CN102323422A - 半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备 - Google Patents

半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备方法，试纸条包括底板、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样品垫和吸水垫。制备方法包括在底板上依次相互交错黏贴经预处理的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、经预处理的样品垫和吸水垫，即得同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条。本发明对两个丰度差异较大蛋白同时进行检测，为临床上心肌梗死的快速诊断提供了极大的便利，解决和弥补传统免疫试纸条技术灵敏度低，同时检测多蛋白时线性范围窄的缺陷；制备方法工艺简单，成本低，操作简便，具有良好的应用前景。

Description

半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备
技术领域
本发明属于cTnI和Myo的检测领域，特别涉及一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心血管***的急危重症，发病率高，预后较差，死亡率高。早期快速的诊断对于该病及时治疗及预后具有重大意义，是检验医学中一个重要的研究方向。在急性心肌梗死的早期诊断中，肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌血球素(myoglobin，Myo)的联合检测有着重要的诊断指导意义。cTnI是存在于心肌细胞肌丝中的一种心肌调节蛋白，它是AMI发生时较为特异的一种蛋白。它在正常人血液中含量很低，约为20.4pg/ml。在AMI发生2.2-6.8小时，它的浓度开始升高，大约在11.2小时达到峰值195.9ng/ml。Myo是目前公认的检测早期心肌损伤的较好的指标之一，广泛存在于心肌和骨骼肌的横纹肌中，它在正常人血液中含量小于50ng/ml，在AMI发病2-3小时后浓度开始升高，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。虽然不是心肌损伤特异的标志蛋白，但是近来的研究表明，在心肌梗死发生早期(5小时内)，它与cTnI联合检测使AMI诊断的灵敏度、特异性得到了最佳体现，明显优于肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、C反应蛋白(CRP)和脑钠尿多肽(BNP)等指标。
目前临床上检测血液中蛋白的方法主要有：放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA)，生化免疫分析法，酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫荧光法(immunofluorescence，IF)等。但这些方法都有一定的局限性：RIA的优点是结果精确，线性范围宽，缺陷是操作过程复杂，样品处理耗时，同时，放射性标记会对操作者造成伤害并对环境造成污染；生化免疫分析法虽已被广泛应用，但其检测灵敏度较差；ELISA则由于方法间差异较大，导致结果不均一，且线性范围较窄，此外，因为其操作复杂，不适于做单人份或少量标本的检测；IF中荧光强度随pH值和荧光燃料与抗体的比例而改变，难以定量反映抗原-抗体的结合。因此建立简单、特异、快速、便捷的多蛋白检测方法就显得尤为重要，这不仅能降低病人的诊断费用，更重要的是能够节省时间，从而尽快对病人开展治疗。
近年来，试纸条检测技术的发展为生化以及医学快速检测蛋白提供便捷的途径。然而临床医学中现有的试纸条法多采用单蛋白的检测方式，不仅增加检测成本，更浪费检测样品；同时，由于检测灵敏度低(通常为1ng/ml)，难以对疾病早期的一些微量蛋白标志物进行检测，也很难同时检测两种丰度差异较大的蛋白，从而最终延误治疗时间。目前，提高灵敏度不是通过对样品预先处理(延长检测时间)，就是使用荧光技术(需要额外荧光检测仪)来实现。生物素-链亲和素***(biotin-streptavidin system，BSS)是70年代后期开始广泛应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大***。由于它具有生物素与链亲和素之间高度亲和力及多级放大效应，并与胶体金、荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合于一体，使各种免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BSS已经广泛应用于生物医学实验和研究的各个领域，用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究。但目前在试纸条上的应用也是结合荧光技术，不仅增加了检测成本，还需要额外的荧光检测仪。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条对两个丰度差异较大蛋白同时进行检测，为临床上心肌梗死的快速诊断提供了极大的便利，解决和弥补传统免疫试纸条技术灵敏度低，同时检测多蛋白时线性范围窄的缺陷。
本发明的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样品垫和吸水垫，其特征在于：硝酸纤维素膜上预包被有心肌肌钙蛋白I cTnI包被抗体(检测线，T1)、肌血球素Myo包被抗体(检测线，T2)和羊抗鼠IgG(质控线，C1)，第一结合垫预包被有cTnI捕获抗体胶体金探针cTnI-AuNP和Myo捕获抗体纳米金探针Myo-AuNP，胶体金探针结合有生物素化的DNA，第二结合垫预包被有链亲和素纳米金探针SA-AuNP。
本发明的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，包括：
(1)将样品垫(SK06，金标公司)置于样品垫处理液中浸泡后干燥，即得经预处理的样品垫；
(2)将结合垫(VL68，金标公司)置于结合垫处理液中浸泡后干燥，再将体积比为1∶1的cTnI-AuNP和Myo-AuNP的溶液喷印于结合垫上，得第一结合垫；将SA-AuNP溶液喷印于结合垫上，得第二结合垫；
(3)使用PBS溶液，将cTnI包被抗体、Myo包被抗体和羊抗鼠IgG浓度调整为1mg/ml，然后分别将上述1mg/ml的物质喷印于硝酸纤维素膜(Hi-Flow Plus 180，Millipore)上，即得经预处理的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上的一侧依次相互交错黏贴经预处理的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、经预处理的样品垫，另一侧黏贴吸水垫(CH37K，金标公司)，即得同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条。
所述步骤(1)中的样品垫处理液为含质量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％Tween-20和0.05％叠氮钠的10mM PBS溶液。
所述步骤(2)中的结合垫处理液为质量百分比浓度为5％的蔗糖溶液。
所述步骤(1)和(2)中浸泡时间为30～60min，干燥温度为37～45℃，干燥时间为12～18小时。
所述步骤(2)中的cTnI-AuNP溶液由在直径13nm的纳米金溶液中加入cTnI捕获抗体和生物素化的单链DNA，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。
所述步骤(2)中的Myo-AuNP溶液由在直径41nm的纳米金溶液中加入Myo捕获抗体，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。
所述步骤(2)中的链亲和素纳米金探针溶液由在直径41nm的纳米金溶液中加入链亲和素，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。
所述Tris-HCl缓冲溶液含质量百分比5％的聚乙烯吡咯烷酮、1.25％的蔗糖、0.05％的聚乙二醇8000、0.2％的牛血清白蛋白和0.05％的Tween-20。
本发明所采用的cTnI和Myo包被和捕获抗体均为单克隆技术制备的抗体。利用抗原抗体结合原理，当待检样品中含有Myo抗原时，Myo抗原和Myo捕获抗体会发生结合，然后通过毛细管层析作用，向前移动到Myo包被抗***置，Myo抗原会再次和Myo包被抗体结合，以“三明治”形式形成双抗夹心复合物而聚集于T1线上显示红色条带，而未结合的Myo捕获抗体则会继续前行，到达质控线处，与羊抗鼠IgG结合，从而在C1处聚集显示红色条带。当待检样品中含有cTnI抗原时，cTnI抗原和cTnI捕获抗体会发生结合，然后通过毛细管层析作用，向前移动到相应的cTnI包被抗***置，cTnI抗原会再次和cTnI包被抗体结合，以“三明治”形式形成双抗夹心复合物而聚集于T2线上显示红色条带，而未结合的cTnI捕获抗体则会继续前行，到达质控线处，与羊抗鼠IgG结合，从而在C1处聚集显示红色条带。此外，移动相对缓慢的含有链亲和素的41nm胶体金会和T2线上含有生物素的13nm的胶体金再次以“三明治”形式结合，形成双三明治结构，从而增强了T2条带的显色。整个反应在20分钟内完成，15分钟后可上机读卡，T1，T2，C1处都会产生相应的颜色信号值，从而确定相应量读数。
有益效果
(1)本发明灵敏度高，心肌肌钙蛋白I灵敏度达到1.0pg/ml，肌血球素灵敏度达到1ng/ml，特异性好，只需手持式仪器，可即时得到检测结果，线性范围宽，操作简便，费用低廉，可以单人份进行检测，并可以大批量生产；对两个丰度差异较大蛋白同时进行检测，为临床上心肌梗死的快速诊断提供了极大的便利，并可扩展应用于临床医学中遗传病、传染性疾病、肿瘤和心血管疾病，以及兽医学，食品微生物检测等领域中丰度差异较大的两种蛋白的同时检测，解决和弥补传统免疫试纸条技术灵敏度低，同时检测多蛋白时线性范围窄的缺陷；
(2)本发明的制备方法工艺简单，成本低，操作简便，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明cTnI和Myo的免疫层析试纸条结构示意图；其中，1为底板，2为硝酸纤维素膜，3为第一结合垫，4为第二结合垫，5为样品垫，C1为质控线，T1为cTnI检测线，T2为Myo检测线，6为吸水垫；
图2为本发明cTnI和Myo的免疫层析试纸条中预包被的cTnI-AuNP，Myo-AuNP和streptavidin-AuNP探针示意图；其中，1为streptavidin-AuNP，2为cTnI-AuNP，3为Myo-AuNP，4为Myo包被抗体，5为cTnI包被抗体，6为羊抗鼠IgG。
图3为本发明cTnI和Myo的免疫层析试纸条发生反应后结合方式示意图；其中，1为streptavidin-AuNP，2为cTnI-AuNP，3为Myo-AuNP，4为Myo包被抗体，5为cTnI包被抗体，6为羊抗鼠IgG。
图4为实施例1制备的试纸条灵敏度测试图片；其中，A为从左至右，单用100pg/ml cTnI，单用100ng/ml Myo，使用10ng/ml C反应蛋白；B为固定1ng/ml Myo，从左至右，cTnI浓度分别为1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1000pg/ml和10000pg/ml；C为固定1pg/ml cTnI，从左至右，cTnI浓度分别为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml和10000ng/ml；
图5为实施例1制备的试纸条灵敏度测试的峰值曲线图；其中，(1)为上述B对应的峰值曲线图，(2)为上述C对应的峰值曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)将样品垫放于样品垫处理液中浸泡30min后，取出于37℃干燥箱中干燥12小时，然后加入干燥剂封存备用；样品垫处理液是含有1％BSA，0.05％Tween-20，0.05％叠氮钠的10mMPBS溶液。
2)使用10mM，pH 7.4PBS，分别将cTnI包被抗体，Myo包被抗体和羊抗鼠IgG抗体浓度调整到1mg/ml，将三者分别均匀的喷印于硝酸纤维素膜，然后于37℃干燥箱中干燥12小时，加入干燥剂封存备用。
3)采用直径13nm的纳米金溶液，使用0.2M K2CO3调整溶液的pH值至8.5，加入cTnI捕获抗体，使其终浓度调整为8μg/ml，室温静置30min，然后加入生物素化的单链DNA，使其终浓度为1μM，室温静置16h。接着加入终浓度为0.5％PEG 8000，充分混匀，室温静置15min，然后放入离心机中，以9000rpm，4℃，离心50min，小心弃上清，加入含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，混匀后，再次离心，此操作重复两次，最后保存于含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，4℃保存备用。
4)采用直径41nm的纳米金溶液，使用0.2M K2CO3调整溶液的pH值至8.5，加入Myo捕获抗体，使其终浓度为6μg/ml，室温静置30min，随后加入1/10体积含10％BSA的10mM，pH 7.4PBS溶液，室温静置10min后放入离心机中，以12000rpm，4℃，离心30min，小心弃上清，加入含有1％BSA的10mM pH 7.4PBS溶液，室温静置10min，然后放入离心机中，此操作重复两次，最后保存于含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，4℃保存备用。
5)采用直径41nm的纳米金溶液，使用0.2M K2CO3调整溶液的pH值至9.0，加入链亲和素，使其终浓度为8μg/ml，室温静置30min，加入1/10体积含10％BSA的10mM pH 7.4PBS溶液，室温静置10min，放入离心机中，以12000rpm，4℃，离心30min，小心弃上清，加入含有1％BSA的10mM pH 7.4的PBS溶液，室温静置10min，然后放入离心机中，以12000rpm，4℃，离心30min，此操作重复两次，最后保存于含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，4℃保存备用。
6)将结合垫放于结合垫处理液中浸泡30min后，取出于37℃干燥箱中干燥12小时；干燥后，将体积比为1∶1的cTnI-AuNP和Myo-AuNP溶液均匀喷印于结合垫上，37℃干燥箱中干燥12小时，加入干燥剂封存备用。所述结合垫处理液为5％蔗糖溶液。
7)试纸条的组装和切割
下述操作都必须在湿度小于20％，温度25℃的环境中完成。
试纸板的组装：底板上依次相互交错2mm的黏贴3cm硝酸纤维素膜、0.8cm第一结合垫、0.8cm第二结合垫、1.4cm样品垫和1.2cm吸水垫，硝酸纤维素膜上预包被有Myo包被抗体(检测线T1)、cTnI包被抗体(检测线T2)和羊抗鼠IgG(质控线)，组装成试纸板。
试纸条的裁剪：使用切条机将组装好的试纸板切成0.3cm宽的试纸条。
8)检测结果判断
将试纸条放入150μl含cTnI和Myo蛋白的标准样品溶液中，15分钟后观察，判断试纸条
检测结果的标准为：
1.阳性：在检测线和质控线都有红色条带出现。
2.阴性：在检测线无红色条带出现，质控线有红色条带出现。
3.试纸条失败：在检测线和质控线均无红色条带出现。
9)试纸条灵敏度实验
单用cTnI蛋白进行10次重复检测，其灵敏度约为1pg/ml。单用Myo蛋白进行10次重复检测，其灵敏度约为1ng/ml。固定cTnI蛋白浓度为1pg/ml，Myo蛋白浓度分别为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml，另外一组实验，固定Myo蛋白浓度为1ng/ml，cTnI蛋白浓度分别为1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml和1000pg/ml，固定蛋白的灵敏度未见明显差异。见图4和图5。表明了该方法用于同时对cTnI和Myo半定量检测的可行性和准确性。
10)试纸条特异性实验
与心肌梗死其他标志物：C反应蛋白和脑钠尿多肽做交叉反应实验，交叉反应率＜0.01％。
11)样品检测实验分三组完成。
第一组，使用全血对10例心肌梗死病人的样品进行检测。cTnI和Myo阳性5例，Myo阳性3例，cTnI阳性1例，cTnI和Myo阴性1例。
第二组，使用血清检测相同10例样品，结果与全血检测一样。
第三组，使用血浆检测相同10例样品，结果与全血检测一样。
实施例2
1)将样品垫放于样品垫处理液中浸泡60min后，取出于45℃干燥箱中干燥18小时，然后加入干燥剂封存备用；所述样品垫处理液是含有1％BSA，0.05％Tween-20，0.05％叠氮钠的10mM PBS溶液。
2)使用10mM，pH 7.4PBS，分别将cTnI包被抗体，Myo包被抗体和羊抗鼠IgG抗体浓度调整到1mg/ml，将三者分别均匀的喷印于硝酸纤维素膜，然后于45℃干燥箱中干燥18小时，加入干燥剂封存备用。
3)采用直径13nm的纳米金溶液，使用0.2M K2CO3调整溶液的pH值至8.5，加入cTnI捕获抗体，使其终浓度调整为8μg/ml，室温静置30min，然后加入生物素化的单链DNA，使其终浓度为1μM，室温静置16h。接着加入终浓度为0.5％PEG 8000，充分混匀，室温静置15min，然后放入离心机中，以9000rpm，4℃，离心50min，小心弃上清，加入含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，混匀后，再次离心，此操作重复两次，最后保存于含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，4℃保存备用。
4)采用直径41nm的纳米金溶液，使用0.2M K2CO3调整溶液的pH值至8.5，加入Myo捕获抗体，使其终浓度为6μg/ml，室温静置30min，随后加入1/10体积含10％BSA的10mM，pH 7.4PBS溶液，室温静置10min后放入离心机中，以12000rpm，4℃，离心30min，小心弃上清，加入含有1％BSA的10mM pH 7.4PBS溶液，室温静置10min，然后放入离心机中，此操作重复两次，最后保存于含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，4℃保存备用。
5)采用直径41nm的纳米金溶液，使用0.2M K2CO3调整溶液的pH值至9.0，加入链亲和素，使其终浓度为8μg/ml，室温静置30min，加入1/10体积含10％BSA的10mM pH 7.4PBS溶液，室温静置10min，放入离心机中，以12000rpm，4℃，离心30min，小心弃上清，加入含有1％BSA的10mM pH 7.4的PBS溶液，室温静置10min，然后放入离心机中，以12000rpm，4℃，离心30min，此操作重复两次，最后保存于含有0.5％PVP，1.25％蔗糖，0.05％PEG 8000，0.2％BSA，0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液，4℃保存备用。
6)将结合垫放于结合垫处理液中浸泡60min后，取出于45℃干燥箱中干燥18小时；干燥后，将体积比为1∶1的cTnI-AuNP和Myo-AuNP溶液均匀喷印于结合垫上，37℃干燥箱中干燥12小时，加入干燥剂封存备用。所述结合垫处理液为5％蔗糖溶液。
7)试纸条的组装和切割
下述操作都必须在湿度小于20％，温度25℃的环境中完成。
试纸板的组装：底板上依次相互交错2mm的黏贴2.6cm硝酸纤维素膜、0.6cm第一结合垫、0.6cm第二结合垫、1.8cm样品垫和1.4cm吸水垫，硝酸纤维素膜上预包被有cTnI包被抗体(检测线T1)、Myo包被抗体(检测线T2)和羊抗鼠IgG(质控线)，组装成试纸板。
8)试纸条灵敏度实验
灵敏度实验分四组完成。第一组，单用cTnI蛋白进行10次重复检测，其灵敏度约为1pg/ml；第二组，单用Myo蛋白进行10次重复检测，其灵敏度约为1ng/ml；第三组，固定cTnI蛋白浓度为1pg/ml，Myo蛋白浓度分别为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml；最后一组，固定Myo蛋白浓度为1ng/ml，cTnI蛋白浓度分别为1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml和1000pg/ml，固定蛋白的灵敏度未见明显差异。表明了该方法用于同时对cTnI和Myo半定量检测的可行性和准确性。
9)试纸条特异性实验
与心肌梗死其他标志物：C反应蛋白和脑钠尿多肽做交叉反应实验，交叉反应率＜0.01％。

Claims (9)

1.一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样品垫和吸水垫，其特征在于：硝酸纤维素膜上预包被有心肌肌钙蛋白I cTnI包被抗体、肌血球素Myo包被抗体和羊抗鼠IgG，第一结合垫预包被有cTnI捕获抗体胶体金探针cTnI-AuNP和Myo捕获抗体纳米金探针Myo-AuNP，胶体金探针结合有生物素化的DNA，第二结合垫预包被有链亲和素纳米金探针SA-AuNP。
2.一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，包括：
(1)将样品垫置于样品垫处理液中浸泡后干燥，即得经预处理的样品垫；
(2)将结合垫置于结合垫处理液中浸泡后干燥，再将体积比为1∶1的cTnI-AuNP和Myo-AuNP的溶液喷印于结合垫上，得第一结合垫；将SA-AuNP溶液喷印于结合垫上，得第二结合垫；
(3)使用PBS溶液，将cTnI包被抗体、Myo包被抗体和羊抗鼠IgG浓度调整为1mg/ml，然后分别将上述1mg/ml的物质喷印于硝酸纤维素膜上，即得经预处理的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上的一侧依次相互交错黏贴经预处理的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、经预处理的样品垫，另一侧黏贴吸水垫，即得同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条。
3.根据权利要求2所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的样品垫处理液为含质量百分比1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20和0.05％叠氮钠的10mM PBS溶液。
4.根据权利要求2所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的结合垫处理液为质量百分比浓度为5％的蔗糖溶液。
5.根据权利要求2所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中浸泡时间为30～60min，干燥温度为37～45℃，干燥时间为12～18小时。
6.根据权利要求2所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的cTnI-AuNP溶液由在直径13nm的纳米金溶液中加入cTnI捕获抗体和生物素化的单链DNA，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。
7.根据权利要求2所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的Myo-AuNP溶液由在直径41nm的纳米金溶液中加入Myo捕获抗体，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。
8.根据权利要求2所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的链亲和素纳米金探针溶液由在直径41nm的纳米金溶液中加入链亲和素，并保存于Tris-HCl缓冲溶液制得。
9.根据权利要求6、7或8所述的一种半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲溶液含质量百分比5％的聚乙烯吡咯烷酮、1.25％的蔗糖、0.05％的聚乙二醇8000、0.2％的牛血清白蛋白和0.05％的Tween-20。
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