CN109758462A - 一种阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用,属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制***的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗***病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及兽用药物技术领域,具体涉及一种阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用。
背景技术
***病毒是一类小RNA病毒科的一种无包膜单股正链RNA病毒。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等7种血清型,同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的***,主要感染猪、牛等偶蹄类动物,常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。***传播途径多、流行范围广和传染性强,目前在多个国家频繁暴发,已严重威胁全球畜牧业的发展,并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。它被世界动物卫生组织列为A类动物疫病名单之首,我国也将该病排在一类动物传染病名单的第一位,同时也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。目前,疫苗免疫是防控***的主要手段,然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此,为了弥补“免疫窗口期”,急需开发新型有效的抗病毒药物。
发明内容
本发明的目的在于提供阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制***的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗***病毒药物。
本发明提供了阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用。
优选的是,所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。
优选的是,所述阿米洛利在应用时的浓度范围为>400μmol/L。
本发明提供了阿米洛利(Amiloride)在制备预防***病毒感染的药物中的应用。阿米洛利对A型***病毒和O型***病毒诱导的细胞病变均有抑制作用,抑制病毒的复制。细胞试验显示,阿米洛利细胞毒性低,对A型***病毒和O型***病毒的复制均具有抑制作用;进一步的实验证实,阿米洛利能抑制FMDV复制的早期阶段,可将阿米洛利作为一种有效的抗***病毒成分。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同浓度的Amiloride对IBRS-2细胞的细胞毒性图;
图2为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图;
图3为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图;
图4为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染细胞的FMDV mRNA抑制作用图;
图5为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图;
图6为本发明实施例3中IFA检测不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图;
图7为本发明实施例4中q-PCR检测Amiloride对FMDV吸附、穿入阶段中的mRNA抑制作用图;
图8为本发明实施例5中Amiloride在不同时间段对病毒感染细胞的FMDV mRNA抑制作用图;
图9为本发明实施例5中Amiloride在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图。
具体实施方式
本发明提供了阿米洛利(uPA合成抑制剂)在制备预防***病毒感染的药物中的应用。在本发明中,所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。阿米洛利对A型***病毒和O型***病毒诱导的细胞病变均有抑制作用,抑制病毒的复制,阿米洛利只是在FMDV复制早期起作用,而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明对阿米洛利的来源没有特殊的限定,采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中,所述阿米洛利在应用时其浓度范围>400μmol/L。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
Amiloride在IBRS-2细胞上的毒性实验
采用MTS法(MTS检测试剂盒购自Abcam公司)测定Amiloride(购自MCE公司)对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM(购自Gibco公司)洗3次,最后加入用含2%FBS(购自Gibco公司)的DMEM培养液梯度稀释好的Amiloride 100μL,以Amiloride的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔,以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h,弃掉上层细胞培养液,用新鲜的DMEM洗三次,再加入100μL新鲜的DMEM,每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值,根据公式“细胞活性率=(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%”计算出不同浓度的Amiloride对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。
实验结果如图1所示:MTS结果显示,随着药物浓度的不断增加,细胞的活性率仍在70%以上,说明Amiloride对IBRS-2细胞毒性较低。
实施例2
Amiloride在IBRS-2细胞上抗***病毒活性的评价
将含10%FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI=1)(国家***参考实验室保存并提供)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Amiloride 100μL,以Amiloride的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔,以无Amiloride、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养24h,弃掉上层细胞培养液,用新鲜的DMEM洗三次,再加入100μL新鲜的DMEM,每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值,根据公式“细胞活性率=(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%”计算出不同浓度Amiloride的抗病毒作用。同时收集不同组上清液,q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。
按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA,按照SYBR Premix Ex TaqⅡ操作说明书进行荧光定量PCR,β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为:
FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1);
FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2);
β-actin的引物序列为:
β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3);
β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。反应体系为:SYBRPremix ExTaq:12.5μL,上游引物:1μL,下游引物:1μL,cDNA:1μL,灭菌水:9.5μL,反应程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s,56退火30s,72℃延伸30s,40个循环。根据2-△△CT方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白,应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12%的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳,电泳2h后,将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后,把膜置入新鲜配制的5%脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后,将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1:3000),小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中,4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次,每次10min,之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000),室温孵育1h,TBST洗膜5次,每次10min,最后利用ECL化学发光法显影检测FMDV VP1蛋白。为了研究Amiloride对其他***病毒亚型是否具有抑制作用,利用FMDVA/GDMM/CHA/2013(MOI=1)感染细胞,MTS法测定其抗病毒活性。
实验结果如图2~5所示:用MTS检测Amiloride对FMDV是否具有抗病毒活性,在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为400μmol及以上浓度时,Amiloride才可以提供IBRS-2细胞80%以上的保护(图2),并且降低FMDV mRNA(图4)和VP1蛋白水平(图5)的表达;而当浓度低于400μmol时,Amiloride则不能提供细胞有效的保护。同样,当用A型***病毒感染细胞时,200μmol及以上浓度的Amiloride能有效的保护IBRS-2细胞(图3),说明Amiloride对A型FMDV也具有抗病毒活性。
实施例3
间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况
将密度为3×105/孔IBRS-2细胞铺到12孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI=1)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Amiloride 100μL,以Amiloride的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔,放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定细胞15min,弃掉多聚甲醛,加入甲醇作用5min,用PBS漂洗3次,每次5min,加入封闭液(10%FBS,0.3%Triton X-100,89.7%PBS)封闭10min,之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100),室温孵育1h,PBS漂洗3次,每次5min,加入用封闭液稀释好的二抗(1:200),室温孵育1h,PBS漂洗5次,每次5min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色,作用5min,PBS漂洗2次,每次5min,荧光显微镜观察结果。
实验结果如图6所示:未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用100、200μmolAmiloride处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光,而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了Amiloride在IBRS-2细胞上的抗***病毒活性呈现剂量依赖性。
实施例4
FMDV抑制病毒复制阶段的检测
将IBRS-2细胞铺至24孔板中,待细胞长满单层后,弃掉培养液。在病毒的吸附阶段:每孔加入FMDV病毒液(MOI=1)。然后向每孔中加入不同浓度的Amiloride,使其终浓度分别为400、600、800、1000μmol,设立不加入药物的阴性对照组,将细胞板放入4℃冰箱作用1h,只允许病毒附着于细胞表面。弃去病毒液,用DMEM洗去未结合的病毒,每孔加入400μL培养液,放入-80℃冰箱反复冻融3次,收集病毒液,10000r/min离心10min去除细胞碎片,上清液用于检测mRNA表达水平情况。在病毒穿入阶段:每孔加入200μL的FMDV病毒液,将细胞放入37℃温箱1h,允许病毒吸附细胞表面,用DMEM洗去未结合的病毒,然后向每孔中加入不同浓度的Amiloride 200μL,使Amiloride的终浓度分别为400、600、800、1000μmol,同时设立不加药物的阴性对照组,将细胞板放入37℃温箱培养1h,去掉药物,用DMEM洗去残留的药物,加入含有2%FBS的维持液,放入37℃温箱继续培养24h,收集上清检测mRNA表达水平情况。
实验结果如图7所示:在病毒的吸附(Attachment)阶段,分别用不同浓度的Amiloride和FMDV病毒液处理细胞,在培养箱中共同作用1h,结果显示无论用不同浓度的Amiloride处理细胞,病毒的mRNA表达水平与未处理组无明显差别,所以Amiloride不会对FMDV吸附细胞产生影响。在病毒的穿入(Entry)阶段,各药物处理组的mRNA和未经药物处理的阴性对照组相比没有明显差别,说明Amiloride不会影响病毒进入细胞的能力。
实施例5
Amiloride对***病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价
将在含10%FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI=1)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液,此时作为0h。在病毒感染后0h,2h,4h,8h,16h分别向不同孔中加入Amiloride,使其的终浓度为1000μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO2恒温细胞培养箱中培养24h。收集不同组上清液,q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。
实验结果如图8~9所示:在病毒感染后不同时间段用Amiloride处理细胞,结果显示,在FMDV复制的0~8h内,与阴性对照相比,FMDV mRNA水平(图8)和VP1蛋白水平(图9)明显受到抑制。而在16h时Amiloride的抑制作用并不明显,说明Amiloride只是在FMDV复制早期起作用,而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacaaaaca cggacccgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtaccagg gtttggcctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaccaccttc aactcgatca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgttggcgt agaggtcctt 20
Claims (3)
1.阿米洛利在制备预防***病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述阿米洛利在应用时浓度>400μmol/L。
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CN1638772A (zh) * | 2002-01-31 | 2005-07-13 | 皮科莱尔控股公司 | 抗病毒化合物 |
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CN116942669B (zh) * | 2023-05-22 | 2024-02-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 阿米洛利在制备防治鳜弹状病毒感染的药物中的应用 |
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