CN109722459A

CN109722459A - 一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109722459A
Application number: CN201811287908.XA
Authority: CN
Inventors: 郑平; 陈久洲; 孙际宾; 饶德明; 朱成超; 潘丹丹; 周文娟; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109722459B

Abstract

本发明公开了一种通过增强5‑氨基乙酰丙酸生产菌株的抗氧化能力，例如，增强所述菌株中抗氧化相关蛋白的活性来构建5‑氨基乙酰丙酸高产菌株的方法。本发明构建的5‑氨基乙酰丙酸高产菌株的5‑氨基乙酰丙酸产量显著提高，同时葡萄糖转化率也相应提高。利用本发明的菌株可高效、低成本地产生5‑氨基乙酰丙酸。

Description

一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵领域；具体地说，本发明涉及一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。在医药上ALA可以作为光敏剂用于癌症治疗和肿瘤诊断，在农业上ALA既可以作为植物生长调节剂促进作物生长，又可以作为生物农药用作杀虫剂和除草剂，此外，作为营养成分ALA在保健食品和动物营养领域的应用日渐被开发和接受。

目前ALA主要通过化学合成法生产，原料成本和污染物排放量高，导致其生产成本高昂，产品价格也居高不下，大大限制了其在农业、饲料等领域的规模化应用。近年来，通过产ALA的细菌发酵生产ALA已经得到了产业化应用，并逐渐替代传统的化学合成法，成为研究和开发的重点。目前ALA的生产菌株主要是通过诱变育种或基因工程改造获得，并且随着代谢工程和合成生物学技术的发展，基因工程菌株ALA产量已经逐步超过传统诱变获得的菌株，成为未来进一步研发的主要关注点。现有文献和专利报道的工程菌株的构建大多利用基因工程和代谢工程技术优化ALA的合成代谢途径，以实现产物产量和底物转化率的不断提升。例如CN106047916A公开了一种生产ALA的谷氨酸棒状杆菌及其构建过程，通过多步代谢工程改造摇瓶发酵ALA产量达到了2.78g/L；CN103710374A公开了一种ALA生产菌株构建及ALA生产的方法，工程菌在添加泛酸的培养基中摇瓶发酵ALA产量达到了4.12g/L。尽管ALA产量已经获得较大提升，生产成本相对于化学合成法有了一定的下降，但相对于谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸等生物基大宗化学品，目前发酵法合成ALA的技术水平仍然较低，说明现有菌株体系中仍然存在其它未知的限制ALA合成的关键因素。

因此，本领域需要开发5-氨基乙酰丙酸的高产菌株，从而能利用所述菌株高效生产5-氨基乙酰丙酸。

发明内容

本发明的目的在于提供一种5-氨基乙酰丙酸的高产菌株。

本发明还提供了所述5-氨基乙酰丙酸高产菌株的制备方法和应用。

在第一方面，本发明提供一种提高5-氨基乙酰丙酸生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产量的方法，所述方法包括增强所述菌株的抗氧化能力的步骤。

在具体的实施方式中，增强所述菌株的抗氧化能力是指增强所述菌株中抗氧化相关蛋白的活性。

在具体的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白是过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、硫醇还原酶、巯基-二硫键氧化还原酶、硫氧还蛋白还原酶或蛋氨酸亚砜还原酶。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白可以是各种来源的抗氧化相关蛋白，包括但不限于人或动物、植物、微生物。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白来源于微生物。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白源自丝状真菌、酵母菌或细菌。

优选的实施方式中，所述丝状真菌包括但不限于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)或顶孢霉属(Acremonium)中的丝状真菌。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白源自黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillusterreus)、阿拉巴马顶孢霉(Acremonium alabamensis)、嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)、特异腐质霉(Humicola insolens)和嗜松青霉(Penicillium pinophilum)和灰腐质霉(Humicolagrisea)；

优选的实施方式中，所述酵母菌包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕节酵母(Pichia pastoris)。

优选的实施方式中，所述细菌包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、变形杆菌属(Proteus)、根瘤菌属(Rhizobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、短乳杆菌属(Lactobacillus)以及嗜热类细菌，如栖热菌属(Thermus)等。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白源自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)等。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白源自大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

在进一步的优选实施方式中，所述抗氧化相关蛋白是源自大肠杆菌的过氧化氢酶I(KatG)、过氧化氢酶II(KatE)、烷基过氧化物酶(AhpC、AhpF)、谷氧还蛋白I(GrxA)、硫氧还蛋白II(TrxC)、蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)、超氧化物歧化酶(SodA、SodB、SodC)，或源自谷氨酸棒状杆菌中的过氧化氢酶(NCgl0251)、分支硫醇过氧化物酶(NCgl2502)、分支硫醇还原酶(NCgl1928)、分支硫醇氧化还原蛋白(NCgl2445)和硫氧还蛋白(NCgl2985)。

在进一步的优选实施方式中，所述抗氧化相关蛋白是如SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.45所示的过氧化氢酶，或同样来源于大肠杆菌且氨基酸序列与SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.45具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有过氧化氢酶功能的多肽；

如SEQ ID No.37、SEQ ID No.38所示的烷基过氧化物酶，或同样来源于大肠杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.37、SEQ ID No.38具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有烷基过氧化物酶功能的多肽；

如SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44所示的超氧化物歧化酶，或同样来源于大肠杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有超氧化物歧化酶功能的多肽；

如SEQ ID No.39所示的谷氧还蛋白I，或同样来源于大肠杆菌且氨基酸序列与SEQID No.39具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有谷氧还蛋白功能的多肽；

如SEQ ID No.40所示的硫氧还蛋白，或同样来源于大肠杆菌且氨基酸序列与SEQID No.40具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有硫氧还蛋白功能的多肽；SEQ ID No.49所示的硫氧还蛋白，或同样来源于谷氨酸棒杆菌且氨基酸序列与SEQID No.49具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有硫氧还蛋白功能的多肽；

如SEQ ID No.46所示的分支硫醇过氧化物酶，或同样来源于谷氨酸棒杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.46具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有分支硫醇过氧化物酶功能的多肽；

如SEQ ID No.47所示的分支硫醇还原酶，或同样来源于谷氨酸棒杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.47具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有分支硫醇还原酶功能的多肽；

如SEQ ID No.48所示的分支硫醇氧化还原蛋白，或同样来源于谷氨酸棒杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.48具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有分支硫醇氧化还原蛋白功能的多肽；

如SEQ ID No.41所示的蛋氨酸亚砜还原酶A，或同样来源于谷氨酸棒杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.41具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有蛋氨酸亚砜还原酶A功能的多肽。在进一步的优选实施方式中，所述抗氧化相关蛋白是如SEQID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.45所示的过氧化氢酶，如SEQ ID No.37、SEQ IDNo.38所示的烷基过氧化物酶，如SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44所示的超氧化物歧化酶，如SEQ ID No.39所示的谷氧还蛋白I，如SEQ ID No.40、SEQ ID No.49所示的硫氧还蛋白，如SEQ ID No.46所示的分支硫醇过氧化物酶，如SEQ ID No.47所示的分支硫醇还原酶，如SEQ ID No.48所示的分支硫醇氧化还原蛋白，如SEQ ID No.41所示的蛋氨酸亚砜还原酶A。

在优选的实施方式中，所述抗氧化蛋白：(a)具有SEQ ID No.35-49分别所示的氨基酸序列；或者

(b)由SEQ ID No.35-49分别所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20、更优选1-10、更优选1-6、更优选1-3、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列分别如SEQ ID No.35-49所示蛋白功能的衍生蛋白；或

(c)在SEQ ID No.35-49分别所示氨基酸序列的两端经过一个或几个，优选1-20、更优选1-10、更优选1-6、更优选1-3、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的且具有氨基酸序列分别如SEQ ID No.35-49所示蛋白功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述增强抗氧化相关蛋白的活性可通过以下方法之一或组合来实现：表达该蛋白的同源或异源的编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株本身具有5-氨基乙酰丙酸合成能力或是5-氨基乙酰丙酸高产菌株。

在优选的实施方式中，所述菌株构建方法还包括强化5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源性5-氨基乙酰丙酸合成途径。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸合成途径是指5-氨基乙酰丙酸合成相关酶，包括但不限于5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶；优选5-氨基乙酰丙酸合成酶。

在优选的实施方式中，所述菌株构建方法还包括增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶的活性。

在优选的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸产量。

在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等；优选大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。

在优选的实施方式中，所述菌株的摇瓶5-氨基乙酰丙酸产量高于5.6g/L。

在第二方面，本发明提供一种构建5-氨基乙酰丙酸高产菌株的方法，所述方法包括：

增强所述菌株的抗氧化能力的步骤。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白来源于微生物。

在第三方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株，所述菌株的抗氧化能力增强。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白来源于微生物。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白源自黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillusterreus)、阿拉巴马顶孢霉(Acremonium alabamensis)、嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)、特异腐质霉(Humicola insolens)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)和灰腐质霉(Humicola grisea)；

在进一步的优选实施方式中，所述抗氧化相关蛋白是源自大肠杆菌的过氧化氢酶I(KatG)、过氧化氢酶II(KatE)、烷基过氧化物酶(AhpC、AhpF)、谷氧还蛋白I(GrxA)、硫氧还蛋白II(TrxC)、蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)、超氧化物歧化酶(SodA、SodB、SodC)，或源自谷氨酸棒状杆菌中的过氧化氢酶(NCgl0251)、分支硫醇过氧化物酶(NCgl2502)、分支硫醇还原酶(NCgl1928)、分支硫醇氧化还原蛋白(NCgl2445)、硫氧还蛋白(NCgl2985)。

如SEQ ID No.41所示的蛋氨酸亚砜还原酶A，或同样来源于谷氨酸棒杆菌且氨基酸序列与SEQ ID No.41具有80％，优选90％，更优选95％，最优选98％以上同源性并具有蛋氨酸亚砜还原酶A功能的多肽。

在进一步的优选实施方式中，所述抗氧化相关蛋白是如SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.45所示的过氧化氢酶；如SEQ ID No.37、SEQ ID No.38所示的烷基过氧化物酶；如SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44所示的超氧化物歧化酶；如SEQ IDNo.39所示的谷氧还蛋白I；如SEQ ID No.40、SEQ ID No.49所示的硫氧还蛋白；如SEQ IDNo.46所示的分支硫醇过氧化物酶、如SEQ ID No.47所示的分支硫醇还原酶、如SEQ IDNo.48所示的分支硫醇氧化还原蛋白、如SEQ ID No.41所示的蛋氨酸亚砜还原酶A。

在优选的实施方式中，所述抗氧化蛋白：(a)具有SEQ ID No.35-49分别所示的氨基酸序列；或者(b)由SEQ ID No.35-49分别所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20、更优选1-10、更优选1-6、更优选1-3、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列分别如SEQ ID No.35-49所示蛋白功能的衍生蛋白；或

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸高产菌株中的5-氨基乙酰丙酸合成途径得到强化或引入了外源性5-氨基乙酰丙酸合成途径。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸高产菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶的活性增强。

在第四方面，本发明提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：

1)培养第三方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和

2)任选地从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

在第五方面，本发明提供第三方面所述的5-氨基乙酰丙酸高产菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的下游产物。

在一优选例中，所述以ALA为前体的下游产物是血红素或维生素B12。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了大肠杆菌中抗氧化相关蛋白的表达对ALA合成的影响；

图2显示了超氧化物歧化酶表达对ALA合成的影响；

图3显示了谷氨酸棒状杆菌中过氧化氢酶表达对ALA合成的影响；

图4显示了谷氨酸棒状杆菌中其他抗氧化相关蛋白表达对ALA合成的影响。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株的抗氧化能力，例如增强抗氧化相关蛋白的活性可以有效提高ALA产量。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对于该菌株是“外源性”的。

本文所用的术语“内源性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

本文所用的术语“增强蛋白质的活性”指的是通过修饰蛋白增强在微生物中蛋白质的细胞内活性与以自然状态具备的蛋白质活性相比提高细胞内活性。本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，包括但不限于通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。

本文所用的术语“增强”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何已经的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。

本文所用的术语“引入蛋白质的活性”可以通过本领域已知的方法进行，包括但不限于，如：将包含编码蛋白质的多核苷酸序列的多核苷酸***到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白质的多核苷酸的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白质的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白质的多核苷酸的信使RNA的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白质的多核苷酸本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白质活性的方法。

如上面所述，调控序列包括能够起始转录的启动子，用于转录调控的任何操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列，调控转录和翻译终止的序列。对调控序列的修改包括但不限于，如：在多核苷酸序列中缺失、***、保守突变或非保守突变、或其组合引入修改，也可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列置换原始的多核苷酸序列。载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的热河载体构建。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体***到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸***染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式***到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。

抗氧化能力与抗氧化相关蛋白

本发明通过增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株的抗氧化能力来提高ALA产量。基于本发明的教导，本领域技术人员可以知晓提高菌株的抗氧化能力的各种具体技术手段。在具体的实施方式中，通过增强菌株中抗氧化相关蛋白的活性来增强高菌株的抗氧化能力。

本文所用的术语“抗氧化相关蛋白”是指菌株中与该菌株的抗氧化活性相关的蛋白。基于本发明的教导，本领域技术人员知晓菌株中的抗氧化相关蛋白。例如，本文所述的抗氧化相关蛋白包括但不限于过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、硫醇还原酶、氧化还原蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶。

更具体地，所述过氧化氢酶，是催化过氧化氢生成氧气和水的酶，包括但不限于源自大肠杆菌过氧化氢酶I(KatG)、过氧化氢酶II(KatE)以及谷氨酸棒状杆菌的过氧化氢酶(NCgl0251)；

所述超氧化物歧化酶，是能催化生物体内超氧自由基(O^2-)发生歧化反应的酶，包括但不限于源自大肠杆菌的超氧化物歧化酶A(SodA)、超氧化物歧化酶B(SodB)、超氧化物歧化酶C(SodC)；

所述过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，包括但不限于烷基过氧化物酶(AhpC、AhpF)、分支硫醇过氧化物酶(NCgl2502)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)；

所述硫醇还原酶是催化氧化型小分子硫醇还原为还原型硫醇的酶，包括但不限于分支硫醇还原酶(NCgl1928)、谷胱甘肽还原酶(Gor)；

所述巯基-二硫键氧化还原酶是在小分子硫醇存在的条件下，还原蛋白质二硫键成为蛋白质双硫醇的酶，包括但不限于谷氧还蛋白(GrxA、GrxB、GrxC、)、硫氧还蛋白(TrxA、TrxC、NCgl2985)、分支硫醇氧化还原蛋白(NCgl2445)；

所述蛋氨酸亚砜还原酶是以硫氧化还原蛋白的形式将甲硫氨酸-S-亚砜(MetSO)还原为蛋氨酸的酶，包括但不限于蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)和蛋氨酸亚砜还原酶B(MsrB)。

本发明所述的“抗氧化相关蛋白”可以是各种来源的蛋白，包括但不限于人或动物(牛、猪肝脏)、植物、微生物。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白来源于微生物。

在优选的实施方式中，所述抗氧化相关蛋白源自黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillusterreus)、阿拉巴马顶孢霉(Acremonium alabamensis)、嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)和灰腐质霉(Humicolagrisea)；

本发明所述的“抗氧化相关蛋白”还包括可以调控抗氧化蛋白转录翻译的调控蛋白，例如大肠杆菌氧化压力调控因子OxyR和SoxR。

此外，本发明所述的硫醇过氧化物酶、硫醇还原酶和硫醇氧化还原蛋白，其中硫醇不仅包括文中所述的谷胱甘肽和分支硫醇，还包括生物体内广泛存在小分子硫醇，例如卵类硫醇、麦角硫醇、芽孢硫醇等。

本发明的菌株及其构建方法和用途

本发明人发现提高5-氨基乙酰丙酸(ALA)的生产菌株的抗氧化能力，例如增强生产菌株中的抗氧化相关蛋白，包括但不限于过氧化物酶、超氧化物歧化酶、硫醇还原酶、谷氧还蛋白、硫氧还蛋白、分支硫醇氧化还原蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶的活性，能够显著提高该生产菌株的ALA产量。在此基础上，本发明提供了利用所述方法构建的ALA高产菌株和利用所述菌株制备ALA的方法。

基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可以理解，本发明可以应用于本身具有一定5-氨基乙酰丙酸合成能力的菌株，也可以应用于本身不具备5-氨基乙酰丙酸合成能力，但通过，例如外源性导入5-氨基乙酰丙酸合成途径从而具备5-氨基乙酰丙酸合成能力的菌株，藉此获得5-氨基乙酰丙酸高产菌株；本发明也可以应用于5-氨基乙酰丙酸生产菌株，甚至是5-氨基乙酰丙酸高产菌株，从而进一步提高所述菌株的5-氨基乙酰丙酸生产能力。

本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径”是指5-氨基乙酰丙酸合成相关酶，即，微生物中产生5-氨基乙酰丙酸的具体途径中包括的各种酶，包括但不限于5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶，等等；优选5-氨基乙酰丙酸合成酶。

本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生5-氨基乙酰丙酸。这些菌株虽然不同，但它们合成5-氨基乙酰丙酸的合成体系、途径却是类似的。因此，本领域普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术可以明白，本发明的菌株可以是任何可用于产生5-氨基乙酰丙酸的菌株，包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。在具体的实施方式中，所述菌株优选大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。

本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株的用途

本领域技术人员应明白，本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株不仅可用于产生5-氨基乙酰丙酸，还可用于产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的衍生物，例如血红素或VB12。

本发明的优点：

1.本发明菌株的5-氨基乙酰丙酸产量大大提高；

2.本发明发现增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中抗氧化相关蛋白的活性能够显著提高生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产量，从而为工程改造5-氨基乙酰丙酸生产菌株或优化5-氨基乙酰丙酸生产菌株的生产工艺提供了新的思路；

3.本发明提供的提高工程菌ALA产量的方法还能进一步提高菌株生长性能和底物葡萄糖转化率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

实施例

材料与方法

本发明实施例所用的DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；

酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。

质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行；

质粒构建测序验证由金唯智完成；

DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。

LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。

抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL。

ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液加入100μL pH 4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL 70％高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。

葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。

实施例1.ALA合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶共表达载体构建

根据NCBI公布的沼泽红假单胞菌ATCC17001的hemA基因序列(GenBank:JQ048720.1)和大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物hemA-F/R和ppc-F/R，并以pZPA6质粒(CN103981203B)为模板PCR扩增得到hemA基因和带有自身启动子的ppc基因片段，PCR扩增参数为94℃5min；94℃20s，55℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸5min。片段回收后酶切处理，连接pTrc99A质粒，获得hemA和ppc共表达的重组载体并命名为pZCA40。

实施例2.大肠杆菌抗氧化相关蛋白表达载体构建

根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列分别设计引物katG-F/R、katE-F/R、ahpCF-F/R、grxA-F/R、trxC-F/R、msrA-F/R，以MG1655基因组为模板通过PCR扩增分别得到带有自身启动子的大肠杆菌过氧化氢酶I(氨基酸序列如SEQ ID No.35所示)、过氧化氢酶II(氨基酸序列如SEQ ID No.36所示)，烷基过氧化物酶(氨基酸序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示)、谷氧还蛋白I(氨基酸序列如SEQ ID No.39所示)、硫氧还蛋白II(氨基酸序列如SEQ ID No.40所示)，蛋氨酸亚砜还原酶A(氨基酸序列如SEQ ID No.41所示)的编码基因katG、katE、ahpC-ahpF、grxA、trxC和msrA，PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃5min，94℃20s，58℃20s，72℃2min，循环30次，72℃延伸5min。目的片段用NotI酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样处理的pZCA40载体连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证和测序验证，正确的重组载体分别命名为pZCA40-katG、pZCA40-katE、pZCA40-ahpCF、pZCA40-grxA、pZCA40-trxC和pZCA40-msrA。

实施例3.增强大肠杆菌抗氧化性对ALA合成的影响

为了验证强化大肠杆菌抗氧化性对ALA合成的影响，分别将上述载体及其对照载体pZCA40转入MG1655菌株中，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化产物涂布氨苄青霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株MG1655/pZCA40、MG1655/pZCA40-katG、MG1655/pZCA40-katE、MG1655/pZCA40-ahpCF、MG1655/pZCA40-grxA、MG1655/pZCA40-trxC和MG1655/pZCA40-msrA。

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养28h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为添加酵母粉的M9培养基，主要成分为：Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄ 2mM，CaCl₂ 0.1mM，葡萄糖15g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸4g/L。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。

重组菌发酵结果见图1，对照菌株MG1655/pZCA40(Control)发酵28h后ALA的产量为1.46g/L，过氧化氢酶(KatG和KatE)表达菌株ALA产量分别是对照菌株的1.81倍和1.93倍，达到2.64g/L和2.81g/L，同时菌株生长也有较大幅度的改善。

烷基过氧化物酶表达菌株(AhpCF)ALA产量达到了2.07g/L，是对照菌株的1.42倍，但对生长几乎没有影响，因此单位菌体ALA的合成能力得到明显提升。

谷氧还蛋白I(GrxA)、硫氧还蛋白II(TrxC)和蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)表达菌株ALA产量分别是对照菌株的2.1、1.48和1.54倍，硫氧还蛋白II表达菌株菌体生长改善明显，而谷氧还蛋白和蛋氨酸亚砜还原酶A表达菌株单位菌体ALA产量分别是对照菌株的2.26和1.39倍，提升效果显著。

上述结果表明通过增强大肠杆菌抗氧化相关蛋白的表达提升菌体抗氧化能力可以有效提高工程菌ALA产量。

实施例4.超氧化物歧化酶表达载体的构建

根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列分别设计引物J23101-sodA-F/R、J23101-sodB-F/R和J23101-sodC-F/R，以MG1655基因组为模板通过PCR扩增分别得到带有J23101启动子的大肠杆菌超氧化物歧化酶(氨基酸序列如SEQ ID No.42-44所示)的编码基因sodA、sodB和sodC，PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃5min，94℃20s，58℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸5min。目的片段用XbaI和SacI酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样处理的pZCA9载体(CN103710374B)连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证和测序验证，正确的重组载体分别命名为pZZCCA3、pZZCCA4和pZZCCA5。

实施例5超氧化物歧化酶表达对ALA合成的影响

为了验证超氧化物歧化酶表达对ALA合成的影响，将构建正确的重组载体pZZCA3、pZZCA4、pZZCA5分别转化至E.coli BW25113/pZGA24(CN103981203B)菌株中，获得重组工程菌株BW25113/pZGA24/pZZCA3、BW25113/pZGA24/pZZCA4和BW25113/pZGA24/pZZCA5。

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养17h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为添加琥珀酸和甘氨酸的LB培养基，主要成分为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琥珀酸10g/L、葡萄糖10g/L、甘氨酸4g/L。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。

重组菌发酵结果见图2，对照菌株BW24/pZCA9的ALA产量为0.94g/L，超氧化物歧化酶(SodA、SodB和SodC)表达菌株ALA产量达到了1.06g/L，1.14g/L和1.13g/L，分别是对照菌株的1.13、1.21和1.20倍，表明通过表达超氧化物歧化酶增强工程菌抗氧化能力可显著提高ALA产量。

实施例6.谷氨酸棒状杆菌过氧化氢酶表达载体的构建

根据NCBI公布的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的过氧化氢酶(氨基酸序列如SEQ ID No.45所示)编码基因NCgl0251的序列(GeneID:1021318)，设计引物Ncgl0251-F/R，以ATCC 13032基因组为模板通过PCR扩增得到目的基因，PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃10min，94℃20s，58℃30s，72℃2min，循环30次，72℃延伸5min。目的片段用XbaI酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的pZWA2载体(WO2014121724A1)连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板培养36h，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，正确的转化子进行测序验证，将正确的重组载体命名为pZWA2-Ncgl0251。

同时，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655来源的过氧化氢酶I(氨基酸序列如SEQ IDNo.35所示)编码基因katG(GeneID:948431)设计引物katG-F2/R2，以MG1655基因组为模板通过PCR扩增得到带带有外加启动子的基因片段，PCR扩增参数为：94℃5min，94℃20s，58℃20s，72℃2min，循环30次，72℃延伸5min。目的片段用XbaI酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的pZWA2载体连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板培养36h，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，正确的转化子进行测序验证，将正确的重组载体命名为pZWA2-katG。

实施例7.过氧化氢酶表达对谷氨酸棒状杆菌ALA合成的影响

为了验证过氧化氢酶表达对ALA合成的影响，分别将上述载体转入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株中。转化产物涂布卡那霉素抗性的平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株13032/pZWA2-NCgl0251和13032/pZWA2-katG。

将上述重组菌及其对照菌株13032/pZWA2单菌落分别接种50mL含有25μg/mL卡那霉素、2/0g/L葡萄糖和3g/L玉米浆的LB液体培养基，30℃，200rpm培养12h。按照初始OD为0.5转接装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶，30℃，200rpm培养3h后加入终浓度为100μM的IPTG，诱导培养36h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄ 2mM，CaCl₂ 0.1mM，甘氨酸4g/L，pH 7.0，卡那霉素终浓度为25μg/mL。发酵过程中用氨水调节pH稳定在7.0左右，ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。

重组菌发酵结果见图3，对照菌株13032/pZWA2发酵36h后ALA的产量为3.20g/L，谷氨酸棒状杆菌自身来源的过氧化氢酶表达菌株ALA产量比对照菌株提高了15％，而大肠杆菌来源的过氧化氢酶I在谷氨酸棒状杆菌中表达后ALA产量比对照菌株提高17％，同时葡萄糖转化率也比对照菌株提高36％，产量和底物转化率的提高可大幅降低产物生产成本。

实施例8.谷氨酸棒状杆菌其他抗氧化相关蛋白表达载体的构建

根据NCBI公布的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的基因组序列分别设计引物NCgl2502-F/R、NCgl1928-F/R、NCgl2445-F/R和NCgl2985-F/R，以ATCC 13032的基因组为模板通过PCR扩增分别得到带有自身启动子的谷氨酸棒状杆菌分支硫醇过氧化物酶(氨基酸序列如SEQ ID No.46所示)、分支硫醇还原酶(氨基酸序列如SEQID No.47所示)、分支硫醇氧化还原蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.48所示)、硫氧还蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.49所示)的编码基因NCgl2502(GeneID:1020537)、NCgl1928(GeneID:1019960)、NCgl2445(GeneID:1020480)和NCgl2985(GeneID:1021035)，PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃10min，94℃20s，58℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸5min。目的片段用XbaI酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的pZWA2载体连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板培养36h，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，正确的转化子进行测序验证，将正确的重组载体命名为pZWA2-NCgl2502、pZWA2-NCgl1928、pZWA2-NCgl2445和pZWA2-NCgl2985。

实施例9.谷氨酸棒状杆菌抗氧化相关蛋白表达对ALA合成的影响

为了验证抗氧化相关蛋白表达对ALA合成的影响，分别将上述重组载体转入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株中。转化产物涂布卡那霉素抗性的平板，培养36h后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株13032/pZWA2-NCgl2502、13032/pZWA2-NCgl1928、13032/pZWA2-NCgl2445和13032/pZWA2-NCgl2985。

摇瓶发酵验证过程同实施例5，由于该部分蛋白主要涉及氧化修复，因此发酵时间延长至48h，以充分发挥其抗氧化效果。发酵结果见图4，对照菌株13032/pZWA2发酵48h后ALA的产量为3.81g/L，而分支硫醇过氧化物酶、分支硫醇还原酶、分支硫醇氧化还原蛋白、硫氧还蛋白表达菌株ALA产量分别比对照菌株提高19％、40％、47％和41％，同时葡萄糖转化率和单位菌体ALA产量也均有较大幅度的提升，最大分别提升22％和31％。因此本发明提供的提高工程菌株ALA产量的方法同样适用于谷氨酸棒状杆菌等发酵工业及ALA生产常用微生物。

本发明实施例中所用的引物以及相关抗氧化蛋白的序列见下表：

讨论：本发明通过增强ALA生产菌株中抗氧化相关蛋白的活性显著提高了ALA的产量，其产生的技术效果甚至比直接对ALA合成途径中的相关蛋白进行改造的效果更为显著，更加出乎意料的是这些蛋白与ALA合成途径并不直接相关。

根据CN103981203A和WO2014121724A1所述，本发明的对照菌株(ALA+ppc)本身已经是本领域公认的ALA高产菌株，而本发明的菌株无论在ALA的绝对产量，还是在葡萄糖转化率方面与对照菌株相比均得到了显著的提升，与本领域现有技术相比也具备较大优势，工艺放大后实际效果有望进一步提升，因而具有极其显著的经济价值和社会价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法与应用

<130> P2018-1735

<150> CN2017110476130

<151> 2017-10-31

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgcgaattc taactttaag aaggagatat acat 34

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatagcggcc gctcaggccg ccttggcgag accga 35

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcatctaga tatccgcggt atccgaccta cacctttggt 40

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaagcggcc gcggacttct gtggaatgca tagt 34

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taagcggccg ccctcattac ttgaaggata tg 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attgcggccg catgagagat ccagtgtgta g 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taagcggccg cggacatagc taataatctg g 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taagcggccg ccttgagact gctgacaaac g 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taagcggccg ccagagccag taaaagtatc t 31

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taagcggccg caggtgaatc ttacttcttc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atagcggccg cgagtcgctt accgacagca 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atagcggccg ctcattctgg caagagctgg 30

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atagcggccg cggtacgttt atcagaatca tc 32

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atagcggccg ccgtaactgg agaacagcgt t 31

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aatgcggccg cgataacccc tcgacctgta ga 32

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atagcggccg catgcaaaac tgcctgatac g 31

<210> 17

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctctagatt tacagctagc tcagtcctag gtattatgct agcaagaagg agatatacat 60

atgagctata ccctgcca 78

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgagctctta ttttttcgcc gcaa 24

<210> 19

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctctagatt tacagctagc tcagtcctag gtattatgct agcaagaagg agatatacat 60

atgtcattcg aattacctgc 80

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgagctctta tgcagcgaga tttttc 26

<210> 21

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gctctagatt tacagctagc tcagtcctag gtattatgct agcaagaagg agatatacat 60

atgaaacgtt ttagtctggc 80

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgagctctta cttaattaca ccacaggc 28

<210> 23

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gctctagaac taatttgtca gcgattggag taatagttaa attaggtaaa cagtgcaagg 60

agatatagat atgtctgaga agtcagcagc ag 92

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctctagatt aagccttctt ctggaggtaa agc 33

<210> 25

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gctctagaac taatttgtca gcgattggag taatagttaa attaggtaaa cagtgcaagg 60

agatatagat atgagcacgt cagacgatat cc 92

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctctagatt acagcaggtc gaaacggtcg agg 33

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aactctagac tggatgaggt agtaaccgt 29

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aactctagaa agtgtaactg ttgccactgg 30

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acatctagaa aagagcatcg gatggcttc 29

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aactctagac gcagttaact tgacgtggaa 30

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acctctagag tttggtggag caa 23

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aactctagat gcatggctca cctgttcgat 30

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aactctagat cgcttcgtca ccaacaagac t 31

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aactctagac ctgctccttc catcattcat g 31

<210> 35

<211> 726

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 35

Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys

1 5 10 15

Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr

20 25 30

Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln

35 40 45

His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys

50 55 60

Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala

65 70 75 80

Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr

85 90 95

Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg

100 105 110

Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala

115 120 125

Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg

130 135 140

Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala

145 150 155 160

Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe

165 170 175

Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp

180 185 190

Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His

195 200 205

Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu

210 215 220

Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser

225 230 235 240

Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp

245 250 255

Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr

260 265 270

His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala

275 280 285

Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly

290 295 300

Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln

305 310 315 320

Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr

325 330 335

Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala

340 345 350

Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys

355 360 365

Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro

370 375 380

Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe

385 390 395 400

Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met

405 410 415

Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu

420 425 430

Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln

435 440 445

Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val

450 455 460

Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly

465 470 475 480

Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro

485 490 495

Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val

500 505 510

Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile

515 520 525

Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala

530 535 540

Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg

545 550 555 560

Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala

565 570 575

Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu

580 585 590

Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu

595 600 605

Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Ala Asn Phe Asp

610 615 620

Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn

625 630 635 640

Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr

645 650 655

Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu

660 665 670

Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser

675 680 685

Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu

690 695 700

Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu

705 710 715 720

Asp Arg Phe Asp Leu Leu

725

<210> 36

<211> 753

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 36

Met Ser Gln His Asn Glu Lys Asn Pro His Gln His Gln Ser Pro Leu

1 5 10 15

His Asp Ser Ser Glu Ala Lys Pro Gly Met Asp Ser Leu Ala Pro Glu

20 25 30

Asp Gly Ser His Arg Pro Ala Ala Glu Pro Thr Pro Pro Gly Ala Gln

35 40 45

Pro Thr Ala Pro Gly Ser Leu Lys Ala Pro Asp Thr Arg Asn Glu Lys

50 55 60

Leu Asn Ser Leu Glu Asp Val Arg Lys Gly Ser Glu Asn Tyr Ala Leu

65 70 75 80

Thr Thr Asn Gln Gly Val Arg Ile Ala Asp Asp Gln Asn Ser Leu Arg

85 90 95

Ala Gly Ser Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp Phe Ile Leu Arg Glu

100 105 110

Lys Ile Thr His Phe Asp His Glu Arg Ile Pro Glu Arg Ile Val His

115 120 125

Ala Arg Gly Ser Ala Ala His Gly Tyr Phe Gln Pro Tyr Lys Ser Leu

130 135 140

Ser Asp Ile Thr Lys Ala Asp Phe Leu Ser Asp Pro Asn Lys Ile Thr

145 150 155 160

Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Gln Gly Gly Ala Gly Ser Ala

165 170 175

Asp Thr Val Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ala Thr Lys Phe Tyr Thr Glu

180 185 190

Glu Gly Ile Phe Asp Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile

195 200 205

Gln Asp Ala His Lys Phe Pro Asp Phe Val His Ala Val Lys Pro Glu

210 215 220

Pro His Trp Ala Ile Pro Gln Gly Gln Ser Ala His Asp Thr Phe Trp

225 230 235 240

Asp Tyr Val Ser Leu Gln Pro Glu Thr Leu His Asn Val Met Trp Ala

245 250 255

Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg Thr Met Glu Gly Phe

260 265 270

Gly Ile His Thr Phe Arg Leu Ile Asn Ala Glu Gly Lys Ala Thr Phe

275 280 285

Val Arg Phe His Trp Lys Pro Leu Ala Gly Lys Ala Ser Leu Val Trp

290 295 300

Asp Glu Ala Gln Lys Leu Thr Gly Arg Asp Pro Asp Phe His Arg Arg

305 310 315 320

Glu Leu Trp Glu Ala Ile Glu Ala Gly Asp Phe Pro Glu Tyr Glu Leu

325 330 335

Gly Phe Gln Leu Ile Pro Glu Glu Asp Glu Phe Lys Phe Asp Phe Asp

340 345 350

Leu Leu Asp Pro Thr Lys Leu Ile Pro Glu Glu Leu Val Pro Val Gln

355 360 365

Arg Val Gly Lys Met Val Leu Asn Arg Asn Pro Asp Asn Phe Phe Ala

370 375 380

Glu Asn Glu Gln Ala Ala Phe His Pro Gly His Ile Val Pro Gly Leu

385 390 395 400

Asp Phe Thr Asn Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ser Tyr Thr

405 410 415

Asp Thr Gln Ile Ser Arg Leu Gly Gly Pro Asn Phe His Glu Ile Pro

420 425 430

Ile Asn Arg Pro Thr Cys Pro Tyr His Asn Phe Gln Arg Asp Gly Met

435 440 445

His Arg Met Gly Ile Asp Thr Asn Pro Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser

450 455 460

Ile Asn Asp Asn Trp Pro Arg Glu Thr Pro Pro Gly Pro Lys Arg Gly

465 470 475 480

Gly Phe Glu Ser Tyr Gln Glu Arg Val Glu Gly Asn Lys Val Arg Glu

485 490 495

Arg Ser Pro Ser Phe Gly Glu Tyr Tyr Ser His Pro Arg Leu Phe Trp

500 505 510

Leu Ser Gln Thr Pro Phe Glu Gln Arg His Ile Val Asp Gly Phe Ser

515 520 525

Phe Glu Leu Ser Lys Val Val Arg Pro Tyr Ile Arg Glu Arg Val Val

530 535 540

Asp Gln Leu Ala His Ile Asp Leu Thr Leu Ala Gln Ala Val Ala Lys

545 550 555 560

Asn Leu Gly Ile Glu Leu Thr Asp Asp Gln Leu Asn Ile Thr Pro Pro

565 570 575

Pro Asp Val Asn Gly Leu Lys Lys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Tyr Ala

580 585 590

Ile Pro Asp Gly Asp Val Lys Gly Arg Val Val Ala Ile Leu Leu Asn

595 600 605

Asp Glu Val Arg Ser Ala Asp Leu Leu Ala Ile Leu Lys Ala Leu Lys

610 615 620

Ala Lys Gly Val His Ala Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Met Gly Glu Val

625 630 635 640

Thr Ala Asp Asp Gly Thr Val Leu Pro Ile Ala Ala Thr Phe Ala Gly

645 650 655

Ala Pro Ser Leu Thr Val Asp Ala Val Ile Val Pro Cys Gly Asn Ile

660 665 670

Ala Asp Ile Ala Asp Asn Gly Asp Ala Asn Tyr Tyr Leu Met Glu Ala

675 680 685

Tyr Lys His Leu Lys Pro Ile Ala Leu Ala Gly Asp Ala Arg Lys Phe

690 695 700

Lys Ala Thr Ile Lys Ile Ala Asp Gln Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu

705 710 715 720

Ala Asp Ser Ala Asp Gly Ser Phe Met Asp Glu Leu Leu Thr Leu Met

725 730 735

Ala Ala His Arg Val Trp Ser Arg Ile Pro Lys Ile Asp Lys Ile Pro

740 745 750

Ala

<210> 37

<211> 187

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 37

Met Ser Leu Ile Asn Thr Lys Ile Lys Pro Phe Lys Asn Gln Ala Phe

1 5 10 15

Lys Asn Gly Glu Phe Ile Glu Ile Thr Glu Lys Asp Thr Glu Gly Arg

20 25 30

Trp Ser Val Phe Phe Phe Tyr Pro Ala Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro

35 40 45

Thr Glu Leu Gly Asp Val Ala Asp His Tyr Glu Glu Leu Gln Lys Leu

50 55 60

Gly Val Asp Val Tyr Ala Val Ser Thr Asp Thr His Phe Thr His Lys

65 70 75 80

Ala Trp His Ser Ser Ser Glu Thr Ile Ala Lys Ile Lys Tyr Ala Met

85 90 95

Ile Gly Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Arg Asn Phe Asp Asn Met Arg

100 105 110

Glu Asp Glu Gly Leu Ala Asp Arg Ala Thr Phe Val Val Asp Pro Gln

115 120 125

Gly Ile Ile Gln Ala Ile Glu Val Thr Ala Glu Gly Ile Gly Arg Asp

130 135 140

Ala Ser Asp Leu Leu Arg Lys Ile Lys Ala Ala Gln Tyr Val Ala Ser

145 150 155 160

His Pro Gly Glu Val Cys Pro Ala Lys Trp Lys Glu Gly Glu Ala Thr

165 170 175

Leu Ala Pro Ser Leu Asp Leu Val Gly Lys Ile

180 185

<210> 38

<211> 521

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 38

Met Leu Asp Thr Asn Met Lys Thr Gln Leu Lys Ala Tyr Leu Glu Lys

1 5 10 15

Leu Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Ala Thr Leu Asp Asp Ser Ala Lys

20 25 30

Ser Ala Glu Ile Lys Glu Leu Leu Ala Glu Ile Ala Glu Leu Ser Asp

35 40 45

Lys Val Thr Phe Lys Glu Asp Asn Ser Leu Pro Val Arg Lys Pro Ser

50 55 60

Phe Leu Ile Thr Asn Pro Gly Ser Asn Gln Gly Pro Arg Phe Ala Gly

65 70 75 80

Ser Pro Leu Gly His Glu Phe Thr Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Gly Gly His Pro Ser Lys Glu Ala Gln Ser Leu Leu Glu Gln Ile

100 105 110

Arg His Ile Asp Gly Asp Phe Glu Phe Glu Thr Tyr Tyr Ser Leu Ser

115 120 125

Cys His Asn Cys Pro Asp Val Val Gln Ala Leu Asn Leu Met Ser Val

130 135 140

Leu Asn Pro Arg Ile Lys His Thr Ala Ile Asp Gly Gly Thr Phe Gln

145 150 155 160

Asn Glu Ile Thr Asp Arg Asn Val Met Gly Val Pro Ala Val Phe Val

165 170 175

Asn Gly Lys Glu Phe Gly Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Glu Ile Val

180 185 190

Ala Lys Ile Asp Thr Gly Ala Glu Lys Arg Ala Ala Glu Glu Leu Asn

195 200 205

Lys Arg Asp Ala Tyr Asp Val Leu Ile Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly

210 215 220

Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Ser Ala Arg Lys Gly Ile Arg Thr Gly Leu

225 230 235 240

Met Gly Glu Arg Phe Gly Gly Gln Ile Leu Asp Thr Val Asp Ile Glu

245 250 255

Asn Tyr Ile Ser Val Pro Lys Thr Glu Gly Gln Lys Leu Ala Gly Ala

260 265 270

Leu Lys Val His Val Asp Glu Tyr Asp Val Asp Val Ile Asp Ser Gln

275 280 285

Ser Ala Ser Lys Leu Ile Pro Ala Ala Val Glu Gly Gly Leu His Gln

290 295 300

Ile Glu Thr Ala Ser Gly Ala Val Leu Lys Ala Arg Ser Ile Ile Val

305 310 315 320

Ala Thr Gly Ala Lys Trp Arg Asn Met Asn Val Pro Gly Glu Asp Gln

325 330 335

Tyr Arg Thr Lys Gly Val Thr Tyr Cys Pro His Cys Asp Gly Pro Leu

340 345 350

Phe Lys Gly Lys Arg Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Asn Ser Gly Val

355 360 365

Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Gly Ile Val Glu His Val Thr Leu Leu

370 375 380

Glu Phe Ala Pro Glu Met Lys Ala Asp Gln Val Leu Gln Asp Lys Leu

385 390 395 400

Arg Ser Leu Lys Asn Val Asp Ile Ile Leu Asn Ala Gln Thr Thr Glu

405 410 415

Val Lys Gly Asp Gly Ser Lys Val Val Gly Leu Glu Tyr Arg Asp Arg

420 425 430

Val Ser Gly Asp Ile His Asn Ile Glu Leu Ala Gly Ile Phe Val Gln

435 440 445

Ile Gly Leu Leu Pro Asn Thr Asn Trp Leu Glu Gly Ala Val Glu Arg

450 455 460

Asn Arg Met Gly Glu Ile Ile Ile Asp Ala Lys Cys Glu Thr Asn Val

465 470 475 480

Lys Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Cys Thr Thr Val Pro Tyr Lys Gln

485 490 495

Ile Ile Ile Ala Thr Gly Glu Gly Ala Lys Ala Ser Leu Ser Ala Phe

500 505 510

Asp Tyr Leu Ile Arg Thr Lys Thr Ala

515 520

<210> 39

<211> 85

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 39

Met Gln Thr Val Ile Phe Gly Arg Ser Gly Cys Pro Tyr Cys Val Arg

1 5 10 15

Ala Lys Asp Leu Ala Glu Lys Leu Ser Asn Glu Arg Asp Asp Phe Gln

20 25 30

Tyr Gln Tyr Val Asp Ile Arg Ala Glu Gly Ile Thr Lys Glu Asp Leu

35 40 45

Gln Gln Lys Ala Gly Lys Pro Val Glu Thr Val Pro Gln Ile Phe Val

50 55 60

Asp Gln Gln His Ile Gly Gly Tyr Thr Asp Phe Ala Ala Trp Val Lys

65 70 75 80

Glu Asn Leu Asp Ala

85

<210> 40

<211> 139

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 40

Met Asn Thr Val Cys Thr His Cys Gln Ala Ile Asn Arg Ile Pro Asp

1 5 10 15

Asp Arg Ile Glu Asp Ala Ala Lys Cys Gly Arg Cys Gly His Asp Leu

20 25 30

Phe Asp Gly Glu Val Ile Asn Ala Thr Gly Glu Thr Leu Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Lys Asp Asp Leu Pro Val Val Ile Asp Phe Trp Ala Pro Trp Cys

50 55 60

Gly Pro Cys Arg Asn Phe Ala Pro Ile Phe Glu Asp Val Ala Gln Glu

65 70 75 80

Arg Ser Gly Lys Val Arg Phe Val Lys Val Asn Thr Glu Ala Glu Arg

85 90 95

Glu Leu Ser Ser Arg Phe Gly Ile Arg Ser Ile Pro Thr Ile Met Ile

100 105 110

Phe Lys Asn Gly Gln Val Val Asp Met Leu Asn Gly Ala Val Pro Lys

115 120 125

Ala Pro Phe Asp Ser Trp Leu Asn Glu Ser Leu

130 135

<210> 41

<211> 212

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 41

Met Ser Leu Phe Asp Lys Lys His Leu Val Ser Pro Ala Asp Ala Leu

1 5 10 15

Pro Gly Arg Asn Thr Pro Met Pro Val Ala Thr Leu His Ala Val Asn

20 25 30

Gly His Ser Met Thr Asn Val Pro Asp Gly Met Glu Ile Ala Ile Phe

35 40 45

Ala Met Gly Cys Phe Trp Gly Val Glu Arg Leu Phe Trp Gln Leu Pro

50 55 60

Gly Val Tyr Ser Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Gly Gly Tyr Thr Pro Asn

65 70 75 80

Pro Thr Tyr Arg Glu Val Cys Ser Gly Asp Thr Gly His Ala Glu Ala

85 90 95

Val Arg Ile Val Tyr Asp Pro Ser Val Ile Ser Tyr Glu Gln Leu Leu

100 105 110

Gln Val Phe Trp Glu Asn His Asp Pro Ala Gln Gly Met Arg Gln Gly

115 120 125

Asn Asp His Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Pro

130 135 140

Glu Gln Asp Ala Ala Ala Arg Ala Ser Leu Glu Arg Phe Gln Ala Ala

145 150 155 160

Met Leu Ala Ala Asp Asp Asp Arg His Ile Thr Thr Glu Ile Ala Asn

165 170 175

Ala Thr Pro Phe Tyr Tyr Ala Glu Asp Asp His Gln Gln Tyr Leu His

180 185 190

Lys Asn Pro Tyr Gly Tyr Cys Gly Ile Gly Gly Ile Gly Val Cys Leu

195 200 205

Pro Pro Glu Ala

210

<210> 42

<211> 206

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 42

Met Ser Tyr Thr Leu Pro Ser Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu

1 5 10 15

Pro His Phe Asp Lys Gln Thr Met Glu Ile His His Thr Lys His His

20 25 30

Gln Thr Tyr Val Asn Asn Ala Asn Ala Ala Leu Glu Ser Leu Pro Glu

35 40 45

Phe Ala Asn Leu Pro Val Glu Glu Leu Ile Thr Lys Leu Asp Gln Leu

50 55 60

Pro Ala Asp Lys Lys Thr Val Leu Arg Asn Asn Ala Gly Gly His Ala

65 70 75 80

Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Gly Leu Lys Lys Gly Thr Thr Leu Gln

85 90 95

Gly Asp Leu Lys Ala Ala Ile Glu Arg Asp Phe Gly Ser Val Asp Asn

100 105 110

Phe Lys Ala Glu Phe Glu Lys Ala Ala Ala Ser Arg Phe Gly Ser Gly

115 120 125

Trp Ala Trp Leu Val Leu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Val Val Ser Thr

130 135 140

Ala Asn Gln Asp Ser Pro Leu Met Gly Glu Ala Ile Ser Gly Ala Ser

145 150 155 160

Gly Phe Pro Ile Met Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu

165 170 175

Lys Phe Gln Asn Arg Arg Pro Asp Tyr Ile Lys Glu Phe Trp Asn Val

180 185 190

Val Asn Trp Asp Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala Ala Lys Lys

195 200 205

<210> 43

<211> 193

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 43

Met Ser Phe Glu Leu Pro Ala Leu Pro Tyr Ala Lys Asp Ala Leu Ala

1 5 10 15

Pro His Ile Ser Ala Glu Thr Ile Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His

20 25 30

Gln Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Asn Leu Ile Lys Gly Thr Ala Phe

35 40 45

Glu Gly Lys Ser Leu Glu Glu Ile Ile Arg Ser Ser Glu Gly Gly Val

50 55 60

Phe Asn Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Asn Cys

65 70 75 80

Leu Ala Pro Asn Ala Gly Gly Glu Pro Thr Gly Lys Val Ala Glu Ala

85 90 95

Ile Ala Ala Ser Phe Gly Ser Phe Ala Asp Phe Lys Ala Gln Phe Thr

100 105 110

Asp Ala Ala Ile Lys Asn Phe Gly Ser Gly Trp Thr Trp Leu Val Lys

115 120 125

Asn Ser Asp Gly Lys Leu Ala Ile Val Ser Thr Ser Asn Ala Gly Thr

130 135 140

Pro Leu Thr Thr Asp Ala Thr Pro Leu Leu Thr Val Asp Val Trp Glu

145 150 155 160

His Ala Tyr Tyr Ile Asp Tyr Arg Asn Ala Arg Pro Gly Tyr Leu Glu

165 170 175

His Phe Trp Ala Leu Val Asn Trp Glu Phe Val Ala Lys Asn Leu Ala

180 185 190

Ala

<210> 44

<211> 173

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 44

Met Lys Arg Phe Ser Leu Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ala Ser Glu Lys Val Glu Met Asn Leu Val Thr Ser Gln

20 25 30

Gly Val Gly Gln Ser Ile Gly Ser Val Thr Ile Thr Glu Thr Asp Lys

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Ser Pro Asp Leu Lys Ala Leu Pro Pro Gly Glu His

50 55 60

Gly Phe His Ile His Ala Lys Gly Ser Cys Gln Pro Ala Thr Lys Asp

65 70 75 80

Gly Lys Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala Gly Gly His Leu Asp Pro Gln

85 90 95

Asn Thr Gly Lys His Glu Gly Pro Glu Gly Ala Gly His Leu Gly Asp

100 105 110

Leu Pro Ala Leu Val Val Asn Asn Asp Gly Lys Ala Thr Asp Ala Val

115 120 125

Ile Ala Pro Arg Leu Lys Ser Leu Asp Glu Ile Lys Asp Lys Ala Leu

130 135 140

Met Val His Val Gly Gly Asp Asn Met Ser Asp Gln Pro Lys Pro Leu

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Glu Arg Tyr Ala Cys Gly Val Ile Lys

165 170

<210> 45

<211> 502

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 45

Met Arg Pro Lys Leu Ser Gly Asn Thr Thr Arg His Asn Gly Ala Pro

1 5 10 15

Val Pro Ser Glu Asn Ile Ser Ala Thr Ala Gly Pro Gln Gly Pro Asn

20 25 30

Val Leu Asn Asp Ile His Leu Ile Glu Lys Leu Ala His Phe Asn Arg

35 40 45

Glu Asn Val Pro Glu Arg Ile Pro His Ala Lys Gly His Gly Ala Phe

50 55 60

Gly Glu Leu His Ile Thr Glu Asp Val Ser Glu Tyr Thr Lys Ala Asp

65 70 75 80

Leu Phe Gln Pro Gly Lys Val Thr Pro Leu Ala Val Arg Phe Ser Thr

85 90 95

Val Ala Gly Glu Gln Gly Ser Pro Asp Thr Trp Arg Asp Val His Gly

100 105 110

Phe Ala Leu Arg Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Ile Val Gly

115 120 125

Asn Asn Thr Pro Thr Phe Phe Leu Arg Asp Gly Met Lys Phe Pro Asp

130 135 140

Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Leu Asn Lys Asn Gly Leu Arg Asp Ala

145 150 155 160

Asp Met Gln Trp Asp Phe Trp Thr Arg Ala Pro Glu Ser Ala His Gln

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Met Gly Asp Arg Gly Thr Pro Lys Thr Ser Arg His

180 185 190

Gln Asp Gly Phe Gly Ser His Thr Phe Gln Trp Ile Asn Ala Glu Gly

195 200 205

Lys Pro Val Trp Val Lys Tyr His Phe Lys Thr Arg Gln Gly Trp Asp

210 215 220

Cys Phe Thr Asp Ala Glu Ala Ala Lys Val Ala Gly Glu Asn Ala Asp

225 230 235 240

Tyr Gln Arg Glu Asp Leu Tyr Asn Ala Ile Glu Asn Gly Asp Phe Pro

245 250 255

Ile Trp Asp Val Lys Val Gln Ile Met Pro Phe Glu Asp Ala Glu Asn

260 265 270

Tyr Arg Trp Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Thr Trp Ser Gln Lys Asp

275 280 285

Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Tyr Phe Ile Leu Asn Arg Asn Pro Arg

290 295 300

Asn Phe Phe Ala Gln Ile Glu Gln Leu Ala Leu Asp Pro Gly Asn Ile

305 310 315 320

Val Pro Gly Val Gly Leu Ser Pro Asp Arg Met Leu Gln Ala Arg Ile

325 330 335

Phe Ala Tyr Ala Asp Gln Gln Arg Tyr Arg Ile Gly Ala Asn Tyr Arg

340 345 350

Asp Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asn Glu Val Asn Thr Tyr Ser Arg

355 360 365

Glu Gly Ser Met Gln Tyr Ile Phe Asp Ala Glu Gly Glu Pro Ser Tyr

370 375 380

Ser Pro Asn Arg Tyr Asp Lys Gly Ala Gly Tyr Leu Asp Asn Gly Thr

385 390 395 400

Asp Ser Ser Ser Asn His Thr Ser Tyr Gly Gln Ala Asp Asp Ile Tyr

405 410 415

Val Asn Pro Asp Pro His Gly Thr Asp Leu Val Arg Ala Ala Tyr Val

420 425 430

Lys His Gln Asp Asp Asp Asp Phe Ile Gln Pro Gly Ile Leu Tyr Arg

435 440 445

Glu Val Leu Asp Glu Gly Glu Lys Glu Arg Leu Ala Asp Asn Ile Ser

450 455 460

Asn Ala Met Gln Gly Ile Ser Glu Ala Thr Glu Pro Arg Val Tyr Asp

465 470 475 480

Tyr Trp Asn Asn Val Asp Glu Asn Leu Gly Ala Arg Val Lys Glu Leu

485 490 495

Tyr Leu Gln Lys Lys Ala

500

<210> 46

<211> 159

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 46

Met Thr Ser Ile His Asp Ile Ser Val Thr Leu Asn Asp Gly Thr Glu

1 5 10 15

Thr Thr Met Ala Asp Trp Ala Gly His Leu Leu Leu Ile Val Asn Val

20 25 30

Ala Ser Lys Cys Gly Leu Thr Pro Gln Tyr Glu Gly Leu Gln Lys Leu

35 40 45

Tyr Glu Glu Tyr Gln Asp Arg Gly Phe Phe Val Ile Gly Val Pro Cys

50 55 60

Asn Gln Phe Asn Gly Gln Glu Pro Gly Thr Asp Ala Glu Val Cys Ala

65 70 75 80

Phe Ala Gln Asn Gln Tyr Asp Val Thr Phe Pro Leu Leu Ser Lys Thr

85 90 95

Glu Val Asn Gly Glu Gly Ala His Pro Leu Tyr Lys Val Leu Lys Glu

100 105 110

Ala Thr Asp Gly Ser Glu Ile Glu Trp Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val

115 120 125

Asp Ala Glu Gly Asn Thr Ile Lys Arg Phe Ala Pro Arg Thr Glu Pro

130 135 140

Ser Ala Ala Glu Val Val Glu Ala Ile Glu Glu Asn Leu Pro Ile

145 150 155

<210> 47

<211> 465

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 47

Met Ser Glu Gln Pro Ala Ser Ile Lys His Tyr Asp Leu Ile Ile Ile

1 5 10 15

Gly Thr Gly Ser Gly Asn Ser Ile Pro Gly Pro Glu Phe Asp Asp Lys

20 25 30

Ser Ile Ala Ile Val Glu Lys Gly Ala Phe Gly Gly Thr Cys Leu Asn

35 40 45

Val Gly Cys Ile Pro Thr Lys Met Tyr Val Tyr Ala Ala Asp Ile Ala

50 55 60

Gln Glu Ile Gln Glu Ser Ala Arg Leu Gly Ile Asp Ala Thr Val Asn

65 70 75 80

Ser Val Asp Trp Pro Ser Ile Val Ser Arg Val Phe Asp Lys Arg Ile

85 90 95

Asp Leu Ile Ala Gln Gly Gly Glu Ala Tyr Arg Arg Gly Pro Glu Thr

100 105 110

Pro Asn Ile Asp Val Tyr Asp Met His Ala Ser Phe Val Asp Ser Lys

115 120 125

Thr Ile Ser Thr Gly Ile Ala Gly Gln Glu Gln Leu Ile Ser Gly Thr

130 135 140

Asp Ile Val Ile Ala Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Ile Pro Glu Ala Ile

145 150 155 160

Ala Glu Ser Gly Ala Arg Tyr Tyr Thr Asn Glu Asp Ile Met Arg Leu

165 170 175

Ala Gln Gln Pro Glu Ser Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Phe Ile Ala

180 185 190

Leu Glu Phe Ala His Val Phe Glu Ala Leu Gly Thr Lys Val Thr Ile

195 200 205

Leu Asn Arg Ser Asp Val Leu Leu Arg Glu Ala Asp Ala Asp Ile Ser

210 215 220

Ala Lys Ile Leu Glu Leu Ser Lys Lys Arg Phe Asp Val Arg Leu Ser

225 230 235 240

Thr Ala Val Thr Ala Val His Asn Lys Ala Asp Gly Gly Val Lys Ile

245 250 255

Ser Thr Asp Thr Gly Asp Asp Ile Glu Ala Asp Ile Leu Leu Val Ala

260 265 270

Thr Gly Arg Thr Pro Asn Gly Asn Gln Met Asn Leu Asp Ala Ala Gly

275 280 285

Ile Glu Met Asn Gly Arg Ser Ile Lys Val Asp Glu Phe Gly Arg Thr

290 295 300

Ser Val Glu Gly Val Trp Ala Leu Gly Asp Val Ser Ser Pro Tyr Lys

305 310 315 320

Leu Lys His Val Ala Asn Ala Glu Met Arg Ala Ile Lys His Asn Leu

325 330 335

Ala Asn Pro Asn Asp Leu Gln Lys Met Pro His Asp Phe Val Pro Ser

340 345 350

Ala Val Phe Thr Asn Pro Gln Ile Ser Gln Val Gly Met Thr Glu Gln

355 360 365

Glu Ala Arg Glu Ala Gly Leu Asp Ile Thr Val Lys Ile Gln Asn Tyr

370 375 380

Ser Asp Val Ala Tyr Gly Trp Ala Met Glu Asp Lys Asp Gly Phe Val

385 390 395 400

Lys Leu Ile Ala Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu Val Gly Ala His Ile

405 410 415

Ile Gly Ala Gln Ala Ser Thr Leu Ile Gln Gln Leu Ile Thr Val Met

420 425 430

Ala Phe Gly Ile Asp Ala Arg Glu Ala Ala Thr Lys Gln Tyr Trp Ile

435 440 445

His Pro Ala Leu Pro Glu Val Ile Glu Asn Ala Leu Leu Gly Leu Glu

450 455 460

Phe

465

<210> 48

<211> 77

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 48

Met Ala Ile Thr Val Tyr Thr Lys Pro Ala Cys Val Gln Cys Asn Ala

1 5 10 15

Thr Lys Lys Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Glu Tyr Asp Leu Val Asp

20 25 30

Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Arg Glu Tyr Val Leu Ala Leu Gly Tyr

35 40 45

Leu Gln Ala Pro Val Val Val Ala Asp Gly Ser His Trp Ser Gly Phe

50 55 60

Arg Pro Glu Arg Ile Arg Glu Met Ala Thr Ala Ala Ala

65 70 75

<210> 49

<211> 124

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 49

Met Asn Val Gly Phe Pro Arg Ser Pro Val Ile Val Asn Leu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Met Ser Asn Val Val Ala Val Thr Glu Gln Thr Phe Lys Ser Thr

20 25 30

Val Ile Asp Ser Asp Lys Pro Val Ile Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

35 40 45

Cys Gly Pro Cys Lys Lys Leu Ser Pro Ile Ile Glu Glu Ile Ala Gly

50 55 60

Glu Tyr Gly Asp Lys Ala Val Val Ala Ser Val Asp Val Asp Ala Glu

65 70 75 80

Arg Thr Leu Gly Ala Met Phe Gln Ile Met Ser Ile Pro Ser Val Leu

85 90 95

Ile Phe Lys Asn Gly Ala Lys Val Glu Glu Phe Val Gly Leu Arg Pro

100 105 110

Lys Asn Glu Ile Val Glu Lys Leu Glu Lys His Leu

115 120

Claims

1.一种提高5-氨基乙酰丙酸生产菌株的5-氨基乙酰丙酸产量的方法，所述方法包括增强所述菌株的抗氧化能力的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，增强所述菌株的抗氧化能力是指增强所述菌株中抗氧化相关蛋白的活性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗氧化相关蛋白是过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、硫醇还原酶、巯基-二硫键氧化还原酶、硫氧还蛋白还原酶或蛋氨酸亚砜还原酶。

4.一种构建5-氨基乙酰丙酸高产菌株的方法，所述方法包括：

增强所述菌株的抗氧化能力的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，增强所述菌株的抗氧化能力是指增强所述菌株中抗氧化相关蛋白的活性。

6.一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株，所述菌株的抗氧化能力增强。

7.如权利要求6所述的菌株，其特征在于，增强所述菌株的抗氧化能力是指增强所述菌株中抗氧化相关蛋白的活性。

8.如权利要求7所述的菌株，其特征在于，所述抗氧化相关蛋白是过氧化氢酶、过氧化物酶、硫醇还原酶、巯基-二硫键氧化还原酶、硫氧还蛋白还原酶或蛋氨酸亚砜还原酶。

9.一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：

1)培养权利要求6-8中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和

2)任选地从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

10.权利要求6-8中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸高产菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的下游产物。