CN106084059B - 抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法 - Google Patents

抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法。抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：它是由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体。由其制备的餐厨废弃油脂免疫层析免疫试纸条可用于餐厨废弃油脂可以用于快速检测餐厨废弃油脂中辣椒素类物质的总量；检测灵敏度高，pH适应范围广；一步式操作，简单方便。不需要辣椒素类物质标准溶液作为阳性对照。

Description

抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免 疫层析快速鉴别方法
技术领域
本发明涉及抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法，属于免疫化学技术领域。
背景技术
地沟油是一个泛指概念，是对各类劣质油的统称，一般包括泔水油、煎炸废油、食品及相关企业产生的废弃油脂，而来自餐饮业的泔水油是地沟油的主要原料来源之一。在我国饮食文化中，含有辣椒素的辣椒是必不可少的佐料之一。辣椒素类化合物是存在于辣椒果实中的使其具有辛辣刺激的主要化学物质，目前已经探明结构的有二十多种。辣椒素类物质营养价值高，被广泛应用与食品加工领域。合成辣椒素也有与天然辣椒素类物质相似的结构，也具辛辣特征，是辣椒素类物质中的一员，主要用于工业领域，但因其制备成本低，一些不法分子将其替代天然辣椒素，应用于食品领域。辣椒素、二氢辣椒素以及合成辣椒素是辣椒素类物质中的主要成员。辣椒素类物质营养价值高，被广泛应用与食品加工领域。辣椒碱素类物质具有脂溶性强、稳定性好、沸点高等特点。目前的地沟油加工工艺很难完全去除具有这样特点的物质。多项研究表明，正常食用油基本不含辣椒碱，而接触过辣椒的餐厨废弃油脂难以避免地含有这类成分。因此辣椒碱类成分可作为鉴别餐厨废弃油脂的特征指标，通过检测辣椒素类物质的含量，即可判别食用植物油中是否被掺入餐厨废弃油脂。目前，检测食用植物油中辣椒素类物质的方法主要有高效液相色谱法、色谱-质谱联用等现代仪器检测方法，其灵敏度高、准确性好，但是仪器设备昂贵，对实验环境要求高，且要求专业操作人员，难以实现快速检测。近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法的缺点，并具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、适于现场批量检测等优点，被广泛应用于医学、农学等各个领域。
基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析技术由于其检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，近年来在真菌毒素、农药残留等微量残留物的定性、在线、快速检测上得到了广泛应用。然而，目前国内外还未有将该方法应用于餐厨废弃油脂辣椒素类物质的检测中。胶体金免疫层析技术的核心元件是特异性的抗体，而餐厨废弃油脂基质成分复杂，样品提取液的pH难以确定，通常会使特异性抗体活性降低，检测灵敏度降低。因此，迫切需要研制亲和力高、特异型好、且耐有机溶剂、pH适应范围广的抗辣椒素类物质特异性抗体，并利用该抗体建立胶体金免疫层析试纸条检测法，用于鉴别餐厨废弃油脂。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种抗辣椒素类物质特异性抗体、餐厨废弃油脂胶体金免疫层析试纸条、餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法。本发明提供的抗辣椒素类物质特异性抗体亲和力高、特异性好、且耐有机溶剂、pH适应范围广。用其制作的免疫层析试纸条用于餐厨废弃油脂中辣椒素类物质的检测，具有操作简单、成本低廉、灵敏度高、pH适应范围广的特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
提供辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物，其结构式如式Ⅰ所述：
提供上述辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的制备方法，包括以下具体步骤：以氢氧化钠中和香兰素胺盐酸盐中的盐酸，得到式Ⅲ化合物，然后与顺丁烯二酸酐反应，得到人工半抗原化合物，将辣椒素类物质人工半抗原通过N,N’-二环己基碳二亚胺DCC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或通过三正丁胺和氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白BSA进行偶联得到。
人工半抗原化合物的合成路线如下：
上述辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将摩尔比为1：(0.7～1.1)的香兰素胺盐酸盐和氢氧化钠溶于水中，室温搅拌10-30min，过滤后得到白色沉淀香兰素胺(式Ⅳ化合物)；
将彻底干燥的香兰素胺与顺丁烯二酸酐以摩尔比为1:0.8-1.2溶于三氯甲烷中，室温反应1-2h，过滤后即得辣椒素类物质人工半抗原。
(2)将辣椒素类物质通用人工半抗原在N,N-二甲基甲酰胺中与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应30min-2h，然后加入二环己基碳二亚胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应4-6小时，静置过夜，取上清液即活化的辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素人工半抗原溶液，所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-1.2；
或将辣椒素类物质通用人工半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺中顺序加入三正丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应0.5-3h小时，所得反应液即活化的辣椒素类物质人工半抗原溶液，所述三正丁胺和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1-1.2。
(3)将上述(1)所得活化的辣椒素类物质通用人工半抗原上清液滴加到载体蛋白浓度大于等于2mg/mL的载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，室温条件反应4-8h，其中：所述步骤(1)中的辣椒素类物质通用人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于10:1，然后透析得到辣椒素人工抗原。
按上述方案，所述的载体蛋白的磷酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解得到的。
按上述方案，所述的透析为用0.01M PBS缓冲液透析72h，期间，4-8h更换一次透析液。
抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其为由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体；
按上述方案，所述的免疫为采用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后间隔重复免疫动物，其中：初次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫用弗氏不完全佐剂，至抗血清效价达到10000以上，颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清纯化得到辣椒素类物质抗体。用本发明提供的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达320000，得到的抗体对辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素的半抑制浓度IC50在pH值为5.0-8.0的条件下，为0.27-0.41μg/mL。表明该抗体可以特异性与辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素反应，并可以作为辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素通用抗体，亲和力好，灵敏度高，稳定性好，包括耐受有机溶剂及盐离子浓度能力强、pH适用范围广。
按上述方案，所述式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的免疫用量以其中的OVA蛋白计为0.2-1.0mg；免疫层数为4-6次；首次免疫采用等体积的弗氏完全佐剂乳化免疫原，于兔皮下多点注射；首次免疫后间隔2-4周进行第二次免疫，第二次及以后的免疫间隔2-3周，由等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫原，于兔背部皮下多点注射。从第四次开始，每次免疫一周后6-10天内，兔耳缘静脉采血非竞争间接ELISA方法测定血清效价，效价达到10000后，即兔颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，得到辣椒素类物质抗体。
餐厨废弃油脂免疫层析试纸条(见图3)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的上述抗辣椒素类物质通用特异性抗体。
按上述方案，所述的吸水垫长10～15mm，宽3～4mm，检测垫长25～30mm，宽3～4mm；金标垫长6～9mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。
按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。
按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8～20mm，所述检测线与质控线的间距为5～10mm。
所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
按上述方案，所述检测垫检测线上每厘米所需要的包被抗原的包被量为0.1～0.6μg；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg。
按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm。
按上述方案，所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用特异性抗体的用量为0.40～0.98μg。
如上所述快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.17～1.0mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿8～20mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.17～1.0mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体的用量为0.4～0.98ng，然后真空冷冻干燥2～6小时，置干燥器中室温保存；
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得餐厨废弃油脂免疫层析试纸。
按上述方案，辣椒素类物质包被抗原((2Z)-4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸-OVA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；所述的兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
按上述方案，所述步骤(3)和步骤(4)中的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1～2g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
按上述方案，所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.5mL的0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.0mL的0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
按上述方案，所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法，步骤如下：取餐厨废弃油脂待测样品，提取其中的辣椒素类物质，将提取液干燥后加溶剂复溶，所述待测样品和复溶用溶剂的比例为20g：1ml，得到待测样品溶液，再该待测样品溶液(优选80-200μL)作为检测液逐滴加入到餐厨废弃油脂免疫层析试纸的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一餐厨废弃油脂免疫层析试纸的样品垫上，其作为对照试纸条，一段时间(10-20分钟)后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照：
检测结果：
(1)阴性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色与对照试纸条上检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素含量低于3ng/mL，结合确证性检测方法确定该样品是否是餐厨废弃油脂或掺有餐厨废弃油脂的油脂样品；含量低于3ng/mL，可判断待测样品是餐厨废弃油脂的可能性不大，需进一步用确证性检测方法进行确定；
(2)阳性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色比对照试纸条上检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素含量等于或高于3ng/mL，则可判定该样品为餐厨废弃油脂或掺有餐厨废弃油脂的油脂样品；
(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效；
该免疫层析试纸条在餐厨废弃油脂辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素检测中的工作原理：当待测样品溶液加入到试纸条下端的样品垫上时，待测样品溶液通过毛细作用沿试纸条向吸水垫方向移动，当其移动至金标垫时，纳米金标记的抗辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素通用多克隆抗体被溶解。当样品中含有辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素时，辣椒素类物质将和金标垫上的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着辣椒素类物质包被抗原的检测线时，抗原将和辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素竞争结合纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素通用多克隆抗体将越少，在检测线上形成的显色带颜色越浅。当检测线上的抗原所结合的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体少于一定的数量时，检测线处将不会有红色线条出现。无论样品中是否含有辣椒素类物质，未被检测线上的抗原截获的纳米金标记的抗辣椒素类物质抗体或纳米金标记的抗辣椒素类物质抗体与辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素的结合物将继续移动到质控线并与质控线上的兔抗鼠多克隆抗体结合并被富集显色。据此，分别将检测试纸条上辣椒素类物质包被抗原的检测线与对照试纸条上相应检测线颜色进行显色对照，可获得样品中辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素含量情况，从而判断油脂样品是否为餐厨废弃油脂。
按上述方案，所述的提取为向待测样品中加入体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在60～90℃下回流1小时，冷却得到提取液；所述的复溶用溶剂为10％甲醇-PBS。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过将辣椒素中香草基胺的酰胺基进行修饰提供的人工半抗原既最大程度保留了辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素的特征结构(辣椒素主要分子结构中的香草基胺和部分脂肪链基团)，并且半抗原连接臂处形成一个大的共轭结构，该结构可促使半抗原结构中电子发生流动，另外，其具有一定的刚性，由此可能都有利于半抗原中活性位点的暴露，进而和OVA进行偶联得到的抗原化合物由此即可作为抗原决定簇，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，获得的抗原化合物作免疫抗原可免疫获得亲和力高，灵敏度高，特异性强、并且耐有机溶剂及盐离子浓度、pH适应范围广的辣椒素抗体。
(2)本发明提供的餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法可以检测餐厨废弃油脂中辣椒素类物质的总量；检测灵敏度高，pH适应范围广。
(3)本发明提供的餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法操作简单：只需将餐厨废弃油脂样品处理后的检测溶液逐滴加到试纸条的样品垫上即可，一步式操作，简单方便。检测样品时不需要辣椒素类物质标准溶液作为阳性对照，只需要用空白样品作为阴性对照。且该方法的检测结果肉眼即可判读。
附图说明
图1为本发明合成的抗辣椒素类物质通用人工完全抗原紫外光谱图。
图2为本发明合成的抗辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原紫外光谱图。
图3为本发明提供的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条的结构示意图。1纸板；2吸水垫；5检测垫；6金标垫；7样品垫；3质控线；4检测线。
具体实施方式
下述实例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1辣椒素类物质人工半抗原的制备
(1)称取香兰素胺盐酸盐1g溶于11.77ml超纯水，剧烈搅拌下逐滴滴加2M的NaOH2.12ml，室温反应10min。过滤得白色沉淀，将白色沉淀彻底干燥后进行下步反应。
(2)称取称取上步产物60mg溶于30ml三氯甲烷(经无水硫酸钠脱水处理后)中，室温搅40min，加入40mg顺丁烯二酸酐，室温反应1h。过滤后所得沉淀即为辣椒素类物质人工半抗原(2Z)-4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸((2Z)-4-[(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-4-oxobut-2-enoic acid)。分子式为C12H13NO5。
实施例2辣椒素类物质人工完全抗原-免疫抗原的制备
称取上述辣椒素类物质人工半抗原20.8mg(约0.08mmol)和11.6mg(约0.1mmol)NHS于反应瓶中，加入400ulDMF溶解于反应瓶中，室温搅拌30min，称取20.6mg(约0.1mmol)DCC溶于50ulDMF中，将DCC/DMF溶液逐滴滴加至上述反应瓶，室温搅拌4h，4℃静置过夜。8000rpm/5min，取上清活泼酯液。
将上清活泼酯液，逐滴滴加到6ml 7mg/ml的BSA溶液中反应，反应缓冲液为0.2MpH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室内温度进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01MpH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-免疫抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图1，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
实施例3辣椒素类物质人工完全抗原-包被抗原的制备
称上述辣椒素类物质人工半抗原4.52mg溶于200uL无水DMF中,然后按顺序加入4.27μL三正丁胺、2.34μL氯甲酸异丁酯,室温下搅拌避光反应1h，得活化的辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素半抗原溶液。
将活化的辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素半抗原溶液逐滴滴加到10ml 4.5mg/ml的OVA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室内温度进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01M pH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-包被抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图2，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
实施例4：辣椒素类物质特异性抗体的制备
将上述制备好的抗辣椒素类物质人工完全抗原(免疫抗原)用来免疫3㎏以上的日本大耳兔。平均每次抗原用量约0.84mg(以蛋白质的量计)。首次免疫采用由等体积的弗氏完全佐剂乳化的免疫原，于兔皮下多点注射；首免后间隔3周、以后每隔2周用由等体积的弗氏不完全佐剂乳化的免疫原，于兔背部皮下多点注射。从第四次开始，每次免疫后一周，兔耳缘静脉采血非竞争间接ELISA方法测定血清效价。五免后，兔颈动脉采血至其死亡。采到的血液于37℃放置约1h，4℃过夜，离心，取上清，少量混等体积甘油-20℃暂时储存备用。其余抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，最后得冻干抗体，于-20℃储存备用。
实施例5：辣椒素类物质特异性抗体的测定
1)采用间接非竞争ELISA方法检测辣椒素类物质特异性抗体效价
包被：辣椒素类物质人工完全抗原-包被抗原用0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释到1μg/mL，100μl/孔，4℃反应过夜。倾去包被液，PBST满孔洗涤3次，扣干。
封闭：1％OVA PBST溶液，200μL/孔，37℃温育1h，PBST满孔洗涤3次，扣干。
抗体抗原特异性反应：将辣椒素类物质特异性抗体用0.01M PH7.4的磷酸缓冲液配制成1mg/mL的溶液，然后将抗体溶液从1:10000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，加入量为100μL/孔，设置阴性和空白对照孔，阴性对照血清稀释2 000倍，空白只加PBST，37℃温育1h，PBST满孔洗涤3次，扣干；
加二抗：用PBST溶液将羊抗鼠酶标二抗5000倍稀释，混匀，加入量为100μL/孔，37℃温育1h，PBST满孔洗涤6次，扣干。
显色：显色液(含1mg/mL四甲基联苯胺0.5mL、柠檬酸缓冲液9.5mL、1％的过氧化氢脲32μL)现配现用，100μL/孔，避光37℃温育15min。
终止：2mol/L的H2SO4，50μL/孔，立即用酶标仪测定450nm处吸光值即OD450值。
结果判读：以OD450值大于或等于1时所对应的抗体溶液的最高稀释倍数为抗体的ELISA效价，为320000。
2)采用间接竞争ELISA方法检测辣椒素类物质特异性抗体半抑制浓度
(1)用上述的间接ELISA方法确定抗体的工作浓度，以OD450为1左右时所对应的抗体浓度为最适工作浓度。
(2)包被、洗涤和封闭：方法操作同间接非竞争ELISA法。
(3)配制辣椒素标准溶液：将辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素用甲醇溶液配制成10mg/ml的母液(其中辣椒素类物质的比例为1:1:1)。加样前，采用10％的甲醇/PBS(0.01mol/L pH7.4)溶液从20μg/mL开始5倍稀释，共稀释5个浓度。每孔加入50μL倍比稀释的辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素标准溶液，然后每孔再加入50μL稀释倍数为160000的抗血清，37℃反应1h。
(4)加二抗、显色、终止和读数：方法操作同间接非竞争ELISA法。
(5)数据处理：以辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素各浓度的对数为横坐标，辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算50％抑制浓度为0.3μg/mL。
改变标准品稀释液中甲醇浓度，按上述方法检测后，绘制标准曲线，计算该抗体在甲醇浓度为10％，20％，40％条件下，50％抑制浓度分别0.31μg/mL、0.36μg/mL、0.34μg/mL。表明该抗体耐受有机溶剂能力强。
改变抗体稀释液的盐离子浓度值，按上述方法检测后，绘制标准曲线，计算该抗体在氯化钠浓度为0.01M，0.16M，0.32M，条件下，50％抑制浓度分别0.28μg/mL、0.33μg/mL、0.37μg/mL。表明该抗体可以耐较高受盐离子浓度。
改变标准品稀释液的pH值，按上述方法检测后，绘制标准曲线，计算该抗体在pH5.0/6.0/7.0/7.4/8.0条件下，50％抑制浓度分别0.41μg/mL、0.33μg/mL、0.29μg/mL、0.27μg/mL、0.28μg/mL。表明该抗体耐受pH值范围广。
实施例6：餐厨废弃油脂免疫层析试纸的制备方法，步骤如下：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长15mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原((2Z)-4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸-OVA)配制成浓度为0.4mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿9mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.24μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的包被抗原((2Z)-4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸-OVA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.5mg/mL的包被液，于距检测线10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.3μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述的硝酸纤维素膜长28mm，宽4mm
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体的用量为0.5μg，然后真空冷冻干燥6小时，置干燥器中室温保存；
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.5mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.0mL0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；
所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得餐厨废弃油脂免疫层析试纸。见图1。
上述胶体金免疫层析试纸条在快速鉴别餐厨废弃油脂中的应用
分别称取3个食用植物油盲样20g，PH值分别为5.3,5.8,6.4，编号为1,2,3。加入50ml体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入1ml 10％甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶液，再取200μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到快速鉴别餐厨废弃油脂胶体金免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇-PBS溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一快速鉴别餐厨废弃油脂胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，10分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照，读取结果：
检测结果：三个样品检测试纸条的质控线显示出红色条带，而检测线不显色，可判为阳性结果，表明辣椒素类物质的含量均高于3ng/ml，3个样品均为餐厨废弃油脂样品。经辣椒素免疫亲和柱-高效液相色谱-质谱联用法检测后，结果显示1,2,3号样品中辣椒素与二氢辣椒素总量分别为36，86，1213ng/mL，可判定为餐厨废弃油脂。该结果与本发明提供的餐厨废弃油脂胶体金免疫层析试纸条快速鉴别方法判定结果一致。
本发明中餐厨废弃油脂样品的鉴定标准主要是基于以下原因作出的：通对对大量实际样品(包括多个花生油，大豆油，葵花籽油，菜籽油及废弃油脂等样品)的辣椒素含量进行检测，检测方法：辣椒素免疫亲和柱液质法，结果如表1所示。结果表明：除花生油外的食用植物油中未见辣椒素类物质的检出，花生油中辣椒素类物质低于1.53ug/kg(1.53ng/ml),而废弃油(地沟油)中辣椒素类物质的含量高于12.27ug/kg(12.7ng/ml),由此将辣椒素类物质含量等于或大于3ng/ml作为鉴别样品为餐厨废弃油脂或掺有餐厨废弃油脂的油脂样品的筛查标准。
表1植物油中辣椒素类化合物含量
注：‘-’未检出。
实施例7：餐厨废弃油脂免疫层析试纸的制备方法，步骤如下：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长16mm，宽3.8mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原((2Z)-4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸-OVA)配制成浓度为0.2mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.12μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的包被抗原((2Z)-4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸-OVA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.2mg/mL的包被液，于距检测线8mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.12μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3.8mm
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长13mm，宽3.8mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3.8mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体的用量为0.6μg，然后真空冷冻干燥6小时，置干燥器中室温保存；
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.5mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.0mL0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；
所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得餐厨废弃油脂免疫层析试纸。见图1。
上述胶体金免疫层析试纸条在快速鉴别餐厨废弃油脂中的应用
称取收集的餐厨废弃油脂样品与未使用过的食用植物调和油样品各20g，PH值分别为5.4和7.2，分别加入50ml体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入1ml 10％甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶液，再取180μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇-PBS溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一餐厨废弃油脂免疫层析试纸的样品垫上，其作为对照试纸条，10分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照，读取结果：
检测结果：未使用过的食用植物调和油样品检测试纸条的质控线显示出红色条带，检测线均与空白对照试纸条的检测限颜色相近，则判为阴性结果，由此判定：未使用过的食用植物调和油样品中辣椒素类物质含量低于3ng/mL，表明该调和油未掺有或掺有极少量的餐厨废弃油脂样品。收集的餐厨废弃油脂样品检测试纸条的质控线显示出红色条带，而检测线不显色，则判为阳性结果，表明收集的餐厨废弃油脂样品中辣椒素类物质的含量超过3ng/mL。

Claims (10)

1.抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：它是由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体；
2.根据权利要求1所述的抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：所述的免疫为采用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后间隔重复免疫动物，其中：初次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫用弗氏不完全佐剂，至抗血清效价达到10000以上，颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清纯化得到辣椒素类物质抗体。
3.根据权利要求1所述的抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：所述式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的免疫用量以其中的BSA蛋白计为0.2-1.0mg；免疫次数为4-6次；首次免疫采用等体积的弗氏完全佐剂乳化免疫原，于兔皮下多点注射；首次免疫后间隔2-4周进行第二次免疫，第二次及以后的免疫间隔2-3周，由等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫原，于兔背部皮下多点注射，从第四次开始，每次免疫后6-10天内，兔耳缘静脉采血非竞争间接ELISA方法测定血清效价，效价达到10000后，即兔颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，得到辣椒素类物质抗体。
4.餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的权利要求1所述的抗辣椒素类物质通用特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长10～15mm，宽3～4mm，检测垫长25～30mm，宽3～4mm；金标垫长6～9mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；
所述的吸水垫为吸水纸。
6.根据权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8～20mm，所述检测线与质控线的间距为5～10mm；所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm。
7.根据权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
所述检测垫检测线上每厘米所需要的包被抗原的包被量为0.1～0.6μg；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg；
所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用特异性抗体的用量为0.40～0.98μg。
8.权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.17～1.0mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿8～20mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.17～1.0mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用多克隆抗体的用量为0.4～0.98μg，然后真空冷冻干燥2～6小时，置干燥器中室温保存；
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得餐厨废弃油脂免疫层析试纸。
9.餐厨废弃油脂免疫层析鉴别方法，其特征在于：步骤如下：取餐厨废弃油脂待测样品，提取其中的辣椒素类物质，将提取液干燥后加溶剂甲醇-PBS溶液复溶，所述待测样品和复溶用溶剂的比例为20g：1ml，得到待测样品溶液，再以待测样品溶液作为检测液逐滴加入到权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇-PBS溶液作为阴性对照液，逐滴加入另一权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，一段时间后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照：
检测结果：
(1)阴性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色与对照试纸条上检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素含量低于3ng/mL，结合确证性检测方法确定该样品是否是餐厨废弃油脂或掺有餐厨废弃油脂的油脂样品；含量低于3ng/mL，可判断待测样品是餐厨废弃油脂的可能性不大，需进一步用确证性检测方法进行确定；
(2)阳性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色比对照试纸条上检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中辣椒素、二氢辣椒素或合成辣椒素含量等于或高于3ng/mL，则可判定该样品为餐厨废弃油脂或掺有餐厨废弃油脂的油脂样品；
(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效。
10.根据权利要求9所述的餐厨废弃油脂免疫层析鉴别方法，其特征在于：
所述的提取方法为向待测样品中加入体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在60～90℃下回流1小时，冷却得到提取液；所述的复溶用溶剂为10％甲醇-PBS。
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