载体的DMEM培养基作为空白对照，采用商业化Lipofectamine 2000作为阳性对照，不含细胞只有α-MEM作为空白对照。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μL含10％胎牛血清的α-MEM，于培养箱中培养24小时后，向每孔加入10μL MTT溶液，4 小时后吸出所有加入液，生成的紫蓝色结晶用150μL二甲基亚砜溶解，于摇床上震荡10分钟后用酶标仪测定每一孔在490nm处的吸光度值。按如下公式计算细胞存活率(％)＝[A490test-空白]/[A490control-空白]×100。
如图7所示，经过在E1细胞中测定转基因载体的细胞毒性，发现转基因载体的细胞毒性都比较低。细胞的成活率基本都在95％以上，高于商业化的转基因载体Lipofectamine2000。
(4)转基因载体与Antagomir-138-5p的复合物体外转染实验
转基因载体与Antagomir-138-5p复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体G5-1、G5-2、G5-3与 Antagomir-138-5p，转基因载体G5-1与Antagomir-138-5p的质量比为10:1，转基因载体G5-2与Antagomir-138-5p的质量比为1:1，，转基因载体G5-3 与Antagomir-138-5p的质量比为1:1，Antagomir-138-5p的浓度为50nM，加入相应体积的α-MEM，使反应液的最终体积保持在1000μL，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温5分钟。
体外转染实验
用胰酶消化收取对数生长期的E1细胞将大约每孔2.0×105个细胞种入6 孔细胞培养板，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的转基因载体与Antagomir-138-5p复合物1000μL。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入2000μL含10％胎牛血清的α-MEM，于培养箱中培养48小时后，取出24孔板，用PBS洗液洗涤两次。加入200μL细胞裂解液，常温震荡15min，将充***解产物转入1.5mL EP 管，12000rpm离心30s，将离心好的上清液移入EP管，qPCR检测miR-138-5p 的表达量。
按照上述的方法制备转基因载体Lipofectamine2000与Antagomir-138-5 的复合物。
如图8所示，通过细胞转染实验可以得出：在E1细胞的转染中，转基因载体G5-1的转染效率要高于其它两个转基因载体的转染效率，同时，也好于商业化转染试剂lipofectamine 2000，能够使基因miR-138-5p沉默95％以上。
综上所述，本发明中的转基因载体细胞毒性较低，在RNA的转染中，都具有较高的转染效率，其制备方法简单、成熟、易于掌控。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
Figure FDA0001697996120000011
式(I)中，R为树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺基团的数量，b为与树形高分子表面共价连接的骨靶向肽的数量。
2.如权利要求1所述的骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其中，R的结构式(II)如下：
Figure FDA0001697996120000012
式(II)中，M为乙二胺；n＝6；m＝2。
3.如权利要求1所述的骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其中，a＝1～128，b＝1～128。
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的方法，其合成路线如下：
Figure FDA0001697996120000021
其中，所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取树形高分子R与式2化合物，加入溶剂溶解，室温搅拌反应，反应结束后，减压浓缩，分离得到式3化合物；
步骤二、所述步骤一得到的式3化合物、式4化合物、催化剂、缩合剂与有机碱在有机溶剂中反应，反应结束后，冷分离得到式5化合物；
步骤三、将所述步骤二得到的式5化合物、对甲基苯酚、三氟乙酸和乙二硫醇在有机溶剂或水中反应，反应结束后，减压浓缩，分离得到骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体(I)。
5.如权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤一中，所述树形高分子R和式2化合物的物质的量的比为1:10，反应时间为8小时，溶剂为乙醇，分离具体为：采用乙醇和水为溶剂利用分子量为3500的层析袋层析。
6.如权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤二中，所述式3化合物与所述式4化合物摩尔比分别为1:20，1:40或1:80，反应时间为20小时。
7.如权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤二中，所述催化剂为1-羟基苯并***，所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸，所述有机碱为三乙胺。
8.如权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤三中，所述三氟乙酸、对甲基苯酚、乙二硫醇与水的质量比为92.5:2.5:2.5:2.5。
9.如权利要求1～3中任一项所述的骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体在作为核酸分子输送载体中的应用。
10.如权利要求9所述的骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体在作为核酸分子输送载体中的应用，其中，核酸分子为miRNA。
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