CN109765375A - 三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线。本发明提供了可以同时检测三种真菌毒素的免疫层析试纸条，达到简单、快速、灵敏度高的现场检测的需求，为基层AFB₁、T‑2、DON三种真菌毒素快速检测和大量样品的筛查提供方法。

Description

三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸及制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫检测试纸条及制备方法，特别涉及一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸及制备方法。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxins)是真菌在生长过程中产生的低分子量的次级代谢产物，广泛存在于谷物和饲料中，严重影响人和动物的健康。真菌毒素主要损伤动物的免疫器官、中枢神经、肝、肾和生殖器官等内脏组织。另外，有些真菌毒素具有很强的致畸、致癌、致突变作用。目前己知的真菌毒素有300多种，对人和动物危害相对较严重的真菌毒素有黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、烟曲霉毒素(FUM)、赭曲霉毒素A(OTA)以及T-2毒素等。

黄曲霉毒素是迄今为止己知的毒性最强的有毒物质之一，在几种黄曲霉毒素中，毒性最强的是黄曲霉毒素B1(AFB1)，其毒性高于***10倍，属于特剧毒物质范畴。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)主要的毒性机理是通过与S60核糖体结合或抑制肽基转移酶的活性抑制真核细胞的蛋白合成，具有急性毒性，会导致动物体重减轻，免疫力低下，还具有“三致”作用，诱发肝脏癌变等危害。T-2毒素也属于镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素，主要Fusarium sporotrichioides,Fusarium poae,and Fusarium acuminatum等镰刀菌分泌产生，T-2急性毒性主要症状：呕吐、腹泻、低剂量的长期暴露引起炎症反应、免疫***紊乱、动物拒食、生长阻止、淋巴组织和肠道黏膜损伤，动物在采食这些饲料时可能会摄入多种真菌毒素，多种真菌毒素对动物健康和生产性能产生的副作用比单一毒素的危害大。

近年来，真菌毒素多重检测方法发展迅速，如利用稀土离子Eu³⁺和Sm³⁺作为示踪剂建立的时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，可实现对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的同时检测；采用液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)同时检测谷物中多种真菌毒素以及利用超高液相色谱(UPLC)同时检测咖啡豆中真菌毒素的混合污染等。这些方法特异性好，灵敏度较高，但操作复杂，耗时较长，无法满足大量样本的快速筛查。胶体金免疫层析技术由于具备快速、简便、低成本的特点，近年来发展迅速，主要包括竞争法和双抗体夹心法。真菌毒素属于小分子，多采用竞争反应模式，待检样本阴性时，检测线显色，待检样本阳性时，检测线不显色。由于胶体金颗粒制备简单且标记过程温和，以免疫层析为基础的多重检测模式目前已成为食品安全检测领域的研究热点。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种三联胶体金免疫层析检测法，在满足方便、快捷和低成本的同时，实现对谷物和饲料中上述三种真菌毒素的同时快速检测。

技术方案：本发明所述的一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线；所述第一检测线包含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；所述第二检测线包含有与第二抗体特异性结合的第二抗原；所述第三检测线包含有与第三抗体特异性结合的第三抗原。

优选地，所述第一抗体为AFB1单克隆抗体；所述第二抗体为T-2单克隆抗体，所述第三抗体为DON单克隆抗体。

优选地，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL^-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL^-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL^-1。

优选地，所述第一检测线、第二检测线及第三检测线之间间隔为2-3mm；所述第三检测线与控制线之间的间隔为4-5mm。

优选地，所述纳米金的粒径为20-40nm。

上述三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备标记垫：(1a)制备胶体纳米金溶液：将氯金酸溶液置于磁力搅拌加热器，加热至沸腾时，加入柠檬酸钠溶液，持续加热至溶液颜色均匀稳定，并继续煮沸5-10min，室温自然冷却，制备纳米金粒径在20-40nm；(1b)在胶体纳米金溶液中加入抗体，制备纳米金标记的第一抗体溶液、纳米金标记的第二抗体溶液以及纳米金标记的第三抗体溶液；(1c)将步骤(1b)中标记好的抗体溶液滴加至金标垫上烘干，制备第一金垫和第二金垫；

(2)制备基膜：用第一抗原-BSA溶液制备第一检测线、第二抗原-BSA溶液制备第二检测线、第三抗原-BSA制备第三检测线、羊抗鼠IgG溶液制备控制线；

(3)将步骤(1)制备的第一金垫和第二金垫贴合组成标记垫，随后，依次将吸水垫、基膜、标记垫和样品垫粘合在底板上，切成条状，得到三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸。

优选地，步骤(1b)中，所述第一抗体溶液中第一抗体的浓度为8-10μg·mL^-1、所述第二抗体溶液的浓度为8-10μg·mL^-1，所述第三抗体溶液的浓度为6-10μg·mL^-1。

优选地，步骤(2)中，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL^-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL^-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-0.1.2mg·mL^-1。

优选地，步骤(2)中，所述羊抗鼠IgG溶液的浓度为0.25-0.8mg·mL^-1。

优选地，步骤(2)中，所述第三检测线与控制线间隔为4-5mm。

有益效果：(1)本发明提供了可以同时检测三种真菌毒素的免疫层析试纸条，达到简单、快速、灵敏度高的现场检测的需求，为基层AFB₁、T-2、DON三种真菌毒素快速检测和大量样品的筛查提供方法；(2)本发明中标记垫包括第一金垫与第二金垫，检测灵敏度增加，同时，多层金垫在增加反应的同时，减缓流速，增加反应时间，提高试纸条的灵敏度。

附图说明

图1为本发明免疫层析试纸的结构示意图；

图2为本发明胶体金溶液紫外-可见光光谱扫描图；

图3为本发明胶体金透射电子显微镜成像图；

图4为本发明免疫层析纸条的灵敏度测试结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作出进一步说明。

本发明的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸结构如下：如图1所示，在底板1上按照样品流动方向依次连接样品垫2、标记垫3、由硝酸纤维素膜制备的基膜4以及吸水垫5；标记垫3由第一金垫31与第二金垫32组成，本发明的标记垫上共负载有三种利用纳米金标记的抗体，第一金垫含有纳米金标记的第一抗体，第二金垫含有纳米金标记的第二抗体，纳米金标记的第三抗体可位于第一金垫或第二金垫上，本实施例中的第一抗体为AFB1单克隆抗体；第二抗体为T-2单克隆抗体，第三抗体为DON单克隆抗体，第三抗***于第二金标垫上。

基膜4上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线41、第一检测线42、第二检测线43以及第三检测线44，第一检测线上含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；第二检测线含有与第二抗体特异性结合的第二抗原，第三检测线含有与第三抗体特异性结合的第三抗原，检测线上为羊抗鼠IgG溶液，第一检测线、第二检测线及第三检测线之间间隔为3mm，第三检测线与控制线间隔为4.5mm。

本发明的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸制备方法如下：

1、材料与仪器

1.1仪器材料

离心机、分光光度计、XYZ 3000金标点样仪、CM4000切条机(美国Bio-dot公司)；超纯水制备仪(美国的Millipore公司)；GT000632液相色谱仪(岛津科技有限公司，日本)；血浆混匀器、移液器。

1.2试剂

T-2毒素、呕吐毒素(DON)、AFB1毒素、T-2单克隆抗体、DON单克隆抗体、AFB1单克隆抗体(Sigma-Aldrich，美国)，羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗(南京凯默尔生物技术中心)、氯金酸(上海百灵威化学科技有限公司)，硼酸(南京昌吉生物技术有限公司)、柠檬酸三钠(南京基天生物技术有限公司)、超纯水、CN135硝酸纤维膜、吸水垫、金标垫和样品垫(上海杰宁生物)、PEG(20000)、PBS缓冲液(pH7.4，购于武汉谷歌生物科技有限公司)，乙腈与甲醇均为色谱级(Merck，德国)，氯化钠、K₂CO₃溶液、(购于北京索莱宝科技有限公司)。

2、三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备

2.1胶体金溶液的制备与鉴定

100mL 0.01％的氯金酸溶液置于磁力搅拌加热器，加热至沸腾时，迅速加入1％柠檬酸钠溶液2.5mL，分别制备粒径为20nm的胶体金溶液和40nm的胶体金溶液，持续加热至溶液颜色均匀稳定，并继续煮沸5min，室温自然冷却，超纯水补足体积到100mL。通过目测法和透射电镜扫描，鉴定所制备的胶体金颗粒，选用紫外分光光度计和电镜对制备的胶体金进行鉴定。选用纳米金平均粒径为20nm的样品作为后续实验，该样品的分光光度计和电镜结果如图2和图3所示，可见胶体金颗粒大小较为均匀。

2.2纳米金标抗体的制备

(1)纳米金标记抗体最佳pH的确定

在10个离心管中各加入实施例1制备的1mL的胶体金溶液后加入0、2、3、4、5、6、7、8、9μL 0.2mol·L^-1K₂CO₃，AFB₁mAb抗体稀释成1μg.μL^-1取20μL(20μg)加入到1-10支试管中，静置5min，室温在血液混匀器反应20min。每管各加30μL10％的NaCl溶液，震荡混匀，室温静止2h，肉眼观察溶液的颜色，没有蓝紫色沉淀、K₂CO₃溶液添加最少的试管胶体金对应的pH体系。标记T-2mAb、DON mAb反应的pH优化方法同AFB1 mAb，最终选用1mL的胶体金溶液中添加2μL 0.2M K₂CO₃溶液作为最佳pH，观察颜色为酒红色，离心胶体金似流沙不聚集。

(2)纳米金颗粒抗体标记量测定

最小标记量的确定：取2mL离心管10个，分别加入已用碳酸钾溶液调节至最佳pH的胶体金溶液1mL，依此向各管中加入不同量的纯化抗体1、5、10、15、20、25、30、35、40、0μg，轻轻混匀，室温反应30min后，在上述试管中加入0.1mL 10％的NaCl后，混匀静止2小时以上观察结果。未加抗体及加入抗体量不足的试管会出现红变蓝的聚沉现象，而加入抗体量达到或者超过最低稳定量的试管则胶体金的红色不变。其中含抗体最低的试管为每毫升胶体金稳定态的必须抗体量。在此基础上进行增加以达到实际需要，最终测定的三种真菌毒素抗体AFB₁mAb、DON mAb、T-2mAb最小稳定标记量分别为5μg·mL^-1、5μg·mL^-1、5μg·mL^-1。

最佳标记浓度确定：取1.5mL离心管9个，分别加入已用碳酸钾溶液调节至最佳pH的胶体金溶液1mL，依次向各管中加入不同量抗体溶液，至溶液中抗体终浓度略低、等于、高于抗体最小稳定标记浓度。1-7管中抗体终浓度分别为x-3μg、x-2μg、x-1μg、xμg、x+1μg、x+2μg、x+3μg抗体/mL纳米金溶液,x为最小标记量，第8-9支试管加入超纯水(对照组)。轻微晃动后放入血浆混匀器中反应20min，加入10％(m/v)BSA溶液50μL，放入血浆混匀器中反应20min，再加入5％PEG(20000)，搅拌17min后，4℃静止2h，将颜色没有发生变化、没有胶体金聚集的试管进行离心。将装有标记好的胶体金试管放入离心机中，11000r离心20min，将管中的上清用移液器缓慢吸取出并弃去，然后吸取500μL复溶液重悬得到浓缩的胶体金标记抗体溶液，4℃储藏。用移液器取10μL不同抗体浓度标记的金溶液，均匀的平铺在空白的金标垫上，15min观察颜色变化。选取颜色明显、抗体使用量最小的一组作为胶体金溶液抗体的标记用量，最终测定的三种真菌毒素抗体AFB₁mAb、DON mAb、T-2 mAb最佳标记浓度分别为8μg·mL^-1、8μg·mL^-1、6μg·mL^-1。

2.3检测线抗原和控制线二抗包被浓度的确定

将AFB₁-BSA按照0.2mg·mL^-1、0.4mg·mL^-1、0.6mg·mL^-1的浓度喷到硝酸纤维膜上作为检测线(T线)，DON-BSA和T-2–BSA分别按照0.4mg·mL^-1、0.8mg·mL^-1、1.2mg·mL^-1的浓度喷到硝酸纤维膜上作为检测线(T线)，干燥后，用标记好的抗体溶液滴加到空白试纸条金标垫上，烘干。加入100μL PBS后于10min后观察各试纸条的颜色。选择颜色明显、包被抗原浓度最低的浓度作为最佳T线浓度。

将羊抗鼠IgG选择0.3mg·mL^-1、0.6mg·mL^-1、0.8mg·mL^-1、1mg·mL^-1的浓度喷到硝酸纤维膜上作为控制线(C线)，干燥后，用标记好的抗体溶液滴加到空白试纸条金标垫上，烘干。加入100μL PBS后于10min后观察各试纸条的颜色。选择颜色明显、包被二抗浓度最低的浓度作为最佳C线浓度。

通过以上实验，AFB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA抗原包被量分别为0.4mg·mL^-1、0.4mg·mL^-1、0.8mg·mL^-1。最终确定三种毒素包被二抗的最终包被量为0.25mg·mL^-1。

2.4试纸条的制备

(1)基膜的制备：将上述优化好的检测线和控制线浓度，将AFB₁-BSA、T-2-BSA完全抗原用含有0.16％甘油，pH为5的磷酸盐缓冲溶液稀释到0.4mg·mL^-1，用pH为7.4的PBS缓冲溶液将DON-BSA稀释到0.8mg·mL^-1，将质控线抗体稀释到0.3mg·mL^-1。包被时按照从上到下的顺序将第一检测线AFB₁-BSA、第二检测线T-2-BSA、第三检测线DON-BSA依次包被在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane，NC)上作为检测线(T线)，控制线喷涂羊抗鼠IgG，控制线与第一检测线的间距为4.5mm，第一检测线、第二检测线与第三检测线之间间距为3mm，检测线和质控线的喷涂量为17μL/cm，完成后将膜放在65℃烘干箱烘干1h，干燥保存。

(2)标记垫的制备：制备含有1％PVPK30维酮、1％蔗糖、0.5％吐温-20、1％BSA的0.1mol.L^-1PBS的封闭液，将玻璃纤维膜浸润在封闭液后，放入37℃干燥箱烘干，将标记纳米金探针溶液(1:10稀释)均匀的浸润在3mm×420mm的8964玻璃纤维膜上，将制备好的单克隆抗体结合在玻璃纤维上，室温干燥，得到金标垫：具体为将T-2、DON标记的金溶液铺的玻璃纤维为第二金垫，AFB1胶体金溶液铺的玻璃纤维为第一金标垫。

(3)试纸条的组装：将样品垫、金标垫、基膜和吸水垫进行组装，在底板1上，按照样品流动方向依次连接的样品垫2、标记垫3、基膜4以及吸水垫5。标记垫3由第一金垫31与第二金垫32压合而成，标记垫大小为宽3mm，长4mm，基膜4上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线41、第一检测线42、第二检测线43以及第三检测线44，用斩切机切成4mm宽的免疫层析试纸条用以检测，完成后将膜放在65℃烘干箱烘干1h，得到本发明的试纸条。

AFB1、T-2、DON免疫层析试纸条采用竞争抑制法检测三种毒素，当检测样品中三种毒素的任意一种毒素的含量大于或等于检测线的下线时，金标垫上的mAb-胶体金就会与样品中的毒素结合，金标垫中的金标抗体结合位点被封闭，无法与检测线上的毒素-BSA结合，检测线不出现红色，故称为消线，检测样品为阳性。当样品中毒素含量低于检测下线时，金标抗体中抗原结合位点与检测线上的毒素-BSA发生特异性结合，检测线出现红色，样品为阴性。

2.5饲料提取液中甲醇的含量对试纸条的影响

在真菌毒素检测中，样品中真菌毒素的提取过程中常用到高浓度的甲醇、乙腈等有机溶剂，而免疫层析反应中抗体的活性会受到高浓度的有机溶剂的影响，从而造成试纸条检测线和质控线的呈色，因此，检测过程中，样品提取液需要经过适当的稀释以降低有机溶剂的浓度，在不影响抗体活性的前提下进行免疫层析分析。将胶体金试纸条***不同甲醇浓度的样品溶液中(0,10,20,30,40,50,60,70,80％)室温下15min后观察试纸条显色情况，选取试纸条反应正常可以耐受的甲醇浓度用于样品前处理，结果发现，当甲醇超过30％时T线和C线显色模糊，降低甲醇的含量可以优化免疫层析试纸条的显色效果，最终选定甲醇浓度20％为最适浓度。

2.6免疫层析试纸条性能检测

(1)灵敏度检测

将经高效液相检测过的DON、AFB1和T-2阴性样本烘干后，研磨过筛，分别按表1加入毒素标准品溶液并充分混匀后，室温放置过夜待检。

表1样本中毒素的添加量

制备饲料提取液：称取1g磨碎的样品到10mL离心管中，加入5mL 20％(v/v)甲醇水溶液，漩涡振荡5min后，将上清液过定量滤纸，取1mL过滤后上清溶液加入1mL 30mmol PBST缓冲溶液稀释，取该饲料提取液加入到试纸条样品垫上，测定消线浓度，结果表明，当饲料提取液中AFB₁、DON和T-2浓度分别为2、100、20ng/mL时，三条检测线颜色基本完全消失，即为试纸条对AFB₁、DON和T-2肉眼可见的消线浓度，对应的饲料中毒素消线浓度分别为AFB₁20μg.kg^-1、T-2 0.2mg.kg^-1、DON 1mg.kg^-1。

(2)免疫层析试纸条的准确性、重现性、稳定性、特异性的检测

特异性分析：用20％甲醇水溶液把毒素稀释成使T线消失的3倍浓度的单一毒素溶液，每支试管各取70μL加入样品垫。室温下15min后，观察显色结果。

结果表明：如图4所示，其中，(a)为阴性对照，(b)为含有毒素AFB₁的溶液的检测结果，(c)为含有毒素T-2的溶液的检测结果，(d)为含有毒素DON的溶液的检测结果，(e)为含有三种毒素的混合溶液的检测结果，从图中可以看出，三联试纸条检测单种真菌毒素溶液，由于竞争反应，对应检测线不显色，其他真菌毒素对应的检测线显色与阴性对照相当。加入三种真菌毒素混合溶液的试纸条由于三种真菌毒素均与对应的金标抗体发生竞争反应，使得抗体无法结合到检测线上，因此三条检测线均不显色。

稳定性、重现性及准确性测定：按照2.6第一部分测定的临界线浓度，分别设置三个定量浓度的真菌毒素混合溶液，第一个为AFB₁、T-2与DON的浓度低于临界线浓度，第二个为AFB₁、T-2与DON的浓度等于临界线浓度，第三个为AFB₁、T-2与DON的浓度高于临界线浓度，添加定量浓度的真菌毒素混合溶液到空白饲料样品提取液中，每个浓度设20个重复，观察并统计检测结果，以分析试纸条的准确性。在试纸条重现性分析中，对同一批次和批间的免疫层析试纸条观察10次重复测定的差异，比较分析测定结果的一致性。在稳定性评价中，对制备的同一批试纸条在37℃放置2周，其中每天取出试纸条，观察试纸条显色情况比较检测分析时的显色结果。

结果表明：真菌毒素添加浓度较试纸条检测限浓度低时，试纸条检测线与阴性对照显色相当；当真菌毒素浓度介于试纸条检测限和消线值之间时，试纸条检测线显色明显变浅；当真菌毒素浓度高于试纸条消线值时，检测线不显色。重复测定20次中有1次出现结果异常，未出现消线呈假阴性，准确率为95％。说明此免疫层析试纸条的准确性和重现性均较好。

37℃加速稳定试验中，产品在37℃放置1周等于常温放置6个月；37℃放置2周相当于常温放置12个月。实验中将包装好的试纸条置于37℃放置2周，其中每天取出试纸条，观察试纸条显色情况。10天后试纸条的检测线仍清晰，12-14天时试纸条检测线显色开始变浅，但是仍有明显的竞争抑制反应，因此试纸条的有效使用周期可以定为10个月以上。

2.7胶体金免疫层析试纸条与HPLC比较试

与HPLC检同时检测随机抽出的10份饲料样品，按照2.6部分制备饲料提取液，检测结果显示饲料提取液中AFB₁毒素超过2ng·mL^-1T线彻底消失，当略低于2ng·mL^-1时T线消失不彻底；T-2超过20ng·mL^-1T线彻底消失；DON超过100ng·mL^-1T线彻底消失，免疫层析试纸条的检测结果与液相检测结果相符率为100％。

Claims (10)

1.一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线；所述第一检测线包含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；所述第二检测线包含有与第二抗体特异性结合的第二抗原；所述第三检测线包含有与第三抗体特异性结合的第三抗原。

2.根据权利要求1所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一抗体为AFB1单克隆抗体；所述第二抗体为T-2单克隆抗体，所述第三抗体为DON单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL^-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL^-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL^-1。

4.根据权利要求1所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线、第二检测线及第三检测线之间间隔为2-3mm；所述第三检测线与控制线之间的间隔为4-5mm。

5.根据权利要求1所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述纳米金的粒径为20-40nm。

6.一种如权利要求1-5任一所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备标记垫：

(1a)制备胶体纳米金溶液：将氯金酸溶液置于磁力搅拌加热器，加热至沸腾时，加入柠檬酸钠溶液，持续加热至溶液颜色均匀稳定，并继续煮沸5-10min，室温自然冷却，制备纳米金粒径在20-40nm；

(1b)在胶体纳米金溶液中加入抗体，制备纳米金标记的第一抗体溶液、纳米金标记的第二抗体溶液以及纳米金标记的第三抗体溶液；

(1c)将步骤(1b)中标记好的抗体溶液滴加至金标垫上烘干，制备第一金垫和第二金垫；

(2)制备基膜：用第一抗原-BSA溶液制备第一检测线、第二抗原-BSA溶液制备第二检测线、第三抗原-BSA制备第三检测线、羊抗鼠IgG溶液制备控制线；

(3)将步骤(1)制备的第一金垫和第二金垫贴合组成标记垫，随后，依次将吸水垫、基膜、标记垫和样品垫粘合在底板上，切成条状，得到三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸。

7.根据权利要求6所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于步骤(1b)中，所述第一抗体溶液中第一抗体的浓度为8-10μg·mL^-1、所述第二抗体溶液的浓度为8-10μg·mL^-1，所述第三抗体溶液的浓度为6-10μg·mL^-1。

8.根据权利要求6所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL^-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL^-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-0.1.2mg·mL^-1。

9.根据权利要求6所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述羊抗鼠IgG溶液的浓度为0.25-0.8mg·mL^-1。

10.根据权利要求6所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述第三检测线与控制线间隔为4-5mm。