CN109762939A - 用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针,所述引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示,所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。本发明可对鳜鱼弹状病毒进行快速检测,可以做到对鳜鱼弹状病毒定量分析,而且可以简化操作程序、节约成本。本发明对鳜鱼弹状病毒临床诊断不仅切实可行,且具有快速、准确、特异的优点,满足了临床诊断的要求,为检测鳜鱼弹状病毒提供了便利条件。
Description
技术领域
本发明属于水产病害微生物检测技术领域,具体涉及用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒。
背景技术
鳜鱼是一种肉质优良的名优鱼类,味道鲜美,因其蛋白质含量高而深受欢迎。而鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)对鳜鱼危害很大,流行颇广,对鳜鱼养殖造成极大的影响,成为鳜鱼养殖的瓶颈之一。鳜鱼一旦感染SCRV,没有有效的治疗措施。因此,对SCRV的监测,尽早的发现病原是防治该病的有效方式之一。
SCRV由核蛋白基因(nucleoprotein,N)、磷酸化蛋白基因(phosphoprotein,P)、基质蛋白基因(matrix protein,M)、糖蛋白基因(glycoprotein,G)和RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNApolymerase protein,L)这五个主要基因构成。其中,N基因为一个保守基因,序列的保守性强。
虽然鳜鱼弹状病毒对鱼类养殖业的巨大危害,但目前还没有较有效的检测方法对SCRV进行定量检测。本发明针对SCRV的N基因的保守区设计引物,建立SCRV的荧光定量PCR(taqMan Real-time PCR)检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供了用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针,所述引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示,所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地,所述引物和探针在制备用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒中应用,每20μL反应体系具有以下浓度的组分:cDNA模板1μL、阳性标准品1μL、0.6μL 0.2-1.0μmol/L引物和0.2-1.0μmol/L探针、PCR预混液10μL,Premix ExTaq TM 10μL、ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5μL,余量为无菌蒸馏水;所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示,所述探针序列如SEQ ID NO:3所示,所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒的DNA质粒。
本发明还提供一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒,包括如权利要求1所述的引物和探针。
优选地,所述试剂盒中所述引物和探针的终浓度均为0.2~1.0μmol/L。
优选地,所述试剂盒中所述引物终浓度为0.3μmol/L,所述探针终浓度为0.3μmol/L。
优选地,所述的试剂盒还包括阳性标准品、PCR预混液和无菌蒸馏水,所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒N基因的DNA质粒。
本发明的有益效果在于:可对鳜鱼弹状病毒进行快速检测,可以做到对鳜鱼弹状病毒定量分析,而且可以简化操作程序、节约成本。本发明对鳜鱼弹状病毒临床诊断不仅切实可行,且具有快速、准确、特异的优点,满足了临床诊断的要求,为检测鳜鱼弹状病毒提供了便利条件。
附图说明
图1为重组质粒P-N的PCR扩增电泳图(M:Marker DL2000;1:N基因的ORF扩增产物;2:阴性对照);
图2为SCRV实时荧光顶定量PCR标准曲线图;
图3为SCRV实时荧光定量PCR灵敏度检测的扩增曲线图(从左到右依次为1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μL的标准品的扩增结果);
图4为SCRV常规PCR灵敏度检测的电泳图(M:Marker DL2000;1-8为质粒的浓度依次是1×109~1×102(拷贝/μL);9空白对照);
图5为SCRV实时定量PCR 40次重复实验结果的扩增曲线图;
图6为SCRV实时定量PCR特异性检测结果扩增曲线图(1为重组质粒;2为SCRV;3为ISKNV、SCRV、GCRV、KHV、SGIV、TiLV、NNV、SVCV)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点,下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
1、引物的设计
根据GenBank中SCRV的N蛋白基因序列,应用Primer5软件设计特异性引物和探针,第一对引物(SCRV-QY-N-F、SCRV-QY-N-R)用于扩增SCRV的N基因的ORF框,扩增产物长度为1290bp,用于构建重组质粒:P-N,为制作标准曲线提供模板;第二对引物(Rhabdovirus140-F、Rhabdovirus140-R)和探针(Rhabdovirus140 TAP)用于荧光定量PCR扩增,扩增产物长度为140bp。引物和探针由广州擎科生物科技有限公司合成,引物和探针序列如下:
Rhabdovirus140-F:5'-GACATGTTCTTCTACAGATTCAAC-3'(SEQ ID NO:1)
Rhabdovirus140-R:5'-CAATCCAGCACTCCACTG-3'(SEQ ID NO:2);
Rhabdovirus140-TAP:5'-AGGTTCAAAGACTGTGCAGCTCTGT-3'(SEQ ID NO:3);
SCRV-QY-N-F:5'-GTAGCTAGCGCCACCATGGAAAACCAAATCATCAAGAG-3'(SEQ ID NO:4)
SCRV-QY-N-R:5'-GTAGCGCCGCATTTCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC-3'(SEQ ID NO:5)。
2、阳性标准品的制备
用SCRV感染SCC,待细胞出现病变后收集细胞病毒材料,提取病毒总RNA,经DNaseI RNase-free(Fermentas)处理后,分别测量RNA样品在260和280nm波长下的吸光度值,计算RNA样品的浓度和纯度。利用PrimeScript TM RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒进行反转录得到cDNA。以获得的cDNA为模板,SCRV-QY-N-F、SCRV-QY-N-R为引物进行PCR扩增。反应参数为98℃预变性2min,98℃10s,60℃10s,72℃1min20s,共30个循环,最后72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物经胶回收纯化后与simpleblunt载体(TaKaRa)连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取质粒酶切及电泳检测正确后进行测序。测序正确的重组质粒经测定在260和280nm处的吸光度后,根据以下方法计算重组质粒的DNA拷贝数。质粒拷贝数(拷贝数/μL)=6.02×1023(拷贝数/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子量(g/mol)。
结果如图1所示,在电泳图上可看出获得1290bp左右的片段,将该片段连接到克隆载体,重组质粒提取后经分光光度计测定浓度为122μg/mL,PCR扩增、测序分析证实与预期***片段相同,表示成功构建了标准重组质粒。
3、荧光定量PCR的建立和条件优化
采用TaqMan探针技术,将上、下游引物、探针、Premix(TaKaRa)Ex Taq TM和ROXReferenceDyeⅡ(50×)加入到反应体系中,用7500型荧光定量PCR仪进行PCR扩增。对引物和探针浓度进行筛选,以获得最低的Ct值和最高的荧光强度增加值标准。选用0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0μmol/L的引物浓度和0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0μmol/L的探针浓度,筛选引物和探针的最佳浓度。
结果表明,重组质粒采用荧光定量PCR引物Rhabdovirus140-F、Rhabdovirus140-R进行普通PCR扩增后,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,在150bp左右有一条特异性条带,与预期片段长度(140bp)基本一致,表明该引物可用于荧光定量PCR反应。经过荧光定量PCR反应条件的优化,最终确定反应体系为:Premix ExTaq TM 10μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5μL,PCR Rhabdovirus140-F和Rhabdovirus140-R各0.6μL,终浓度均为0.3μmol/L,探针Rhabdovirus140-TAP为0.6μL,终浓度为0.3μmol/L,DNA模板1μL,dd H2O 6.7μL,总体系为20μL。采用2步法PCR扩增程序:预变性1个循环,95℃30s;PCR反应,40个循环,95℃5s,60℃34s。
4、构建标准曲线
将重组质粒进行10倍梯度稀释,使其浓度依次为1×109~1×102个/μL作为标准品模板,每个稀释度设3个平行。在荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析,以灭菌的ddH2O代替模板作为阴性对照。20μL体系:Premix(TaKaRa)Ex Taq TM 10μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5μL,PCR Rhabdovirus140-F和Rhabdovirus140-R各0.6μL,终浓度均为0.2μmol/L,Rhabdovirus140-TAP为0.6μL,终浓度为0.4μmol/L,标准质粒模板1μL,ddH2O 6.7μL。采用2步法PCR扩增程序:预变性1个循环,95℃30s;PCR反应,40个循环,95℃5s,60℃34s,反应结束后绘制标准曲线。
结果如图2所示,以10倍梯度稀释重组质粒后选取109~102个稀释度进行荧光定量PCR扩增,获得扩增曲线,以重组质粒拷贝数为X轴、Ct值为Y轴作图,得到一条标准曲线(Y=-3.163x+45.216),其相关系数为0.999,该实时荧光定量PCR在109~102范围内有较好的线性关系。
5、荧光定量PCR的敏感性和重复性检测
将重组质粒进行10倍梯度稀释,使其浓度依次为1×109~1×102个/μL作为标准品模板,以灭菌的ddH2O代替模板作为阴性对照,用优化的反应体系和条件进行荧光定量PCR反应,根据样品拷贝数与Ct值之间的线性关系和相关系数确定最小检测量。同时用引物Rhabdovirus140-F、Rhabdovirus140-R进行普通PCR反应,计算出2种方法所能检测出的最低模板浓度,比较2种方法的敏感性。
实验结果见图3所示,从左到右依次为1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102个拷贝/μL的标准品的扩增结果。检测结果表明,本发明试剂盒检测的灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,并且Ct值随浓度减少呈梯度改变,精确性优于普通PCR方法,表明本发明试剂盒对鳜鱼弹状病毒的诊断具有高度的灵敏性。
对同一样品在1次实验中重复40次进行实时荧光定量PCR检测,通过组内的Ct值变异系数来初步评估该方法的重复性。
结果如图4所示,传统PCR方法最低在1×105处能检测到条带;荧光定量PCR对重组质粒进行扩增,最低可检测10个病毒核酸分子拷贝数。2种方法阴性对照均检测不到。
结果如图5所示,对同一阳性样品在同一次实验间获得Ct值进行统计分析,同一次实验内的40个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合,Ct值读数范围为21.51~21.89,标准偏差为0.11,变异系数为0.51%。
6、荧光定量PCR的特异性检测
分别将ISKNV、GCRV、KHV、SGRV、TiLV、SCRIV、SGIV、NNV等几种病毒2ul的核酸为模板,用建立的SCRV TaqMan Real-time PCR方法进行特异性检测,以质粒为阳性对照,灭菌的ddH2O为阴性对照。
结果如图6所示,显示阳性对照和SCRV有扩增曲线外,其他病毒均没有扩增曲线,说明该检测方法有较好的特异性。
实施例2荧光定量PCR的应用
将实验室中保存的20份鱼类疑似样品,利用本发明的试剂盒进行荧光定量PCR检测,同时利用普通PCR检测,并结合细胞培养和电镜等试验进行验证。
结果显示,定量显示阳性样品5份,普通PCR检测为2份,对结果不一致的样品进行电镜和细胞接种进一步验证,结果证实均为阳性。
以上所述实施方式仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒
<130> 1.23
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gacatgttct tctacagatt caac 24
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
caatccagca ctccactg 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aggttcaaag actgtgcagc tctgt 25
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtagctagcg ccaccatgga aaaccaaatc atcaagag 38
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gtagcgccgc atttcacaaa gcttggtgtt tcagc 35
Claims (6)
1.用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针,其特征在于,所述引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示,所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1引物和探针在制备用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒中应用,其特征在于,每20μL反应体系具有以下浓度的组分:cDNA模板1μL、阳性标准品1μL、0.6μL 0.2-1.0μmol/L引物和0.2-1.0μmol/L探针、PCR预混液10μL,Premix ExTaq TM 10μL、ROX ReferenceDyeⅡ(50×)0.5μL,余量为无菌蒸馏水;所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示,所述探针序列如SEQ ID NO:3所示,所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒的DNA质粒。
3.一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的引物和探针。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述引物和探针的终浓度均为0.2~1.0μmol/L。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述引物终浓度为0.3μmol/L,所述探针终浓度为0.3μmol/L。
6.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,还包括阳性标准品、PCR预混液和无菌蒸馏水,所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒N基因的DNA质粒。
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