CN109761931A - 一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的化学结构式为:。可通过4‑氰基苯硼酸与5‑溴水杨醛的反应产物在进一步与邻氨基苯硫酚反应获得。本发明的荧光探针具有高特异性,在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰,可用于活细胞内pH的实时测定。该探针的灵敏度高,具有良好的荧光发射光谱特性(415‑700 nm),通过绘制标准曲线进行细胞内pH的测定,可以实现对细胞内pH快速准确检测的目的。本发明提供的荧光探针合成方法,工艺简单易行,原料廉价易得,制备成本低,易于推广。本探针在生物监测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域,具体涉及一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其应用。
背景技术
pH值作为细胞内新陈代谢的重要参数之一,在维持细胞生长、增殖、凋亡及信号传导等正常生理过程中起着关键性作用。除此之外,细胞的内吞、吞噬及受体配体的内化作用等内化通路也会受到pH的影响。正常生物体内体液酸碱度(pH值)总是稳定在一定范围之内,人体最佳pH呈弱碱性,为7.35-7.45,当其发生上下波动时可能会导致细胞功能发生障碍,严重的可以危机生命安全。若pH低于正常值,细胞呈酸性会抑制酶及激素活性,降低组织功能,也会使人体免疫力下降,红细胞及血小板易发生聚集。同事,酸性细胞环境不利于钙吸收,造成骨质疏松,而且也有研究表明细胞pH环境处于6.2-6.9范围内会使得其癌变的几率大大增加。若pH值偏高会发生碱中毒,酸碱平衡紊乱也会对人体某些器官造成不可逆损伤。
目前,可用于检测细胞内pH值的方法包括31P核磁共振法,微电极法,吸收光谱法等,但这些方法存在机械损伤、价格昂贵,难以精确测量等缺点。而荧光光谱法则是利用荧光参数如荧光强度、荧光寿命等变化对pH值进行测定,灵敏度高,选择性好,响应速度快等优点,更重要的是能够实时原位监测细胞内pH的变化而成为目前广泛采用的检测细胞内pH的一种重要方法。
发明内容
针对现有技术中的问题,本发明提供一种检测pH的比率型荧光探针,监测范围广,抗干扰能力强。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内pH的应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种检测pH的比率型荧光探针,其化学结构式如式(I)所示:
式(I)。
上述荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)将4-氰基苯硼酸,5-溴水杨醛,Pd(dppf)Cl2([1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯),醋酸钾溶于1,4-二氧六环,在氮气保护下加热搅拌至反应充分,将反应液冷却至室温,过滤除去固体杂质,滤液分离纯化得到浅黄色化合物1:
;
(2)化合物1,邻氨基苯硫酚在对甲基苯磺酸存在下于二甲基甲酰胺中加热搅拌反应;反应完成后,将反应液在0℃左右迅速冷却,后向反应液中加入水,得到黄色固体沉淀,分离沉淀并纯化得到化合物2,即荧光探针:
。
步骤(1)中,4-氰基苯硼酸与5-溴水杨醛的摩尔比为0.8-1:1-1.5。
步骤(2)中,化合物1与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1-1.5。
步骤(1)中,分离纯化过程为:以石油醚:乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液,将滤液通过柱层析(石油醚:乙酸乙酯=5:1)。
步骤(2)中,纯化过程为:以石油醚:乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液,将沉淀通过柱层析得到探针。
一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中pH的应用。
本发明的机理如下:
本发明所述的荧光探针具有2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)基团,在pH逐渐向碱性条件变化时,探针上羟基氢与苯并噻唑的氮原子形成分子内氢键形成ESIPT过程,此时蓝色荧光发生增强;而在酸性环境下时,ESIPT过程阻断从而发出绿色荧光;可采用荧光检测器通过检测不同波长的荧光强度,实现pH的检测。
本发明具有以下优点:
本发明提供的检测细胞内pH的比率型荧光探针可经化学合成获得,合成工艺简单易行,原料廉价易得,制备成本低,易于推广。本荧光探针具有高特异性,在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰,可用于活细胞内pH的实时测定。该探针的灵敏度高,具有良好的荧光发射光谱特性(415-700 nm),通过绘制标准曲线进行细胞内pH的测定,可以实现对细胞内pH快速准确检测的目的。本发明的探针具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是荧光探针的1H NMR图谱;
图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱;
图3是荧光探针的荧光强度与pH的线性关系;
图4是荧光探针分别在pH6.5和pH7.5时与不同物质反应后的荧光强度;
图5是荧光探针对活细胞的毒性实验;
图6是荧光探针在活细胞中的荧光成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针的合成
将4-氰基苯硼酸(147 mg,1 mmol),5-溴水杨醛(201 mg,1 mmol),Pd(dppf)Cl2(146mg,20 mol%),醋酸钾(393 mg,4 mmol)溶于10 mL 1,4-二氧六环中加热搅拌至90℃,在氮气保护下充分反应12小时。反应停止后,将反应液冷却至室温,过滤除去固体杂质,然后以石油醚:乙酸乙酯=5:1v/v为淋洗液将滤液通过柱层析提纯的黄色固体粉末为化合物1:
;
取化合物1(88 mg,0.4 mmol),邻氨基苯硫酚(50 mg,0.4 mmol)用5 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后加入对甲基苯磺酸(10 mg,0.058 mmol)在90℃条件下加热搅拌2h。反应完成后,将反应液在0℃左右迅速冷却,后向反应液中加入5 mL水,得到黄色固体沉淀,抽滤得粗产品。将粗产品通过柱层析进行提纯分离得到化合物2,即为荧光探针;其1H NMR图谱如图1:
。
实施例2 荧光探针对pH的响应
预先准备13份4 mL的5 μM探针缓冲溶液,含5%甲醇,pH分别为3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9。然后进行荧光扫描(λex =405 nm);计算各体系中荧光强度;该探针对不同pH的响应如图2所示:随着pH由酸性逐渐变为碱性,473 nm处的荧光强度(I473)逐渐增强,546 nm处的荧光强度(I546)没有明显变化。计算I473/ I546的比值,作I473/ I546与pH的线性关系如图3所示:在pH6.5-8.5范围内,pH变化与I473/ I546线性相关。
实施例3 荧光探针对不同离子的选择性
预先准备20份4 mL的5 μM探针缓冲溶液(含5%甲醇,pH= 6.5和7.5),然后分别向该体系中依次加入100 μL浓度为40 mM的不同检测物的PBS溶液。然后进行荧光检测(λex= 405nm,λem= 473nm和546nm);计算各体系中I473/ I546;评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性,结果如图4所示,其中,1-空白,2-AlCl3,3-CaCl2,4-NaClO,5-CuSO4,6-Cys,7-NaF,8-FeSO4,9-Fe2(SO4)3,10-GSH,11-H2O2,12-H2S,13-Hcy,14-MgCl,15-CoCl2,16-SO2,17-ZnCl:在相同条件下加入不同离子,发现该探针受到离子的影响不大。
实施例4 荧光探针对细胞的毒性
准备浓度为5-50 μM的探针缓冲溶液(含5%甲醇,pH= 7.4),采用MTT比色法,分析A549细胞在加入荧光探针后的吸光度,计算细胞存活率,结果如图5所示:在浓度为5-50 μM时,细胞的存活率为98%-83%,浓度小于10 μM时,细胞存活率在95%以上。
实施例5 荧光探针在活细胞中的成像应用
将A549细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中,放置于条件为37℃、5% CO2和20% O2的培养箱中培养24 h。用微量进样器吸取实施例1制备的荧光探针(10 μM)注入pH分别为5.5,6.5,7.5,8.5的PBS缓冲液处理过的A549细胞中,继续在培养箱中培养10 min并进行在蓝通道与绿通道进行荧光成像(λex= 405 nm)结果见图6:蓝色通道荧光随着碱性的增加而显着增强,而绿色通道的荧光在405 nm激发下没有显着变化。
Claims (5)
1.一种检测pH的比率型荧光探针,其化学结构式如式(I)所示:
式(I)。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将4-氰基苯硼酸,5-溴水杨醛,Pd(dppf)Cl2,醋酸钾溶于1,4-二氧六环,在氮气保护下加热搅拌至反应充分,将反应液冷却至室温,过滤除去固体杂质,滤液分离纯化得到浅黄色化合物1:
;
(2)化合物1和邻氨基苯硫酚在对甲基苯磺酸存在下于二甲基甲酰胺中加热搅拌反应;反应完成后,将反应液在0℃左右迅速冷却,后向反应液中加入水,得到黄色固体沉淀,分离沉淀并纯化得到化合物2,即荧光探针:
。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,4-氰基苯硼酸与5-溴水杨醛的摩尔比为0.8-1:1-1.5;步骤(2)中,化合物1与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1-1.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,分离纯化过程为:以石油醚:乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液,将滤液通过柱层析(石油醚:乙酸乙酯=5:1);
步骤(2)中,纯化过程为:以石油醚:乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液,将沉淀通过柱层析得到探针。
5.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中pH的应用。
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