CN109745328A - 一种高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制***的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗***病毒药物。

Description

一种高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用。

背景技术

***病毒是一类小RNA病毒科的一种无包膜单股正链RNA病毒。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等7种血清型，同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的***，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。***传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展，并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。它被世界动物卫生组织列为A类动物疫病名单之首，我国也将该病排在一类动物传染病名单的第一位，同时也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。目前，疫苗免疫是防控***的主要手段，然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此，为了弥补“免疫窗口期”，急需开发新型有效的抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的在于提供高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)在制备预防***病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制***的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗***病毒药物。

本发明提供了高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用。

优选的是，所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。

优选的是，所述高三尖杉酯碱在所述药物中的浓度＞6.2μmol/L。

本发明提供了高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用。高三尖杉酯碱对A型***病毒和O型***病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制。细胞试验显示，高三尖杉酯碱细胞毒性低，对A型***病毒和O型***病毒的复制均具有抑制作用；进一步的实验证实，高三尖杉酯碱只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。高三尖杉酯碱能够作为一种有效的抗***病毒成分。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度的Homoharringtonine对IBRS-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施例1中不同浓度的Homoharringtonine对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施例1中不同浓度的Homoharringtonine对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施例1中不同浓度的Homoharringtonine对O型FMDV感染细胞的FMDV mRNA抑制作用图；

图5为本发明实施例1中不同浓度的Homoharringtonine对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图6为本发明实施例1中IFA检测不同浓度的Homoharringtonine对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；

图7为本发明实施例1中q-PCR检测Homoharringtonine对FMDV吸附、穿入阶段中的mRNA抑制作用图；

图8为本发明实施例1中Homoharringtonine在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；

图9为本发明实施例1中Homoharringtonine在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图。

具体实施方式

本发明提供了高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用。在本发明中，所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。高三尖杉酯碱对A型***病毒和O型***病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，高三尖杉酯碱只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明对高三尖杉酯碱的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品即可。

在本发明中，所述高三尖杉酯碱在所述药物中的浓度优选为＞6.2μmol/L。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

IBRS-2细胞由本课题组保存；FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家***参考实验室保存并提供；Homoharringtonine购自MCE公司，以DMSO进行配制。

1.2试剂

DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、PVDF膜购自BioRad公司；吐温-20购自上海生工生物工程公司；Triton X-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体由国家***参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家***参考实验室周广青惠赠。

2.实验方法和结果

2.1Homoharringtonine在IBRS-2细胞上的毒性实验：

采用MTS法测定Homoharringtonine对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Homoharringtonine 100μL，以Homoharringtonine的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度的Homoharringtonine对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在85％以上，说明Homoharringtonine对IBRS-2细胞毒性极低。

2.2Homoharringtonine在IBRS-2细胞上抗***病毒活性的评价：

将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Homoharringtonine 100μL，以Homoharringtonine的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无Homoharringtonine、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养48h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度Homoharringtonine的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBR Premix Ex TaqⅡ操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为：

FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。反应体系为：SYBRPremix ExTaq:12.5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据2^-△△CT方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDV VP1蛋白。为了研究Homoharringtonine对A型***病毒具有抗病毒活性，利用100TCID50A/GDMM/CHA/2013感染细胞，MTS法测定其抗病毒活性。

实验结果如图2～5所示：用MTS检测Homoharringtonine对FMDV是否具有抗病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为6.2μmol及以上浓度时，Homoharringtonine才可以提供IBRS-2细胞有效的保护(图2)，并且显著的抑制FMDV mRNA和VP1蛋白水平的表达(图4、图5)。而当浓度低于6.2μmol时，Homoharringtonine则不能提供细胞有效的保护。同样，当用A型***病毒感染细胞时，6.2μmol及以上浓度的Homoharringtonine也能有效的保护IBRS-2细胞，说明Homoharringtonine对A型FMDV也具有生物学活性(图3)。

2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Homoharringtonine 100μL，以Homoharringtonine的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％Triton X-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图6所示：未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用0.1、1.5、3.1μmolHomoharringtonine处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了Homoharringtonine在IBRS-2细胞上的抗***病毒活性呈现剂量依赖性。

2.4FMDV抑制病毒复制阶段的检测

将IBRS-2细胞铺至24孔板中，待细胞长满单层后，弃掉培养液。在病毒的吸附阶段：每孔加入FMDV病毒液。然后向每孔中加入不同浓度的Homoharringtonine，使其终浓度分别为6.2、12.5、25μmol，设立不加入药物的阴性对照组，将细胞板放入4℃冰箱作用1h，只允许病毒附着于细胞表面。弃去病毒液，用DMEM洗去未结合的病毒，每孔加入400μL培养液，放入-80℃冰箱反复冻融3次，收集病毒液，10000r/min离心10min去除细胞碎片，上清液用于检测mRNA表达水平情况。在病毒穿入阶段：每孔加入200μL的FMDV病毒液，将细胞放入37℃温箱1h，允许病毒吸附细胞表面，用DMEM洗去未结合的病毒，然后向每孔中加入不同浓度的Homoharringtonine 200μL，使Homoharringtonine的终浓度分别为6.2、12.5、25μmol，同时设立不加药物的阴性对照组，将细胞板放入37℃温箱培养1h，去掉药物，用DMEM洗去残留的药物，加入含有2％FBS的维持液，放入37℃温箱继续培养48h，收集上清检测mRNA表达水平情况。

实验结果如图7所示，在病毒的吸附(Attachment)阶段，分别用不同浓度的Homoharringtonine和FMDV病毒液处理细胞，在培养箱中共同作用1h，结果显示无论用不同浓度的Homoharringtonine处理细胞，病毒的mRNA表达水平与未处理组无明显差别，所以Homoharringtonine不会对FMDV的吸附产生影响。在病毒的穿入(Entry)阶段，各药物处理组的mRNA和未经药物处理的阴性对照组相比没有明显差别，说明Homoharringtonine不会影响病毒进入细胞的能力。

2.4Homoharringtonine对***病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入Homoharringtonine，使其的终浓度为12.5μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO₂恒温细胞培养箱中培养48h。收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。

实验结果如图8～9所示：在病毒感染后不同时间段用Homoharringtonine处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDV mRNA水平(图8)和VP1蛋白水平明显受到抑制(图9)。而在16h时Homoharringtonine的抑制作用并不明显，说明Homoharringtonine只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaaaaca cggacccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtaccagg gtttggcctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccaccttc aactcgatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttggcgt agaggtcctt 20

Claims (3)

1.高三尖杉酯碱在制备预防***病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述***病毒包括A型***病毒和O型***病毒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高三尖杉酯碱在所述药物中的浓度＞6.2μmol/L。