CN109749959A

CN109749959A - 一种具有固氮活性的菌株hb161398及其应用

Info

Publication number: CN109749959A
Application number: CN201910092730.1A
Authority: CN
Inventors: 刘敏; 童玉和; 李卫东
Original assignee: Hainan Tropical Ocean University
Current assignee: Hainan Reda Yiyuanhe Ecological Technology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109749959B

Abstract

本发明公开了一种具有固氮活性的菌株HB161398，其保藏编号为CGMCC NO.13939，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株属于Rhodobacteraceae科新属，固氮活性好。本发明还公开了上述菌株HB161398在制备具有固氮作用的肥料中的应用。

Description

一种具有固氮活性的菌株HB161398及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有固氮活性的菌株HB161398。

背景技术

氮是限制生态***生产力的主要元素，生物固氮是自然生态***中氮的主要来源。生物固氮包括共生、联合和自生固氮3种类型，其中联合固氮和自生固氮统称为非共生固氮(asymbiotic nitrogen fixation)。相对于共生固氮而言，非共生固氮速率虽然较低，但其不需要与其它生物形成共生体系就可以生存并进行固氮，在时空分布上更加广泛，对生态***氮循环特别是素输入具有重要贡献。如在许多热带森林中，尤其在缺乏大量共生固氮植物的森林中，自生固氮对于满足植物的高氮需求和平衡氮素损失极其重要。此外，联合固氮菌通过聚集在根表或经根部伤口定殖到根内，从宿主获得的根际分泌有机物作为碳源和能源，并将其固定的氮和分泌的生物活性物质供给植物利用，在禾本科植物(包括草类和谷类)占优势的生态***中起着重要作用。除提供氮素外，非共生固氮菌还可以通过分泌生长激素、促进溶磷和秸秆降解、增强抗病性和抗逆境等间接促进植物生长。此外，非共生固氮菌还具有降解纤维素、半纤维素和木质素的能力，进而促进凋落物和秸秆降解，促进土壤培肥和氮素补充。面对目前长期大量使用化学肥料带来的土壤肥力下降、面源污染和温室气体排放增加等一系列负面影响，非共生固氮作用的研究和开发利用对农业可持续发展更具特殊的意义。而目前对非共生固氮微生物的研究整体较薄弱，特别是优良菌株资源的挖掘及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有固氮活性的菌株HB161398，该菌株固氮活性好。

本发明的目的还在于提供上述菌株HB161398在制备具有固氮作用的肥料中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种具有固氮活性的菌株HB161398，该菌株HB161398的保藏编号为CGMCC NO.13939，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

该菌株HB161398是从海南省文昌清澜港红树林淤泥中分离得到。经微生物多相分类鉴定，确定为Rhodobacteraceae科新属Mangrovela的新种，命名为红树林固氮菌(Mangrovela diazotropha)。

采用气相色谱仪测固氮菌的乙炔还原活性(Acetylene reducing activity,ARA)，该菌株的固氮活性为178.10±23.42nmol C₂H₄·H^-1·m L^-1。

提取菌株HB161398(是将161398菌株培养固体平板划线挑去单菌落或者液体培养收集)基因组DNA，运用固氮基因的特异性引物nifHf和nifHr进行PCR扩增，扩增到目的条带，证明该菌株具有生物固氮基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。运用引物27f和1492r进行PCR扩增，通过测序分析得到16S rDNA序列，该菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

将所得到的16S rRNA的基因序列在NCBI GenBank和EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/；(Kim et al.2012))数据库中选取同源性比较高的典型菌株作为参比菌株，用CLUSTAL X 1.8program(Thompson et al.1997)进行多列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，应用MEGA5软件采用neighbor-joining法构建***发育树(bootstrap values＝1000)。从***发育树可以看出与Poseidonocella pacifica JCM17310T(AB576005亲缘关系最近，16S rDNA同源性为96.17％。结合生理生化实验结果进一步表明，该菌属于Rhodobacteraceae科新属Mangrovela的一个具有固氮活性的新种，命名为红树林固氮菌(Mangrovela diazotropha)。

本发明的优点是：该菌具有固氮活性，且属于新属；此外，该菌株属于非共生固氮菌，无需与其它生物形成共生体系就可以生存并进行固氮，应用范围广泛，且固氮活性好，可用于蔬菜、农作物以及红树林等的菌肥中。

附图说明

图1是实施例1中的菌株HB161398形态(电镜照片)(2500×)；

图2是实施例4中的菌株HB161398的***发育树。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明做进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

实施例1菌株HB161398的分离

将采集的红树林底泥(海南省文昌清澜港红树林底泥)混匀后称取10g于装有100mL无氮培养基的三角瓶中并放置于摇床上以200r/min振荡30min，使土样充分分散。取出样品静置富集5天后取上层液体进行梯度稀释，取10^-3-10^-6稀释度涂布于无氮培养基平板上，每个梯度2个重复。28℃倒置培养5-7d。挑取菌落较大且呈透明黏稠状的菌株进行平板划线法进行纯化。纯化后进行16s rDNA以及nifH(固氮)基因序列的扩增并鉴定，对菌株编号并于斜面4℃和甘油管-80℃保存。菌株形态如图1所示，菌体呈椭圆形(1.5-2μm长，0.8-1.25μm宽)。

其中无氮培养基(简写：DRN)的成分包括：

pH为7.0。

该菌株HB161398具有以下微生物特性：

(1)形态与培养特性

菌株HB161398在营养琼脂、R2A琼脂以及2216E琼脂培养基上生长良快，1d可见清晰菌落，菌落圆形、乳白色至淡黄色，表面光滑、凸起；在无氮培养基上生长较慢，4-5d后菌落形成，后逐渐扩大，呈黏稠状的圆形半透明菌落。具体特征见表1。

表1菌株HB161398的培养特征

(2)多相分类特征

菌株HB161398在API 20NE的12种碳源中，利用D-甘露醇、麦芽糖的能力较强，能微弱利用葡萄糖和N-乙酰-葡萄糖胺，不利用***糖、甘露糖、葵酸、乙二酸、柠檬酸、葡萄糖酸盐、苹果酸、苯乙酸。产生细胞色素氧化酶、脲酶、b-葡萄糖甙酶、硝酸盐还原酶，微弱产生H₂O₂酶。不产淀粉水解酶、酪氨酸水解酶、b-半乳糖甙酶、精氨酸双水解酶，不能酸化葡萄糖，不产H₂S，具体见表2。菌株盐浓度生长适应范围为3％-6％。适宜生长的pH为5-9，在pH 10也能微弱生长。细胞壁多糖是核糖，木糖，***糖和半乳糖。极性脂是diphosphatidylglycerol(DPG),phosphatidylethanolamine(PE),phosphatidylglycerol(PG),glycolipid(GL),phosphatidylmethylethanolamine(PME)。菌株的主要呼吸醌为Q-10。脂肪酸主要为Summed Feature 8(C18:1 w7c and/or C18:1w6c)(52.0％),C19:0cyclo ω8c(26.8％),C16:0(7.0％)和C18:1 ω7c 11-methyl(4.0％)。G+C含量是69.06％。以上结果结合***发育分析表明，菌株HB161398属于Rhodobacteraceae科新属Mangrovela的新种，命名为红树林固氮菌(Mangrovela diazotropha)。

表2菌株HB161398与Rhodobacteraceae科中相关属的差异比较

菌株:1,HB161398T,2,Poseidonocella pacifica KMM 9010T(资料来自Romanenko et al.(2012)),3,Pseudodonghicola xiamenensis Y-2T(资料来自Tan etal.(2009)和Hameed et al.(2014)),4,Roseovarius tolerans DSM 11457T(资料来自Labrenz et al.(1999)),5,Donghicola eburneus SW-277T(资料来自Yoon et al.(2007)),6,Actibacterium mucosum KCTC 23349T(资料来自Park et al.(2014)和Lucenaet al.(2012)).

+阳性,-阴性,w反应弱,ND无资料.DPG,Diphosphatidylglycerol；PC,phosphatidylcholine；PE,phosphatidylethanolamine；GL:glycolipid；PG,phosphatidylglycerol；PME,Phosphatidylmethylethanolamine；SQDG,sulfoquinovosyldiacylglycerol；AL,unidentified aminolipids；PL,unidentifiedphospholipids；L,unidentified lipids。

实施例2菌株HB161398的培养

可以采用斜面培养将菌株HB161398进行保藏或暂存，也可以采用平板培养将菌株HB161398进行活化或转接使用，具体如下：

(1)斜面培养：从已纯化的平板中，挑取菌株单菌落培养3-5天，培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，50％陈海水1000mL，pH7.2，培养好后保存于4℃冰箱存放；

(2)平板培养：从已纯化的平板中，挑取菌株单菌落培养3-5天，培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，50％陈海水1000mL，pH7.2，培养好后保存于4℃冰箱存放。

实施例3菌株HB161398固氮活性检测

将实施例2中斜面保存的纯菌株接种于10mL Dobereiner无氮液体培养基，于30℃摇床振荡培养72h测定OD600，进行统一调整，分别取1mL于灭菌的5mL小瓶中，盖上橡皮塞。瓶盖边缘以石蜡封口。用注射器将1mL的乙炔注入，在同样条件下培养24h，然后取其中40μL反应后气体，采用气相色谱仪测固氮菌的乙炔还原活性(Acetylene reducing activity，ARA)。

乙炔还原活性计算方法如下，其中乙炔还原的乙炔量与固定氮气的比例采用:C₂H₄：N₂＝4：1进行换算)：

ARA[nmol/(mL·h)]＝Vst×Cst×Asa×Vtu/Vsa/Ast/h/22.4

其中，Vst是注入标准气的体积(mL)，Cst是标准气的浓度，Vtu是所用试管体积(mL)，Asa是样品乙烯峰的面积(cm²)，Vsa是样品注入体积(mL)，Ast是标准气峰面积(cm²)，h是培养时间，该菌株的固氮活性为178.10nmol C₂H₄·H^-1·m L^-1。

实施例4菌株16S rDNA的扩增

细菌基因组DNA提取利用Bacterial Genomic DNA Isolation Kit(ForegeneBiosciences,China)。以细菌基因组DNA为模板进行16S r RNA基因的PCR的扩增，16S rRNA基因引物为27f(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(Weisburg et al.1991)，PCR扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度55℃复性45s，72℃延伸45s，进行30个循环后72℃延伸10min；16S rRNA基因扩增产物经纯化后，送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列如SEQ ID：NO：1所示。

具体如下：

将所得到的16S rRNA基因序列在NCBI GenBank和EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/；(Kim et al.2012))数据库中选取同源性比较高的典型菌株作为参比菌株，用CLUSTAL X 1.8program(Thompson et al.1997)进行多列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，应用MEGA5软件采用neighbor-joining法构建***发育树(bootstrap values＝1000)，见图2。

从图2的***发育树可以看出与Poseidonocella pacifica JCM 17310^T(AB576005亲缘关系最近，16S rDNA同源性为96.17％。结合生理生化实验结果进一步表明，该菌属于Rhodobacteraceae科新属Mangrovela的新种，命名为红树林固氮菌(Mangroveladiazotropha)(保藏证明上的Poseidonocella diazotropha是保藏中心建议的与本申请比较接近的暂时的分类命名)。

菌株的NifH基因的扩增：细菌基因组DNA提取利用Bacterial Genomic DNAIsolation Kit(Foregene Biosciences,China)。以细菌基因组DNA为模板进行nif H基因的PCR的扩增，nif H基因引物为nifHf(TGCGAYCC(G/C)AARGCBGACTC)和nifHr(AT(G/C)GCCATCATYTCRCCGGA)，PCR扩增程序如下:94℃预变性5min,94℃变性30s，退火温度55℃复性30s，72℃延伸30s，进行30个循环后72℃延伸10min。Nif H基因扩增产物经纯化后，送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列如SEQ ID：NO：2所示。

具体如下：

综合上述的生理生化特性、16SrDNA序列分析结果，本发明的菌该菌株属于Rhodobacteraceae科新属Mangrovela的新种，命名为红树林固氮菌(Mangroveladiazotropha)(保藏证明上的Poseidonocella diazotropha是保藏中心建议的与本申请比较接近的暂时的分类命名)。

将分离纯化得到的菌株HB161398保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.13939，保藏日期为2017年9月18日。

实施例5菌剂有效性实验—蔬菜种植方面有效性试验

将活化的单菌落(来源实施例2中平板培养获得)采用Zobell 2216E液体培养基(蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，陈海水1000mL，pH为7.6-7.8)，28℃培养48小时，离心收集菌体，与250克椰糠混匀，接种于盆栽沙土(每盆含2.5kg沙土)。每盆沙土混合接入1升发酵量。

选取白菜Brassica pekinensis(Lour.)Rupr.进行盆栽实验。30天后与未接种的对照相比，白菜干重平均增加28％，植株内氮素平均增加25％，因此可以将菌株HB161398用于制备促进蔬菜等作物生长的生物固氮菌肥中。

实施例6菌剂有效性实验—红树植物方面有效性试验

将活化的单菌落(实施例2中平板培养获得的)采用2216E液体培养基(1升)28℃培养48小时，离心收集菌体，待用。

采用红树植物-红海榄进行盆栽实验，用收集的菌体重悬制备成菌悬液，浸泡红树根部24小时后栽种入塑料盆中，对照实验中，红海榄根部不经过菌悬液浸泡，直接栽种入塑料盆中，60天后测量植物根系长度、叶面积和总叶绿素，结果如下表3。

表3菌株HB161398对红海榄胚处理60天后的影响

	主根长度	叶面积(cm<sup>2</sup>)	总叶绿素
				菌悬液浸泡	13.54	48.63	22.95
未经菌悬液浸泡	11.2	30.56	18.11

从表3结果可见，经过菌悬液浸泡的红海榄胚发育更快，主根长度、叶面积和总叶绿素都高于对照组，说明菌株HB161398对于红海榄胚的发育有促进作用，这是由于菌株HB161398具有固氮活性，所以会对植物的生长产生促生作用，因此可将菌株HB161398用于制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南热带海洋学院

<120> 一种具有固氮活性的菌株HB161398及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> 红树林固氮菌(Mangrovela diazotropha)

<400> 1

tacggttacc ttgttacgac ttcaccccag tcgctgatcc taccgtggtc cgctgcctcc 60

cgaaggttag cgcacggccg tcaggtagaa ccaactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt 120

acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgtca tgctgttacg cgattactag cgattccgac 180

ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc gaactgagac agcttttggg gattaaccca 240

ttgtcactgc cattgtagca cgtgtgtagc ccaacccgta agggccatga ggacttgacg 300

tcatccacac cttcctccga cttatcatcg gcagttccct tagagtgccc agccgaactg 360

ctggcaacta agggtgtggg ttgcgctcgt tgccggactt aaccgaacat ctcacgacac 420

gagctgacga cagccatgca gcacctgtca ctaggtcccc gaagggaagg aaccatctct 480

ggaactgtcc taggatgtca agggttggta aggttctgcg cgttgcttcg aattaaacca 540

catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agttttaatc ttgcgaccgt 600

actccccagg cggaatgctt aatccgttag gtgtgtcacc gagcagcatg ctacccgacg 660

actggcattc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac 720

gctttcgcac ctcagcgtca gtatcgagcc agtgagccgc cctcgccact ggtgttcctc 780

cgaatatcta cgaatttcac ctctacactc ggaattccac tcacctctct cgaactcaag 840

actgggagtt ttgaaggcag ttccggggtt gagccccggg atttcacccc caactttcca 900

gtccgcctac gtgcgcttta cgcccagtaa ttccgaacaa cgctaacccc ctccgtatta 960

ccgcggctgc tggcacggag ttagccgggg tttctttacc aggtactgtc attatcatcc 1020

ctggcgaaag agctttacaa ccctaaggcc ttcatcgctc acgcggcatg gctcggtcag 1080

gcttgcgccc attgccgaag attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1140

tcagtcccag tgttgctgat catcctctca aaccagctat agatcgtagg cttggtaggc 1200

cattacccca ccaactacct aatctaacgc gggccgatcc ttcaccgata aatctttccc 1260

ccgaagggcg tatgcggtat taaacccagt ttcccgggac tattccgcag tgaagggcac 1320

gttcccacgc gttactaacc cgtccgccgc taaacccgaa ggtttcgctc gacttgcatg 1380

tgttaggcct gccgccagcg ttcgttctga gccaggatca aactcta 1427

<210> 2

<211> 364

<212> DNA

<213> 红树林固氮菌(Mangrovela diazotropha)

<400> 2

ttgcgatccg caggcggact cgacccgcct gatcctgaac tcgaaagccc aggacaccgt 60

cctgcacatg gccgccgaga tgggctcggt cgaggacctg gaactcgagg acgtgctgaa 120

aatcggcttc aaggacatca agtgcgttga atcgggcggc ccggagccgg gcgtcggctg 180

cgccggccgc ggcgtcatca ccgccatcaa cttcctcgag gaaaacggcg cctatgacga 240

tgtcgactac gtctcctacg acgttctcgg cgacgtggtc tgcggcggct tcgccatgcc 300

gatccgcgag aacaaggccc aggaaatcta catcgtcatg tccggcgaaa ggatggccat 360

aaca 364

Claims

1.一种具有固氮活性的菌株HB161398，其特征是：该菌株HB161398的保藏编号为CGMCCNO.13939，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的菌株HB161398在制备具有固氮作用的肥料中的应用。