CN109729974A - 一种低温培养人参不定根的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

发明公开了一种低温培养人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6‑糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.8‑5.92，得到液体培养基，灭菌；(2)将人参不定根切成0.5‑1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在4‑13℃摇床培养1周，将摇床温度调至23‑25℃，培养4周收获。本发明的方法具有操作简单，培养周期短，生长成本低等优点。本发明通过低温调控人参不定根生长，在不影响生物量的前提下，使得人参皂苷的含量有了明显的提高。

Description

一种低温培养人参不定根的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种低温培养人参不定根的组织培养方法。

背景技术

人参为五加科人参属植物，是传统的中药，被誉为百草之王，东北三宝之首。人参皂苷是其主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经***、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生长等功效。目前，对人参的市场需求逐年加大，然而栽培人参所需的生长周期较长、受环境影响严重以及“老参地”等问题难以解决，使得人参原料药供应难以满足市场的需求。因此，植物组织培养技术被用来部分解决人参资源问题，生产人参药用活性成分。

目前，组培人参不定根中皂苷含量较低是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明通过控制人参不定根的培养温度，提供一种提高人参不定根中人参皂苷含量的低温培养人参不定根的组织培养方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种低温培养人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.8-5.92，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在4-13℃摇床培养1周，将摇床温度调至23-25℃，培养4周收获。

本发明的方法具有操作简单，培养周期短，生长成本低等优点。本发明通过低温调控人参不定根生长，在不影响生物量的前体下，使得人参皂苷的含量有了明显的提高。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明的液体培养基灭菌的方法优选：将液体培养基装入250mL的摇瓶中在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟。

实施例1

一种低温培养人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.85，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在4℃摇床培养1周，将摇床温度调至23℃，培养4周收获。

实施例2

一种低温培养人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.92，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在7℃摇床培养1周，将摇床温度调至25℃，培养4周收获。

实施例3

一种低温培养人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.83，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在10℃摇床培养1周，将摇床温度调至24℃，培养4周收获。

实施例4

一种低温培养人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.8，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在13℃摇床培养1周，将摇床温度调至24℃，培养4周收获。

对照例

人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.82，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，将摇床温度调至24℃培养5周收获。

人参皂苷类化合物含量的测定方法

1)色谱条件

液相色谱条件：色谱柱为Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相(A)为乙腈，流动相(B)为超纯水；梯度洗脱程序：0→35min，A:20％；35→40min，A：20％→30％；40→50min,A：30％→31％；50→60min，A:31％→32％；60→70min，A：32％→45％；70→100min,A：45％→60％；100→110min,A：60％→60％；流速1.0mL/min；进样体积为20μL；柱温35℃；检测波长203nm。

2)标准品溶液的制备

精密称取经减压干燥24小时以上的人参皂苷Rg₁、Re、Ro、Rf、Rb₁、Rg₂、Rh₁、Rc、Rb₂、Rb₃、Rd、Rg₃、Rh₂标准品各1mg，置于5mL容量瓶中，少量甲醇超声溶解，再用甲醇定容，配成0.2mg/mL的人参皂苷混合标准品储备液，密封置冰箱4℃保存。

3)样品溶液的制备

精密称取0.2g干燥的不定根样品置于100mL具塞三角瓶中，加入20mL甲醇，60℃水浴1h，趁热抽滤，重复抽提一次，合并滤液。滤液挥干，再加入10mL蒸馏水溶解，用20mL正丁醇萃取两次，收集正丁醇层，经旋转蒸发处理后，用甲醇定容至1mL。用0.22μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。检测结果见表1。

表1人参不定根总皂苷含量

组别	实施例1	实例施2	实例施3	实例施4	对照例
						总皂苷含量(mg/g)	25.57±0.31	30.23±0.65	32.30±0.71	22.40±1.11	15.59±0.90

与对照例比，实施例1-实施例4的方法获得的产物其总皂苷含量远高于对照例的含量，特别是实施例3中人参不定根中人参总皂苷含量可高达32.30mg/g，与对照例相比提高了2.07倍。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种低温培养人参不定根的组织培养方法，其特征是包括如下步骤：

(1)在3/4MS培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/L，调节pH＝5.8-5.92，得到液体培养基，灭菌；

(2)将人参不定根切成0.5-1cm的小段接种于灭菌后的液体培养基中，在4-13℃摇床培养1周，将摇床温度调至23-25℃，培养4周收获。