CN109666612B - 一株枯草芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株保藏编号为CGMCCNo.16233的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用；该枯草芽孢杆菌可制备成菌剂，应用于叶菜种植体系中土壤源塑化剂残留污染的修复，以及降低该土壤源塑化剂向叶菜可食用部分的吸收转运，该枯草芽孢杆菌属于土壤常见益生菌,能长期定植于蔬菜植株，在不影响蔬菜品质的前提下，高效降低塑化剂残留，实现绿色安全生产。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用
技术领域
本发明涉及微生物学与食品安全领域，特别是一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
技术背景
塑化剂(plasticizer)又称增塑剂，是一类无色油状合成化合物，广泛用于各类塑料产品生产，如涂料、塑料包装盒或包装膜、医护管件、可伸缩玩具、农药以及聚氯乙烯材料等。作为一种代表性的塑化剂，邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)的产量高达每年数百万吨，同时其极容易释放进入环境，污染生态圈及食物链。
由于DBP的挥发性，以及其与塑料产品之间的弱化学键，使得食品在包装和运输过程中与塑料制品接触会污染上塑化剂，但最具危害的还是作物在生产过程中吸收进体内的塑化剂残留。叶菜中残留积累的DBP是人类DBP暴露的主要来源(Zhang,Y.,Tao,Y.,Zhang,H.,Wang,L.,Sun,G.,Sun,X.,Erinle,K.,Feng,C.,Song,Q.,Li,M.,2015.Effect of di-n-butyl phthalate on root physiology and rhizosphere microbial community ofcucumber seedlings.J.Hazard.Mater.289,9-17.)，长期接触积累会致癌，干扰内分泌***以及降低雄性生育能力。因此，邻苯二甲酸二丁酯已被美国环境保护署(USEPA)列为一种重点污染物。目前已经报道的土壤修复剂主要聚焦在土壤重金属污染治理修复，以及利用有益微生物群来提高土壤的肥力，专门针对塑化剂，特别是邻苯二甲酸二丁酯土壤污染进行治理的修复剂还未见报道。
文献“邻苯二甲酸二丁酯降解菌株的筛选鉴定及其降解特性研究”(李建龙等，现代食品科技，2014)，公开了一株自土壤中筛选的具有DBP降解功能的枯草芽孢杆菌，但该文献仅公开了体外降解实验(培养基条件下的)，并未公开土壤和植株体内降解实验效果。
随着人们生活水平的提高，对新鲜蔬菜的需求也越大。而温室塑料大棚及化学农药的使用目前是保障叶菜供应的最高效手段，这就不可避免地导致栽种土壤中塑化剂的污染。叶菜的快速生长特性决定了它会通过根部组织从土壤中吸收大部分水分和养料，这伴随着塑化剂残留进入叶菜可食用部分，最终被人类食用而危害人体健康。鉴于此，探索有效修复土壤塑化剂残留污染及寻找阻断塑化剂从栽种土壤进入叶菜中的方法对于生态环境保护，绿色农业生产及人类可持续发展都显得十分重要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一株从植物中筛选分离到的植物内生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株可针对土壤主要塑化剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)进行降解，并可进一步制备为修复剂，能够有效降解残留于栽种土壤中的塑化剂污染，进而减少其向叶菜中的吸收转移，不影响叶菜植株的正常生长，不引入其他污染源。
首先，本发明提供了一株保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，申请人将其自命名为HB-T2，芽孢杆菌属；该菌株分离自多年生本草植物酸模体内，菌株呈棒杆状,能产芽孢，多数对动植物无害。
其次，本发明还提供了保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，特别是在降解土壤或叶菜植株体内邻苯二甲酸二丁酯污染的应用。
进一步，上述保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌在降解叶菜植株体内邻苯二甲酸二丁酯污染的应用是指，将保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml(OD值为1)的菌液，对叶菜植株进行进行浸根处理24h，用以降解叶菜植株中残留的邻苯二甲酸二丁酯。
进一步，上述保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌在降解土壤中邻苯二甲酸二丁酯污染的应用是指，将保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌制备成菌含量为107- 8CFU/ml(OD值为1)的菌液，喷洒邻苯二甲酸二丁酯污染的土壤，所加入的菌液占土壤质量比优选5％，用以降解土壤中残留邻苯二甲酸二丁酯；土壤中残留邻苯二甲酸二丁酯的浓度优选127ppm以下。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HB-T2的菌落图、显微镜和扫描电镜图。
图2为枯草芽孢杆菌HB-T2对邻苯二甲酸二丁酯的降解功能验证结果示意图。
图3为该微生物菌剂对土壤中残留邻苯二甲酸二丁酯修复功能展示。
图4为该微生物菌剂对减少叶菜体内塑化剂污染的效果示意。
图5为该生物菌剂对增强叶菜体内抗氧化保护***能力的效果示意。
具体实施方式
实施例所涉及的培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH 7.0；
无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O(0.4g),FeSO4·7H2O(0.2g),K2HPO4(0.2g),(NH4)2SO4(0.2g),and CaSO4,(0.08g),去离子水1L,pH 7.0～7.2；
种子培养基：K2HPO4(4.8g),KH2PO4(3.5g),(NH4)2SO4(2g),MgCl2(0.16g),CaCl2(0.02g),NaMoO4.2H2O(0.0024g),FeCl3(0.0018g),MnCl2.2H2O(0.0015g),PH＝7.0,加水至1L。
无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/L琼脂；
菌种活化培养基:10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH 7.0；
无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O(0.4g),FeSO4·7H2O(0.2g),K2HPO4(0.2g),(NH4)2SO4(0.2g),and CaSO4,(0.08g),去离子水1L,pH 7.0～7.2；
以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。
实施例1枯草芽孢杆菌HB-T2的分离鉴定与降解功能验证
1、菌株Bacillus subtilis sp.HB-T2分离鉴定
申请人于2016年7月采集来自江苏省农业科学院实验大田中的塑料大棚中生长的野生杂草酸模，然后对酸模植株进行表面消毒，研磨成汁液，涂布在含有DBP为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，筛选获得一株具备邻苯二甲酸二丁酯降解特性的植物内生菌，申请人将该菌自命名为HB-T2，其菌落照片、显微镜图和扫描电镜图依次如图1A、图1B、图1C所示，由图1可见，该菌株呈棒杆状，有内生芽孢。
通过生理生化特性和16SrDNA保守序列比对HB-T2菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，申请人于2018年8月8日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.16233,分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2、Bacillus subtilis sp.HB-T2菌株降解DBP功能验证
先用LB培养基过夜培养步骤1筛选获得的纯HB-T2菌株，菌体经过离心(5000rpm，15min,4℃)并用无菌磷酸缓冲液(PBS，pH 7.0)洗涤三遍，然后用PBS重悬成HB-T2菌悬液(OD6001.0左右)；再按体积比1％的接菌量将HB-T2菌悬液分别加入含有不同浓度(DBP浓度依次为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)的DBP为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中培养1、3、6、9、12、24、48、120小时；最后用高效液相色谱法(HPLC)检测无机盐液体培养基中的DBP残留含量，对比不接菌的对照(加入等体积1％的PBS)，计算HB-T2菌株的降解率：
DBP降解率＝(对照组DBP含量-实验组DBP含量)/对照组DBP含量*100％；
最终确定Bacillus subtilis sp.HB-T2的DBP降解性能。
上述高效液相色谱法(HPLC)参见文献：Gao,M.,Dong,Y.,Zhang,Z.,Song,W.,Qi,Y.,2017.Growth and antioxidant defense responses of wheat seedlings to di-n-butyl phthalate and di(2-ethylhexyl)phthalate stress.Chemosphere 172,418-428.
检测结果如图2所示，1％体积的HB-T2菌液就能够分别将浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL在9h、24h、120h完全降解。充分验证了Bacillus subtilis sp.HB-T2对邻苯二甲酸二丁酯的高效降解特性。根据文献“降解邻苯二甲酸酯的植物内生菌分离筛选及污染修复应用研究”(冯乃宪，暨南大学博士学位论文，2017)的报道，降解DBP的内生枯草芽孢菌的最高降解率为82％，因此认定HB-T2为目前降解DBP能力最高的内生枯草芽孢菌。
实施例2 DBP菌剂的制备
制备HB-T2菌剂，具体步骤如下：
A)将实施例1筛选获得的枯草芽孢菌HB-T2接种至LB培养基，30℃划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落于菌种活化培养基中，30℃,150-220rpm摇床震荡培养12-24h，获得活化菌种；
B)向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种，接种量为种子培养基体积的1％，25-38℃，通空气培养16-24h,得到液体种子；
C)向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子，接种量为种子培养基体积的1％，30-35℃,200rpm下避光培养至对数生长期，得到活菌体培养物；
D)取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心20min,取沉淀菌体用无菌生理盐水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至菌浓度为1010cfu/mL,即获得HB-T2菌剂。
实施例3 HB-T2菌剂修复土壤中的DBP污染实验
取样农田自然土壤，先暴晒风干，再过30目筛子去除过大的石粒，土壤成分性质为pH 5.97,有机质含量66.8g/kg干土,总氮含量0.36％,总碳含量49.61％,总氢含量5.7174％,总硫含量0.01％,氧含量44.37％，黏土含量2.33％，淤泥含量16.1％，沙含量81.5％。
将土壤样品铺平在不锈钢盘中，喷洒DBP母液(将DBP溶于乙腈中)，静置24小时以让有机溶剂挥发，再将土样装入玻璃容器中，置于翻动摇床混匀过夜以均匀分散DBP，使实验土壤DBP残留量定为400毫克每千克土壤，自然放置一个月后，测定土壤的DBP残留量为127毫克每千克。
再按c的添加量向实验土壤中加入实施例2获得的HB-T2菌剂稀释液(以无菌生理盐水稀释至菌液浓度为107-8cfu/mL)，摇床翻转过夜混匀。将玻璃容器置于暗室，同时以不添加菌剂的实验土壤为对照。定期取样用高效液相色谱法测定实验土壤中DBP的降解动态，确定HB-T2菌剂对塑化剂DBP污染的修复效果。
实验结果如图3所示，相比不做任何处理的对照组DBP污染土壤，加入HB-T2菌剂后(实验组)该污染土壤中的DBP降解速率常数和降解半衰期从0.260d-1和2.669d提高到了1.835d-1and 0.377d。添加菌剂后，能在12小时内快速将土壤的DBP浓度从127毫克每千克降低到36毫克每千克。即使在修复后期(7天之后)由于与土壤中的其他吸附物质结合成结合态而难以被HB-T2菌株和其他降解媒介降解，导致DBP在后期降解速度变慢，该菌剂依然在21天的实验周期内将土壤DBP含量减少超过10％以上。
实施例4 HB-T2菌剂修复叶菜DBP污染土壤实验
实验组：将三叶一心的小青菜上海青的根全部浸泡在实施例2获得的HB-T2菌剂稀释液(以无菌生理盐水稀释至菌液浓度为107-8cfu/mL)中24h后，移栽至实施例3中的添加了DBP的土壤中(同实施例3农田自然土壤)；
对照组浸泡在生理盐水中；
栽培3h、6h、12h、1d、3d、7d、14d、21d后取叶菜可食用部分，用气相色谱质谱联用(GC-MS)检测叶菜可食用部分的DBP残留含量(检测方法参见文献：Feng,N.,Yu,J.,Mo,C.,Zhao,H.,Li,Y.,Wu,B.,Cai,Q.,Li,H.,Zhou,D.,Wong,M.,2017.Biodegradation of di-n-butyl phthalate(DBP)by a novel endophytic Bacillus megaterium strainYJB3.Sci.Total Environ.616-617,117-127.)。
该实验结果如图4、图5所示，该菌剂都能够显著降低叶菜可食用部分的DBP残留含量。除此之外，在实验中同时发现，该菌剂能够减少高浓度DBP(127mg/Kg土壤)对叶菜生长的毒性，具有促进植物生长的作用。叶菜的地上部分的DBP残留对对照减少30-60％，接菌12小时就将残留量降解到0.4mg/L以下,而对照要栽培14天后才能自然降解到0.4mg/L以下。
同时发现如图5所示接菌后植株的抗氧化***的各种酶浓度有所变化，MDA、POD、SOD和H2O2浓度降低，这些指标的变化都表示叶菜植株所遭受的DBP污染胁迫已得到缓解，可能由于菌株HB-T2一方面通过降解DBP降低其植物毒性对植物宿主产生的氧化胁迫，另一方面植物内生菌HB-T2可能通过调节植物组织内ROS水平，进而调控植物抗氧化***，调节SOD和POD酶活性，保护植物宿主避免遭受氧化胁迫损害。

Claims (5)

1.一株保藏号为CGMCC NO:16233的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指该枯草芽孢杆菌在降解土壤中邻苯二甲酸二丁酯的应用，或者该枯草芽孢杆菌在降解叶菜植株体内邻苯二甲酸二丁酯的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述在降解土壤中邻苯二甲酸二丁酯的应用是指，将所述枯草芽孢杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml的菌液，喷洒邻苯二甲酸二丁酯污染的土壤，用以降解土壤中残留的邻苯二甲酸二丁酯。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述在降解叶菜植株体内邻苯二甲酸二丁酯的应用是指，将所述枯草芽孢杆菌制备成菌含量为107-8CFU/ml的菌液，对叶菜植株进行浸根处理，用以降解叶菜植株中残留的邻苯二甲酸二丁酯。
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