WO2017150304A1 - エルゴチオネインの発酵生産 - Google Patents

エルゴチオネインの発酵生産 Download PDF

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WO2017150304A1
WO2017150304A1 PCT/JP2017/006619 JP2017006619W WO2017150304A1 WO 2017150304 A1 WO2017150304 A1 WO 2017150304A1 JP 2017006619 W JP2017006619 W JP 2017006619W WO 2017150304 A1 WO2017150304 A1 WO 2017150304A1
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WO
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egt
gene
microorganism
ergothioneine
strain
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PCT/JP2017/006619
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豪 仲谷
佳子 嘉悦
祐司 野口
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長瀬産業株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sulfur-containing amino acid. Specifically, the present invention relates to a method for fermentative production of ergothioneine.
  • Ergothioneine is a kind of sulfur-containing amino acid and is known to have various physiological activities including antioxidant ability. Moreover, it is suggested that the antioxidant ability is higher than vitamin C, vitamin E, cysteine, and glutathione. Ergothioneine has also been shown to have an ultraviolet absorption effect, a melanin production inhibitory effect, an ability to eliminate reactive oxygen species, an elastase activity inhibitory effect that suppresses the formation of wrinkles and sagging, and a tyrosinase activity inhibitory effect that suppresses the formation of stains. Therefore, ergothioneine is one of the compounds that are particularly attracting attention in the beauty and food industry.
  • Ergothioneine is contained in a large amount in some microorganisms, particularly basidiomycetes, and in trace amounts in animals and plants. Mammals are not able to biosynthesize ergothioneine, but it is known that by eating mushrooms including basidiomycetes, it is taken into the body and ergothioneine accumulates in some organs.
  • Known methods for producing ergothionein include culture / extraction methods of microorganisms such as basidiomycetes and organic synthesis methods (see Patent Documents 1 and 2). However, the extraction method from basidiomycetes, etc.
  • JP 2006-004030 A Japanese Patent Laid-Open No. 2007-1000029
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems, and have found that an unexpectedly large amount of ergothioneine is produced in a culture solution of a microorganism in which the ergothioneine biosynthesis gene is overexpressed. Furthermore, it has been found that more ergothioneine is produced in a culture solution of a microorganism having an ability to produce ergothioneine that has reduced or eliminated histidine ammonia lyase activity or reduced or eliminated histidine ammonia lyase gene expression. It came to be completed.
  • the present invention provides the following.
  • a method for producing ergothioneine comprising culturing a microorganism having an ability to produce ergothioneine and obtaining ergothioneine produced outside the cell, wherein the microorganism overexpresses an ergothioneine biosynthesis gene The way that is.
  • the microorganism is one or more of genes corresponding to mycobacterium smegmatis egtA, egtB, egtC, egtD or egtE, Shizosaccaromyces pombe (Shizosaccaromyces pombe) Overexpression of the ergothioneine biosynthetic gene by enhancing the expression of either or both of the genes corresponding to Egt1 or Egt2, or the genes corresponding to Egt1 or Egt2 of Neurospora crassa The method according to (1) or (2). (4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the microorganism is actinomycetes, enterobacteria, or yeast.
  • microorganism is actinomycetes.
  • Overexpression of the ergothioneine biosynthetic gene by enhancing the expression of either or both of the corresponding genes, or of either or both of the genes corresponding to Neurospora crassa Egt1 or Egt2 (6 Or the microorganism according to (7).
  • ergothioneine which is a useful substance having various physiological activities including a strong antioxidant action, can be produced at a low cost and in large quantities. Furthermore, in the present invention, since ergothioneine is produced outside the cells, the production process can be simplified and ergothioneine with high purity can be easily obtained.
  • FIG. 1 shows a combination of ergothioneine of Streptomyces lividans 1326 wild strain (WT), wild-type ergothioneine producing strain (WT / pIJ101_EGT) and ergothioneine producing strain in which SLI_5205 gene is disrupted ( ⁇ SLI — 5205 / pIJ101_EGT). It is a graph which shows the total production amount.
  • WT Streptomyces lividans 1326 wild strain
  • WT / pIJ101_EGT wild-type ergothioneine producing strain
  • ⁇ SLI — 5205 / pIJ101_EGT ergothioneine producing strain in which SLI_5205 gene is disrupted
  • FIG. 2 shows that the Streptomyces lividans 1326 wild strain (WT), the wild type ergothioneine producing strain (WT / pIJ101_EGT), and the ergothioneine producing strain in which the SLI_5205 gene was disrupted ( ⁇ SLI — 5205 / pIJ101_EGT) were produced outside the cells. It is a graph which shows the amount of ergothioneine.
  • FIG. 3 shows the production of Streptomyces avermitilis control strain (WT / pIJ101) (denoted as S. avermitilis) and EGT producing strain (WT / pIJ101_EGT) (denoted as S.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of ergothioneine produced outside the cells of Streptomyces avermitilis wild strain MA-4680 (NITE deposit number: NBRC14893T) (denoted as MA-4680) and SUKA17 strain.
  • FIG. 5 shows Corynebacterium glutamicum (pCSD, expressed as pCG) introduced with empty vectors pCSD and pCG, and Corynebacterium glutamicum (pCSD) introduced with EGT biosynthesis gene overexpression vectors pCSD-egtABCDE and pCG-egtABCDE, respectively.
  • pCSD Corynebacterium glutamicum
  • pCSD Corynebacterium glutamicum
  • (-EgtABCDE, expressed as pCG-egtABCDE) is a graph showing
  • the present invention is characterized by culturing a microorganism having an ability to produce ergothioneine (sometimes abbreviated as EGT in the present specification) to obtain ergothioneine produced outside the cell.
  • ergothioneine sometimes abbreviated as EGT in the present specification
  • the microorganism is an overexpressed ergothioneine biosynthetic gene.
  • the microorganism having EGT-producing ability used in the present invention is a microorganism that produces EGT outside the cell body and overexpresses the ergothioneine biosynthesis gene. As long as the microorganism produces EGT outside the cells, it may produce EGT inside the cells. Microorganisms that produce more EGT outside the cells than the cells are preferred.
  • Producing EGT outside the microbial cell includes releasing EGT from the microbial cell and producing EGT on the microbial cell surface. When EGT is liberated from the bacterial cells, EGT can be recovered from the extracellular fraction of the culture, for example, the culture supernatant. When producing EGT on the cell surface, EGT can be liberated from the cell by known methods such as stirring, ultrasonic treatment, and surfactant treatment, and the liberated EGT can be recovered.
  • the recovery of EGT released from the cells can be performed by a known method.
  • the culture is subjected to solid-liquid separation such as centrifugation or filtration to obtain a culture supernatant, and the culture supernatant is subjected to known chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • EGT can be obtained.
  • the microorganism used in the present invention is a microorganism in which an EGT biosynthesis gene is overexpressed.
  • the EGT biosynthesis gene is a gene encoding an enzyme involved in EGT biosynthesis. Enzymes involved in EGT biosynthesis and EGT biosynthetic genes are known, and some genes have known nucleotide sequences. One skilled in the art can appropriately select an EGT biosynthesis gene to be overexpressed.
  • one or more genes corresponding to mycobacterium smegmatis egtA, egtB, egtC, egtD or egtE, and Egt1 or Egt2 corresponding to Schizosaccharomyces pombe It is preferable to use a microorganism that overexpresses the EGT biosynthetic gene by enhancing the expression of either or both of the genes or the gene corresponding to Egt1 or Egt2 of Neurospora crassa. It is not limited to these microorganisms.
  • the EGT biosynthetic gene of the genus Mycobacterium reference can be made to F. P. Seebeck, J. Am. Chem.
  • EGT biosynthesis genes belonging to the genus Schizosaccharomyces T.TPluskal et al, PLOS ONE. 2014 May; 9 (5): e97774 can be referred to.
  • EGT biosynthesis genes of the genus Neurospora W. Hu et al, Org. Lett. 2014, 16, 5382-5385 can be referred to.
  • EGT biosynthesis genes belonging to the genus Streptomyces reference can be made to S. Nakajima et al, J. Biosci. Bioeng. 2015 (in press).
  • EGT biosynthesis genes in various microorganisms G. ⁇ W. Jones et al, Gene 549 (2014) 161-170 can be referred to.
  • “Overexpression of a gene” means that the expression level of the gene is larger than that of a parent strain or a wild strain.
  • the expression level is preferably twice or more that of the parent strain or the wild strain, more preferably 5 times or more, and even more preferably 10 times or more. Quantification of gene expression can be performed by a known method such as Northern blotting or real-time PCR.
  • Corresponding gene refers to an enzyme that catalyzes an enzyme that catalyzes a reaction in the ergothioneine biosynthetic pathway of one microorganism and an enzyme that catalyzes the same or similar reaction in the ergothioneine biosynthetic pathway of another microorganism.
  • a certain gene and the gene corresponding thereto may have the same nucleotide sequence, or may have different nucleotide sequences.
  • the nucleotide sequence identity between a gene and a gene corresponding to a gene may be 50% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more.
  • an enzyme protein encoded by a certain gene and an enzyme protein encoded by a gene corresponding to a certain gene may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • the amino acid sequence identity between an enzyme protein encoded by a gene and an enzyme protein encoded by a gene corresponding to a gene may be 50% or more, 70% or more, 80% or more, or 90%. It may be the above.
  • the overexpression of the EGT biosynthetic gene can be performed using a known gene overexpression method.
  • a method of placing an EGT biosynthetic gene under the control of a highly expressed promoter is common. For example, by introducing an EGT biosynthetic gene into a host genome by introducing a promoter suitable for expression of the EGT biosynthetic gene and an expression vector incorporating the EGT biosynthetic gene into the microorganism, or by homologous recombination or the like, Synthetic genes may be overexpressed.
  • the vector a plasmid vector or a viral vector can be used as the vector.
  • vector components such as a promoter, a terminator, a marker gene such as a drug resistance gene and a metabolic enzyme gene can be appropriately selected and used.
  • Methods for introducing genes into microorganisms are also known.
  • the gene to be introduced can be introduced into a microorganism as it is or after being incorporated into a vector. Examples of gene transfer methods include lipofection method, calcium phosphate method, polymer method, electroporation method, particle gun method, etc., and these methods are appropriately selected according to the type of microorganism to be introduced and the gene to be introduced. be able to.
  • overexpression of the EGT biosynthesis gene may induce expression of an endogenous EGT biosynthesis gene by deleting a specific gene or region on the genome.
  • the overexpression method of the EGT biosynthesis gene is not limited to the above method.
  • the microorganism used in the present invention may be one that overexpresses the EGT biosynthesis gene as a result of natural mutation.
  • the overexpression of the EGT biosynthesis gene can be confirmed by a known method such as Northern blotting or real-time PCR.
  • overexpression of the EGT biosynthetic gene can be confirmed by actually culturing a microorganism and quantifying the EGT produced outside the cell (in the culture solution).
  • the EGT biosynthetic gene to be overexpressed in the microorganism may be one type or two or more types. Genes encoding a plurality of enzymes involved in EGT biosynthesis may be introduced into microorganisms as clusters. An EGT biosynthetic gene derived from a different genus or a heterologous microorganism may be introduced and overexpressed, or an EGT biosynthetic gene derived from the same genus or the same type of microorganism may be introduced and overexpressed. It is preferable to introduce and overexpress an EGT biosynthetic gene derived from the same or related genera, and more preferably to introduce and overexpress an EGT biosynthetic gene derived from the same or related species. More preferably, an EGT biosynthesis gene derived from the same species is introduced and overexpressed.
  • the microorganism having EGT-producing ability used in the present invention is a microorganism in which an EGT biosynthesis gene is overexpressed, wherein the histidine ammonia lyase activity is reduced or eliminated, or the expression of histidine ammonia lyase gene is reduced or eliminated. It is preferable that Histidine is one of the materials for EGT biosynthesis, and by reducing or eliminating histidine ammonia lyase activity related to histidine metabolism, histidine used for EGT biosynthesis can be increased and EGT production can be increased. it can.
  • a microorganism having a reduced histidine ammonia lyase activity is a microorganism having a histidine ammonia lyase activity lower than that of its parent strain or wild strain.
  • the rate of decrease in histidine ammonia lyase activity is preferably less than 50%, more preferably less than 25%, and even more preferably less than 10% of its parent or wild strain.
  • Most preferred are microorganisms that have lost their histidine ammonia lyase activity.
  • a microorganism having lost histidine ammonia lyase activity is a microorganism in which histidine ammonia lyase activity is not detected at all.
  • the microorganism having reduced or eliminated histidine ammonia lyase activity can also be referred to as a microorganism having reduced or eliminated histidine ammonia lyase gene expression.
  • the rate of decrease in histidine ammonia lyase gene expression is preferably less than 50%, more preferably less than 25%, and even more preferably less than 10% of its parent or wild strain.
  • Most preferred are microorganisms that have lost the expression of the histidine ammonia lyase gene.
  • a microorganism in which histidine ammonia lyase gene expression has been lost is a microorganism in which histidine ammonia lyase gene expression is not detected at all.
  • histidine ammonia lyase activity and the expression of the histidine ammonia lyase gene can be measured by known methods (Hartwell L. H. and Magasanik B., 1963, J. Molecular Biology, 7: 401-420.).
  • Methods for reducing or eliminating histidine ammonia lyase activity and methods for reducing or eliminating histidine ammonia lyase gene expression are also known, for example, a method of knocking out or knocking down a histidine ammonia lyase gene by homologous recombination or RNA interference, Or the method of administering the substance which inhibits histidine ammonia lyase to microorganisms is mentioned, However It is not limited to these methods.
  • the microorganism used in the present invention may have a histidine ammonia lyase activity reduced or eliminated as a result of natural mutation.
  • the microorganism having EGT production ability used in the present invention may be of any kind.
  • actinomycetes, enteric bacteria, ascomycetes or basidiomycetes may be used.
  • actinomycetes that can be used in the present invention include actinomycetes of the genus Streptomyces, Actinomyces, Mycobacterium, and Corynebacterium
  • enterobacteria examples include bacteria of the genus Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, and Salmonella. However, it is not limited to these.
  • a bacterium belonging to the genus Methyrobacterium which is a methanol-assimilating bacterium may be used.
  • the ascomycetes that can be used in the present invention include the genus Shizosaccaromyces, Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Penicillium, and Neurospora. Ascomycetes are exemplified, but not limited thereto.
  • basidiomycetes that can be used in the present invention include Tamogitake, Sasukulehi Toyotake, Beechhimeji, Kitsunaratake, Oystertake, Elingi, Enokitake, Willow Mushroom, Hatakeshimeji, Chaurokotake, Sugitake, Usukimorinotake, Shiitake, Pleurotus edulis, Although basidiomycete is illustrated, it is not limited to these.
  • actinomycetes, enterobacteria or yeasts are preferably used.
  • Preferred actinomycetes include actinomycetes such as Streptomyces, Corynebacterium, and Mycobacterium.
  • Preferred enteric bacteria include enteric bacteria such as Escherichia, Pantoea, and Salmonella.
  • Preferred yeasts include yeasts such as Schizosaccharomyces and Saccharomyces.
  • the actinomycetes particularly preferably used in the present invention are actinomycetes of the genus Streptomyces, Streptomyces lividans, Streptomycesrepcoelicolor, Streptomyces avermitilis (Streptomyces avermitilis) ), Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces albulus, and the like.
  • Culture of microorganisms in the EGT production method of the present invention can be performed by a usual method.
  • Various conditions such as medium composition, culture temperature, culture time, pH, and aeration conditions can be selected according to the type of microorganism.
  • EGT By culturing the above microorganisms in a known medium, EGT can be produced outside the cells, but in order to increase EGT production, compounds that contribute to EGT biosynthesis, such as cysteine and histidine, or their The precursor may be added to the medium.
  • a semisynthetic medium for actinomycetes (6% glucose, 0.2% NaCl, 0.05% K 2 HPO 4 , 0.01% MgSO 4 .7H 2 O, 0 0.2% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.2% yeast extract, 0.005% FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.005% MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.005% ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5% CaCO 3 ), TSB medium (0.25% glucose, 1.7% casein pancreatic digest, 0.3% soybean papain digest, 0.5% NaCl, 0.25% K 2 HPO 4 ), or SYN medium (0.7% casamino acid, 0.2% yeast extract, 0.264% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.238% KH 2 PO 4 , 0.556% K 2 HPO 4, 0.1% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.0064% CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.0011%
  • LB medium In the embodiment using intestinal bacteria, LB medium, 2 ⁇ YT medium, NZY medium, M9 medium, SOC medium, YPD medium, or the like can be used. In the embodiment using yeast, SD medium, YPD medium, YPAD medium, or the like can be used. Although EGT can be produced outside the cells using the above medium, the medium to be used is not limited thereto.
  • the present invention relates to a microorganism having the ability to produce EGT outside the microbial cells, wherein the ergothioneine biosynthesis gene is overexpressed.
  • the microorganism having the ability to produce the EGT of the present invention outside the cell and overexpressing the ergothioneine biosynthetic gene includes Mycobacterium smegmatis egtA, eggB, eggC, eggD. Or any one or more of the genes corresponding to egtE, either or both of the genes corresponding to Egt1 or Egt2 of Schizosaccaromyces pombe, or Egt1 or Egt2 of Neurospora crassa
  • the microorganism which overexpressed the EGT biosynthetic gene by enhancing the expression of either or both of the genes corresponding to is preferred, it is not limited to these microorganisms.
  • the reduction or disappearance of histidine ammonia lyase activity or the reduction of histidine ammonia lyase gene expression is as described above.
  • the present invention relates to a method for producing a microorganism having the ability to produce EGT outside the cells, characterized by overexpressing an ergothioneine biosynthesis gene.
  • a method for producing a microorganism having the ability to produce EGT outside the cells characterized by overexpressing an ergothioneine biosynthesis gene.
  • the step of overexpressing the ergothioneine biosynthesis gene may be performed before or after the step of reducing or eliminating histidine ammonia lyase activity, or the step of reducing or eliminating histidine ammonia lyase gene expression.
  • An EGT production strain was prepared using Streptomyces lividans 1326 strain (NITE deposit number: NBRC 15675) as a host, and the EGT production amount in the culture medium was compared and examined.
  • EGT production strain 1-1-1 Construction of EGT production strain 1-1-1. Enhanced expression of EGT biosynthetic enzyme gene in Streptomyces lividans As EGT biosynthetic enzyme genes, SLI — 1139 (SEQ ID NO: 1), SLI — 1140 (SEQ ID NO: 2), SLI — 1141 (SEQ ID NO: 3) derived from Streptomyces lividans strain 1326 , SLI — 1142 (SEQ ID NO: 4) gene was used. The above four genes form a cluster on the genome of Streptomyces lividans 1326 strain. These genes are genes corresponding to mycobacterium smegmatis egtA, egtB, egtC, and egtD, respectively.
  • the cluster sequence containing the above four genes was amplified using the genome extract of Streptomyces lividans 1326 strain as a template.
  • the amplified cluster sequence was ligated to a vector having the replication origin of pIJ101 under the control of the promoter (SEQ ID NO: 5) of SAV — 2794 gene of Streptomyces avermitilis MA-4680 strain, and the gene expression vector pIJ101_EGT Built.
  • Streptomyces lividans 1326 strain was transformed to obtain an EGT production strain (WT / pIJ101_EGT).
  • SLI — 5205 histidine ammonia lyase gene
  • SEQ ID NO: 8 A partial sequence in the SLI — 5205 gene (SEQ ID NO: 8) of Streptomyces lividans strain 1326 Amplified to template.
  • the amplified product was cloned into a vector having the replication origin of pGM160 (see Mol. Gen. Genet., 1989, 219, 341-348) to obtain a vector for disrupting the SLI — 5205 gene.
  • an SLI_5205 gene disruption strain ( ⁇ SLI_5205 / pIJ101_EGT) in which a gene disruption vector was inserted into the SLI_5205 gene on the genome by homologous recombination was obtained.
  • EGT production strain 1-2-1 Streptomyces lividans 1326 wild strain (WT), wild type EGT production strain obtained in 1-1 above (WT / pIJ101_EGT), EGT production in which SLI_5205 gene obtained in 1-2 above is disrupted Strain ( ⁇ SLI — 5205 / pIJ101_EGT) and each glycerol stock were added to a test tube containing 5 mL of TSB medium (refer to Table 3 below), and cultured with shaking at 28 ° C. and 160 rpm for 48 hours to obtain a preculture solution .
  • WT Streptomyces lividans 1326 wild strain
  • WT / pIJ101_EGT wild type EGT production strain obtained in 1-1 above
  • EGT production in which SLI_5205 gene obtained in 1-2 above is disrupted Strain ( ⁇ SLI — 5205 / pIJ101_EGT) and each glycerol stock were added to a test tube
  • TSB medium (refer to Table 3 below) in a 500 mL baffled flask.
  • Glucose was further added to the TSB medium at the start of the culture so that the initial glucose concentration was 50 g / L.
  • the culture broth was cultured with shaking at 28 ° C. and 160 rpm for 1 week to produce EGT in the culture broth. During the culture period, glucose was added in a timely manner so that the carbon source glucose was not depleted.
  • the WT / pIJ101_EGT strain and the ⁇ SLI_5205 / pIJ101_EGT strain were tested in triplicate for each of the WT / pIJ101_EGT strain, and the production amount was evaluated using the average value of the three strains.
  • An EGT production strain was prepared using Streptomyces avermitilis MA-4680 (NITE deposit number: NBRC14893T) as a host, and the amount of EGT produced in the culture was compared and examined.
  • Streptomyces avermitilis MA-4680 was transformed with pIJ101, to which no gene was ligated, and pIJ101_EGT constructed in Example 1 as control for construction of an EGT production strain, and a control strain (WT / pIJ101) And an EGT production strain (WT / pIJ101_EGT). Transformation was performed according to the method described in “Genetic Manipulation of Streptomyces” (Hopwood, DA et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual, the John Innes Foundation, Norwich) on genetic engineering techniques for actinomycetes. .
  • Glucose was further added to the TSB medium at the start of the culture so that the initial glucose concentration was 50 g / L.
  • the culture broth was cultured with shaking at 28 ° C. and 160 rpm for 5 days to produce EGT in the culture broth. During the culture period, glucose was added in a timely manner so that the carbon source glucose was not depleted.
  • the SUKA17 strain is a strain in which a biosynthetic gene cluster of a plurality of endogenous metabolites is deleted from the parent strain Streptomyces avermitilis MA-4680 genome. A strain in which expression of a synthetic gene is induced.
  • An EGT producing strain was prepared using Corynebacterium glutamicum, and the amount of EGT produced in the culture broth was compared and examined.
  • EGT production strain 4-1-1 Construction of EGT production strain 4-1-1. Introduction of EGT biosynthetic gene into Corynebacterium glutamicum egT (MSMEG — 6250: SEQ ID NO: 11), egtB (MSMEG — 6249: SEQ ID NO: 11) forming a cluster on the Mycobacterium smegmatis genome as an EGT biosynthetic gene 12), 5 genes of egtC (MSMEG — 6248: SEQ ID NO: 13), egtD (MSMEG — 6247: SEQ ID NO: 14), and egtE (MSMEG — 6246: SEQ ID NO: 15) were used.
  • EGT biosynthetic gene into Corynebacterium glutamicum egT (MSMEG — 6250: SEQ ID NO: 11), egtB (MSMEG — 6249: SEQ ID NO: 11) forming a cluster on the Mycobacter
  • the cluster containing the above five genes was amplified as three PCR fragments (Fr1, Fr2, Fr3) using the genome of Mycobacterium smegmatis (NITE deposit number: NBRC 3082) as a template using the primers shown in Table 6. .
  • the promoter region of pCH (see Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77: 533-541) having the replication origin of pBL1 is used for the gapA gene derived from Corynebacterium glutamicum, the SOD gene (Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81: PCG (gapA promoter) and pCSD (SOD promoter) respectively substituted for the promoters of 291-301).
  • pCG-egtABCDE and pCSD-egtABCDE were constructed by cloning 5 genes of egtA, egtB, egtC, egtD, and egtE in tandem into pCG and pCSD, respectively.
  • the empty vectors pCG, pCSD, and the constructed pCG-egtABCDE and pCSD-egtABCDE were used to introduce into Corynebacterium glutamicum (ATCC deposit number: 21799) by electroporation.
  • the electroporation method was performed according to a conventionally known method.
  • the culture was shaken at 1000 rpm for a time. After completion of the culture, 1 ml of the culture solution was sampled to examine the amount of EGT produced outside the cells.
  • ergothioneine having various physiological activities including a strong antioxidant action can be produced at low cost and in large quantities, and the present invention can be used in a wide range of fields such as pharmaceuticals, cosmetics and foods. It is.
  • SEQ ID NO: 1 is the base sequence of SLI — 1139 gene derived from Streptomyces lividans strain 1326.
  • SEQ ID NO: 2 is the base sequence of SLI_1140 gene derived from Streptomyces lividans 1326 strain.
  • SEQ ID NO: 3 is the base sequence of SLI — 1141 gene derived from Streptomyces lividans strain 1326.
  • SEQ ID NO: 4 is the base sequence of SLI — 1142 gene derived from Streptomyces lividans strain 1326.
  • SEQ ID NO: 5 is the base sequence of the promoter of the SAV — 2794 gene of Streptomyces avermitilis MA-4680 strain.
  • SEQ ID NO: 6 is the base sequence of a forward primer for amplifying a cluster of EGT biosynthetic enzymes.
  • SEQ ID NO: 7 is the base sequence of the reverse primer for amplifying a cluster of EGT biosynthetic enzymes.
  • SEQ ID NO: 8 is the base sequence of SLI — 5205 gene of Streptomyces lividans 1326 strain.
  • SEQ ID NO: 9 is the base sequence of the forward primer for amplifying a partial sequence of SLI — 5205 gene of Streptomyces lividans 1326 strain.
  • SEQ ID NO: 10 is the base sequence of the reverse primer for amplifying the partial sequence of SLI — 5205 gene of Streptomyces lividans 1326 strain.
  • SEQ ID NO: 11 is the base sequence of the egtA gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 12 is the base sequence of the egtB gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 13 is the base sequence of the egtC gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 14 is the base sequence of the egtD gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 15 is the base sequence of the egtE gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 16 is the base sequence of the forward primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the EgA to egtE genes of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 17 is the nucleotide sequence of a forward primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the EgA gene to Egto gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 18 is the base sequence of the reverse primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the genes EggA to egtE of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 19 is the base sequence of the forward primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the EgA to egtE genes of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 20 is the base sequence of the reverse primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the EgtoA to egtE gene of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 21 is the base sequence of the forward primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the EgA to egtE genes of Mycobacterium smegmatis.
  • SEQ ID NO: 22 is the base sequence of the reverse primer for amplifying a fragment for obtaining a cluster containing the EgA to egtE genes of Mycobacterium smegmatis.

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Abstract

エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法、ならびに上記方法において微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である方法。

Description

エルゴチオネインの発酵生産
　本発明は含硫アミノ酸の製造方法に関する。詳細には、本発明はエルゴチオネインの発酵生産方法に関する。
　エルゴチオネインは含硫アミノ酸の一種で、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。また、その抗酸化能はビタミンＣ、ビタミンＥ、システイン、グルタチオンよりも高いことが示唆されている。エルゴチオネインは紫外線吸収効果、メラニン産生抑制作用、活性酸素種の消去能、しわやたるみの形成を抑えるエラスターゼ活性阻害作用、シミの形成を抑えるチロシナーゼ活性阻害作用を有することも示されている。したがって、エルゴチオネインはとりわけ美容・食品業界で注目されている化合物の１つである。
　エルゴチオネインは一部の微生物、特に担子菌類に多く含まれており、動植物にも微量含まれている。哺乳動物はエルゴチオネインを生合成することができないが、担子菌類を含むキノコなどを摂食することで体内に取り込み、一部の臓器にエルゴチオネインが蓄積することが知られている。エルゴチオネインの製造方法として、担子菌類等の微生物の培養・抽出法および有機合成法が知られている（特許文献１、２等参照）。しかしながら、担子菌類等からの抽出法は、生産性が低い、微生物の培養に長期間を有する、菌体内に蓄積するため菌体内から抽出するための製造プロセスが複雑である、微生物の改良が困難である等の理由から普及するに至っていない。有機合成法も、反応が多段階で複雑である、有害な原料を使用することがある、高価な原料を使用するため費用が高くつく等の理由から普及に至っていない。
特開２００６－００４０３０号公報 特開２００７－１００２９８号公報
　上述のように、現状では、エルゴチオネインは価格が高く、その供給に課題がある。したがって、安価かつ大量にエルゴチオネインを製造する方法が求められている。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物の培養液中に予想外にエルゴチオネインが著量産生されることを見出した。さらに、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させたエルゴチオネイン生産能を有する微生物の培養液中にエルゴチオネインがさらに多く産生されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって本発明は以下のものを提供する。
　（１）エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法。
　（２）該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である（１）記載の方法。
　（３）該微生物が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである（１）または（２）記載の方法。
　（４）該微生物が放線菌、腸内細菌または酵母である（１）～（３）のいずれか記載の方法。
　（５）該微生物が放線菌である（４）記載の方法。
　（６）エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物。
　（７）ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた（６）記載の微生物。
　（８）マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである（６）または（７）記載の微生物。
　（９）放線菌、腸内細菌または酵母である（６）～（８）のいずれか記載の微生物。
　（１０）放線菌である（９）記載の微生物。
　本発明によれば、強力な抗酸化作用をはじめとする多様な生理活性を持つ有用物質であるエルゴチオネインを安価かつ大量に製造することができる。さらに、本発明ではエルゴチオネインが菌体外に産生されるので、製造プロセスを簡略化でき、純度の高いエルゴチオネインを容易に得ることができる。
図１は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の野生株（ＷＴ）、野生型エルゴチオネイン生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）およびＳＬＩ＿５２０５遺伝子が破壊されたエルゴチオネイン生産株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）の菌体内外を合わせたエルゴチオネインの総生産量を示すグラフである。 図２は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の野生株（ＷＴ）、野生型エルゴチオネイン生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）およびＳＬＩ＿５２０５遺伝子が破壊されたエルゴチオネイン生産株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）の菌体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。 図３は、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスのコントロール株（ＷＴ／ｐＩＪ１０１）（S. avermitilisと表記）およびＥＧＴ生産株（ＷＴ／ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）（S. avermitilis/pEGTと表記）の菌体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。 図４は、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス野生株ＭＡ－４６８０（ＮＩＴＥ寄託番号： ＮＢＲＣ１４８９３Ｔ）（ＭＡ－４６８０と表記）およびＳＵＫＡ１７株の菌体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。 図５は、空ベクターｐＣＳＤ、ｐＣＧを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（ｐＣＳＤ、ｐＣＧと表記）およびＥＧＴ生合成遺伝子過剰発現ベクターｐＣＳＤ－ｅｇｔＡＢＣＤＥ、ｐＣＧ－ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（ｐＣＳＤ－ｅｇｔＡＢＣＤＥ、ｐＣＧ－ｅｇｔＡＢＣＤＥと表記）の体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。
　本発明は、第１の態様において、エルゴチオネイン（本明細書においてＥＧＴと略称することがある）生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法に関する。
　微生物を用いた物質生産においては、生産性を高めるために目的物質を菌体外に産生させることが重要であることが知られている。しかし、エルゴチオネインは、輸送体等を介さずには細胞膜を通過できないことが知られている。高等動物等においては細胞内にエルゴチオネインを取り込む輸送体としてOCTN1が知られているが、細胞外へエルゴチオネインを排出する輸送体は生物種を問わず同定されていないため、輸送体等を過剰発現させるなどの方法は現状困難である。物理的や化学的な処理以外で、エルゴチオネインを菌体外に排出する方法は、宿主がもつ内在性の輸送体が同物質を排出していることが考えられる。
　本発明に用いるＥＧＴ生産能を有する微生物は、菌体外にＥＧＴを産生し、かつエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である。該微生物はＥＧＴを菌体外に産生するものであれば、ＥＧＴを菌体内に産生するものであってもよい。菌体内よりも菌体外に多くのＥＧＴを生産する微生物が好ましい。菌体外にＥＧＴを産生するとは、菌体からＥＧＴを遊離させること、ならびに菌体表面にＥＧＴを産生することを包含する。菌体からＥＧＴが遊離される場合は、培養物の菌体外画分、例えば培養上清からＥＧＴを回収することができる。菌体表面にＥＧＴを産生する場合は、撹拌、超音波処理、界面活性剤処理等の公知の手法によりＥＧＴを菌体から遊離させ、遊離されたＥＧＴを回収することができる。
　菌体から遊離されたＥＧＴの回収は公知の方法によって行うことができる。例えば、培養物を遠心分離あるいは濾過等の固液分離に供して培養上清を得て、培養上清をイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知のクトマトグラフィーに供してＥＧＴを得ることができる。
　上述のごとく、本発明に用いる微生物はＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である。ＥＧＴ生合成遺伝子は、ＥＧＴの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子である。ＥＧＴの生合成に関与する酵素およびＥＧＴ生合成遺伝子は公知であり、いくつかの遺伝子はヌクレオチド配列も公知である。当業者は、過剰発現させるＥＧＴ生合成遺伝子を適宜選択することができる。例えばマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Schizosaccharomyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現する微生物を用いることが好ましいが、これらの微生物に限定されない。マイコバクテリウム属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、F. P. Seebeck, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 6632-6633を参照することができる。シゾサッカロマイセス属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、T. Pluskal et al, PLOS ONE. 2014 May; 9(5): e97774を参照することができる。ノイロスポラ属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、W. Hu et al, Org. Lett. 2014, 16, 5382-5385を参照することができる。また、ストレプトマイセス属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、S. Nakajima et al, J. Biosci. Bioeng. 2015 (in press)を参照することができる。各種微生物におけるＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、G. W. Jones et al, Gene 549 (2014) 161-170を参照することができる。
　遺伝子を過剰発現するとは、親株または野生株と比較して当該遺伝子の発現量が多いことを意味する。親株または野生株の２倍以上の発現量であることが好ましく、５倍以上の発現量であることがより好ましく、１０倍以上の発現量であることがさらに好ましい。遺伝子発現の定量は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて行うことができる。
　相当する遺伝子とは、ある微生物のエルゴチオネイン生合成経路においてある反応を触媒する酵素をコードする遺伝子に対して、別の微生物のエルゴチオネイン生合成経路において当該酵素と同じまたは類似の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子をいう。ある遺伝子と、それに相当する遺伝子が同じヌクレオチド配列を有していてもよく、異なるヌクレオチド配列を有していてもよい。例えば、ある遺伝子と、ある遺伝子に相当する遺伝子のヌクレオチド配列同一性は５０％以上であってもよく、７０％以上、８０％以上、あるいは９０％以上であってもよい。さらに、ある遺伝子によりコードされる酵素タンパクと、ある遺伝子に相当する遺伝子によりコードされる酵素タンパクが同じアミノ酸配列を有していてもよく、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、ある遺伝子によりコードされる酵素タンパクと、ある遺伝子に相当する遺伝子によりコードされる酵素タンパクのアミノ酸配列同一性は５０％以上であってもよく、７０％以上、８０％以上、あるいは９０％以上であってもよい。
　ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現は、公知の遺伝子過剰発現方法を用いて行うことができる。発現の強いプロモーターの制御下にＥＧＴ生合成遺伝子を置く方法が一般的である。例えば、ＥＧＴ生合成遺伝子の発現に適したプロモーターとＥＧＴ生合成遺伝子を組み込んだ発現ベクターを微生物に導入することによって、または相同組み換え等により宿主のゲノムにＥＧＴ生合成遺伝子を組み込むことによって、ＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させてもよい。ベクターとしてはプラスミドベクターやウイルスベクターを用いることができる。ベクターの構築に際して、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子や代謝酵素遺伝子などのマーカー遺伝子などのベクターの構成要素を適宜選択し、使用することができる。微生物への遺伝子導入方法も公知である。導入すべき遺伝子をそのまま、あるいはベクターに組み込んで、微生物に導入することができる。遺伝子導入方法の例としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ポリマーを用いる方法、電気穿孔法、パーティクルガン法などがあり、遺伝子導入する微生物の種類や導入する遺伝子に応じてこれらの方法を適宜選択することができる。また、ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現は、ゲノム上の特定の遺伝子もしくは領域を欠失させることで、内在性のＥＧＴ生合成遺伝子の発現を誘導させてもよい。
　ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現方法は上記方法に限定されない。また、本発明に用いる微生物は、自然変異の結果としてＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現するものであってもよい。ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて確認することができる。あるいは、実際に微生物を培養して、菌体外（培養液中）に産生されるＥＧＴを定量することにより、ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現を確認することもできる。
　微生物において過剰発現させるＥＧＴ生合成遺伝子は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。ＥＧＴ生合成に関与する複数の酵素をコードする遺伝子を、クラスターとして微生物に導入してもよい。異属または異種微生物由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させてもよく、同属または同種微生物由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させてもよい。同属または近縁属由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させることが好ましく、同種または近縁種由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させることがより好ましい。同種由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させることがさらに好ましい。
　本発明に用いるＥＧＴ生産能を有する微生物は、ＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であって、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物であることが好ましい。ヒスチジンはＥＧＴ生合成の材料の１つであり、ヒスチジンの代謝に関連するヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させることによって、ＥＧＴ生合成に使われるヒスチジンを増加させ、ＥＧＴ生産量を増加させることができる。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減させた微生物とは、その親株または野生株よりもヒスチジンアンモニアリアーゼ活性が低下している微生物である。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性の低下の割合は、好ましくはその親株または野生株の５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満である。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を消失させた微生物が最も好ましい。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を消失させた微生物とは、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性が全く検出されない微生物である。あるいは、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた微生物は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物ということもできる。ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現の低下の割合は、好ましくはその親株または野生株の５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満である。ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現を消失させた微生物が最も好ましい。ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を消失させた微生物とは、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現が全く検出されない微生物である。なお、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性、およびヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現は公知の方法にて測定可能である（Hartwell L. H. and Magasanik B., 1963, J. Molecular Biology, 7:401-420.）。
　ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させる方法、ならびにヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させる方法も公知であり、例えば、相同組換えやＲＮＡ干渉などによりヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする方法、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害する物質を微生物に投与する方法などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。また、本発明に用いる微生物は、自然変異の結果としてヒスチジンアンモニアリアーゼ活性が低減または消失しているものであってもよい。
　本発明に用いるＥＧＴ生産能を有する微生物はいかなる種類のものであってもよい。例えば放線菌、腸内細菌、子嚢菌または担子菌であってもよい。本発明に、用いることができる放線菌としてはストレプトマイセス（Streptomyces）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の放線菌が例示されるが、これらに限定されない。本発明に用いることができる腸内細菌としてはエシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、及びサルモネラ（Salmonella）属の細菌が例示されるが、これらに限定されない。また、上記の細菌以外としてはメタノール資化性菌である、メチロバクテリウム（Methyrobacterium）属細菌を用いてもよい。本発明に用いることができる子嚢菌としてはシゾサッカロマイセス（Shizosaccaromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）、キャンディダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、及びペニシリウム（Penicillium）属、ノイロスポラ（Neurospora）属の子嚢菌が例示されるがこれらに限定されない。本発明に用いることができる担子菌としてはタモギタケ、ササクレヒトヨタケ、ブナシメジ、キツブナラタケ、ヒラタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  及びヤマブシタケなどの担子菌が例示されるが、これらに限定されない。
　本発明において、放線菌、腸内細菌または酵母、が好ましく用いられる。好ましい放線菌としてはストレプトマイセス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属などの放線菌が挙げられる。好ましい腸内細菌としては、エシェリヒア属、パントエア属、サルモネラ属などの腸内細菌が挙げられる。好ましい酵母としては、シゾサッカロマイセス属、サッカロマイセス属などの酵母が挙げられる。本発明において特に好ましく用いられる放線菌はストレプトマイセス属の放線菌であり、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces　griseus）、ストレプトマイセス・アルバス（Streptomyces albus）、ストレプトマイセス・アルブルス（Streptomyces albulus）などが挙げられる。
　本発明のＥＧＴ製造方法における微生物の培養は、通常の方法にて行うことができる。微生物の種類に応じて培地組成や培養温度、培養時間、ｐＨ、通気条件等の諸条件を選択することができる。上記微生物を公知の培地にて培養することにより、ＥＧＴを菌体外に産生させることができるが、ＥＧＴ産生量を増加させるために、システイン、ヒスチジンなどのＥＧＴ生合成に寄与する化合物あるいはそれらの前駆体を培地に添加してもよい。例えば用いる微生物が放線菌である場合は、放線菌用の半合成培地（６％グルコース、０．２％ ＮａＣｌ、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％ 酵母抽出物、０．００５％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００５％ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．００５％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ ＣａＣＯ３）、ＴＳＢ培地（０．２５％ グルコース、１．７％ カゼイン膵消化物、０．３％ 大豆パパイン消化物、０．５％ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｋ２ＨＰＯ４）、またはＳＹＮ培地（０．７％ カザミノ酸、０．２％ 酵母抽出物、０．２６４％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２３８％ ＫＨ２ＰＯ４、０．５５６％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６４％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１１％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００７９％ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．００１５％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ ＣａＣＯ３）などを用いることができる。腸内細菌を用いる実施形態では、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、またはＹＰＤ培地などを用いることができる。酵母を用いる実施形態では、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地、またはＹＰＡＤ培地などを用いることができる。上記の培地を用いて、菌体外にＥＧＴを産生させることができるが、用いる培地はこれらに限定されない。
　本発明は、第２の態様において、ＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物に関する。
　本発明のＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物としては、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Schizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させた微生物が好ましいが、これらの微生物に限定されない。
　本発明のＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物が、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物であることが好ましい。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性の低減または消失、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現の低下については上で説明したとおりである。
　かかる微生物およびその作製については上で説明したとおりである。当業者は、公知の手段・方法を用いてかかる微生物を容易に作製することができる。したがって、本発明は、第３の態様において、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させることを特徴とする、ＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物の製造方法に関する。好ましくは、上記製造方法においてヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させること、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させることが好ましい。エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させる工程を、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させる工程、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させる工程の前に行ってもよく、後に行ってもよい。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり改変した方法を用いて、実験を実施した。また、％は、特に明記しない限りｗ／ｖ ％を表す。
　ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans） １３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ　１５６７５）を宿主に用いてＥＧＴ生産株を作製し、培養液中におけるＥＧＴ産生量の比較、検討を行った。
１－１．ＥＧＴ生産株の構築
１－１－１．ストレプトマイセス・リビダンスにおけるＥＧＴ生合成酵素遺伝子の発現強化
ＥＧＴ生合成酵素遺伝子として、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１３９（配列番号１）、ＳＬＩ＿１１４０（配列番号２）、ＳＬＩ＿１１４１（配列番号３）、ＳＬＩ＿１１４２（配列番号４）遺伝子を用いた。上記４遺伝子はストレプトマイセス・リビダンス１３２６株ゲノム上でクラスターを形成している。これらの遺伝子は、それぞれ、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤに相当する遺伝子である。
表１のプライマーを用いてストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のゲノム抽出物を鋳型に、上記４遺伝子を含むクラスター配列を増幅した。増幅したクラスター配列を、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Streptomyces avermitilis） ＭＡ－４６８０株のＳＡＶ＿２７９４遺伝子のプロモーター（配列番号５）制御下にてｐＩＪ１０１の複製起点を有するベクターに連結し、遺伝子発現ベクターｐＩＪ１０１＿ＥＧＴを構築した。この遺伝子発現ベクターを用いて、ストレプトマイセス・リビダンス　１３２６株を形質転換し、ＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）を得た。形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Genetic Manipulation of Streptomyces」（Hopwood,D.A.ら、1985年、Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual，the John Innes Foundation，Norwich）に記載の方法に従って行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１－１－２．ストレプトマイセス・リビダンスにおけるヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子（ＳＬＩ＿５２０５）の破壊
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子（配列番号８）内の部分配列を、表２のプライマーを用いて同菌株のゲノム抽出物を鋳型に増幅した。増幅産物をｐＧＭ１６０の複製起点を有するベクター（Mol. Gen. Genet.,1989, 219, 341-348を参照）にクローニングすることで、ＳＬＩ＿５２０５遺伝子破壊用ベクターを得た。同ベクターにより１－１記載のＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴを形質転換することで、相同組み換えによりゲノム上のＳＬＩ＿５２０５遺伝子内に、遺伝子破壊用ベクターが挿入されたＳＬＩ＿５２０５遺伝子破壊株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
１－２．ＥＧＴ生産株によるＥＧＴの発酵生産
１－２－１．放線菌の培養
　ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の野生株（ＷＴ）、上記１－１で得た野生型ＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）、上記１－２で得たＳＬＩ＿５２０５遺伝子が破壊されたＥＧＴ生産株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）、それぞれのグリセロールストックを５ｍＬのＴＳＢ培地（以下、表３を参照のこと）を含む試験管に添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間振盪培養し前培養液を得た。５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（以下、表３を参照のこと）に、１％量の前培養液を添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。同培養液を２８℃、１６０ｒｐｍで１週間振盪培養し、培養液中にＥＧＴを産生させた。培養期間中は、炭素源であるグルコースが枯渇しないよう、適時グルコースを添加した。また、培養試験はＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ株、ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ株共に３検体ずつ実験を行い、生産量は３株の平均値を用いて評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
１－２－２．ＥＧＴの定量
　本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し培養サンプルを評価した。採取した培養液を１４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。沈殿物は熱水抽出（６０℃、１０分）により、細胞内成分を抽出し、菌体内サンプルとした。菌体内サンプル及び、分離した菌体外培養液（菌体外サンプル）中のＥＧＴ含量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表４の通りで、保持時間１０分付近に生じるＥＧＴのピークをもとに、定量を行った。また、分離した沈殿物（菌体）からあらかじめ、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
１－２－３．結果
　１－２－１、１－２－２の培養試験の結果、各菌株の菌体内外合わせたＥＧＴの総生産量（図１）を比較した場合、ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約１１倍、ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約１３倍、それぞれ増加した。また、各菌株の菌体外に産生されるＥＧＴ生産量（表５及び図２）を比較した場合、ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約６７倍、ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約１２８倍、とそれぞれ想定以上に顕著にＥＧＴの菌体外生産性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Streptomyces avermitilis） ＭＡ－４６８０（ＮＩＴＥ寄託番号： ＮＢＲＣ１４８９３Ｔ）を宿主に用いてＥＧＴ生産株を作製し、培養液中におけるＥＧＴ産生量の比較、検討を行った。
２－１．ＥＧＴ生産株の構築
コントロールとして遺伝子が連結されていないｐＩＪ１０１と実施例１で構築したｐＩＪ１０１＿ＥＧＴそれぞれを用いて、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ－４６８０株を形質転換し、コントロール株（ＷＴ／ｐＩＪ101）とＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）を得た。形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Genetic Manipulation of Streptomyces」（Hopwood,D.A.ら、1985年、Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual，the John Innes Foundation，Norwich）に記載の方法に従って行った。
２－２．ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＥＧＴ生産株によるＥＧＴの発酵生産
２－２－１．培養
　上記２－１で得たストレプトマイセス・アヴェルミチリスのコントロール株（ＷＴ／ｐＩＪ１０１）、ＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）、それぞれのグリセロールストックを５ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）を含む試験管に添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間振盪培養し前培養液を得た。５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）に、１％量の前培養液を添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。同培養液を２８℃、１６０ｒｐｍで５日間振盪培養し、培養液中にＥＧＴを産生させた。培養期間中は、炭素源であるグルコースが枯渇しないよう、適時グルコースを添加した。
２－２－２．ＥＧＴの定量
　実施例１の１－２-２と同様に行った。
２－２－３．結果
　２－２－１、２－２－２の培養試験の結果、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスの各菌株の菌体外に産生されるＥＧＴ生産量（図３）を比較した場合、ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴ／ｐＩＪ１０１に対して約２６倍と想定以上に顕著にＥＧＴの菌体外生産性が増加した。
ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ－４６８０のゲノム大規模欠失株であるＳＵＫＡ１７（茨城県つくば市高野台３－１－１にある理研バイオリソースセンター寄託番号： ＪＣＭ　１８２５１）による菌体外培養液へのＥＧＴ生産の検証を行った。ＳＵＫＡ１７株は、親株であるストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ－４６８０ゲノムにおいて複数の内在性代謝産物の生合成遺伝子クラスターを欠失させた菌株であり、これらのクラスター欠失により内在性のＥＧＴ生合成遺伝子の発現が誘導された菌株である。
３－１．ＳＵＫＡ１７株によるＥＧＴの発酵生産
３－１－１．培養
　ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ－４６８０（ＮＩＴＥ寄託番号： ＮＢＲＣ１４８９３Ｔ）と上記ＳＵＫＡ１７株それぞれのグリセロールストックを５ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）を含む試験管に添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間振盪培養し前培養液を得た。５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）に、１％量の前培養液を添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。同培養液を２８℃、１６０ｒｐｍで５日間振盪培養した。培養期間中は、炭素源であるグルコースが枯渇しないよう、適時グルコースを添加した。
３－１－２．ＥＧＴの定量
　実施例１の１－２－２と同様に行った。
３－１－３．結果
３－１－１、３－１－２の培養試験の結果(図４)、ＳＵＫＡ１７株はストレプトマイセス・アヴェルミチリスのＭＡ－４６８０株よりも、菌体外へのＥＧＴ生産性が意外にも約３４倍と顕著に向上することを見出だした。
　コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を用いて、ＥＧＴ生産株を作製し、培養液中におけるＥＧＴ産生量の比較、検討を行った。
４－１．ＥＧＴ生産株の構築
４－１－１．コリネバクテリウム・グルタミカムへのＥＧＴ生合成遺伝子の導入
　ＥＧＴ生合成遺伝子としてマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)ゲノム上でクラスターを形成するｅｇｔＡ（ＭＳＭＥＧ＿６２５０:配列番号１１）、ｅｇｔＢ（ＭＳＭＥＧ＿６２４９:配列番号１２）、ｅｇｔＣ（ＭＳＭＥＧ＿６２４８:配列番号１３）、ｅｇｔＤ（ＭＳＭＥＧ＿６２４７:配列番号１４）、ｅｇｔＥ（ＭＳＭＥＧ＿６２４６:配列番号１５）の５遺伝子を用いた。
　上記５遺伝子を含むクラスターを、表６記載のプライマーを用いてマイコバクテリウム・スメグマティス（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ　３０８２）のゲノムを鋳型に、３つのＰＣＲ断片（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３）として増幅した。ベクターは、ｐＢＬ１の複製起点を有するｐＣＨ（Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:533-541を参照）のプロモーター領域をコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡ遺伝子、ＳＯＤ遺伝子（Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:291-301を参照）のプロモーターにそれぞれ置換したｐＣＧ（ｇａｐＡプロモーター）とｐＣＳＤ（ＳＯＤプロモーター）を用いた。増幅した3断片とＢａｍＨＩ処理したベクターｐＣＧまたはｐＣＳＤを合わせた４断片をＮＥＢ社のギブゾンアッセンブリーマスターミックスを用いて連結した。ギブゾンアッセンブリー法はＮＥＢ社のプロトコールに従って行った。上記の通り、ｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤ、ｅｇｔＥの５遺伝子をタンデムにｐＣＧ、ｐＣＳＤにクローニングしたｐＣＧ－ｅｇｔＡＢＣＤＥとｐＣＳＤ－ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ構築した。
　空ベクターｐＣＧ、ｐＣＳＤ、構築したｐＣＧ－ｅｇｔＡＢＣＤＥとｐＣＳＤ－ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ用いてコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ寄託番号：２１７９９）にエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション法は、従来公知の方法に従って行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
４－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＥＧＴ生産株によるＥＧＴの発酵生産
４－２－１．培養
　４－１で構築した菌株をBrain Heart Infusion (ＢＨＩ：表７記載)プレート（寒天１．５％）にストリーク後30℃で一晩培養した。得られたコロニーを５０ ml 容試験管に入れた１０ｍｌの ＢＨＩ培地に白金耳で１かき植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間振盪培養し前培養液とした。滅菌済みの２４穴ディープウェルにＢＨＩ培地（終濃度100mg/L L-シスチン、終濃度100mg/L L-メチオニンを含む）を２ｍｌずつ分注し、得られた前培養液１０μｌを植菌し７２時間１０００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後、培養液１ｍｌをサンプリングし、菌体外へのＥＧＴ生産量を調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
４－２－２．ＥＧＴの定量
　実施例１の１－２-２と同様に行った。
４－２－３．結果
　４－２－１の培養試験の結果（図５）、コリネバクテリウム・グルタミカムはＥＧＴ生合成遺伝子をゲノムにもたないため空ベクターｐＣＧ、ｐＣＳＤを導入したコリネバクテリウム・グルタミカムは菌体外にＥＧＴを生産しなかった。しかし、ＥＧＴ生合成遺伝子過剰発現ベクターｐＣＧ－ｅｇｔＡＢＣＤＥとｐＣＳＤ－ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ導入したコリネバクテリウム・グルタミカムは共に菌体外培養液中にＥＧＴを蓄積した。以上の通り、もともとＥＧＴ生産能をもたないコリネバクテリウムにおいて菌体外へＥＧＴを生産させることに成功した。
　以上より、上記のような各種微生物を用いて菌体外にＥＧＴを生産させることで、より大量に効率的にＥＧＴを製造できることを見出だした。
　本発明によれば、強力な抗酸化作用をはじめとする多様な生理活性を有するエルゴチオネインを安価かつ大量に製造することができるので、本発明は、医薬品、化粧品、食品等の幅広い分野において利用可能である。
　配列番号：１は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１３９遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：２は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１４０遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：３は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１４１遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：４は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１４２遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：５は、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ－４６８０株のＳＡＶ＿２７９４遺伝子のプロモーターの塩基配列である。
　配列番号：６は、ＥＧＴ生合成酵素のクラスターを増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
　配列番号：７は、ＥＧＴ生合成酵素のクラスターを増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
　配列番号：８は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：９は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子の部分配列を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
　配列番号：１０は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子の部分配列を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
　配列番号：１１は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：１２は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＢ遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：１３は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＣ遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：１４は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＤ遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：１５は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＥ遺伝子の塩基配列である。
　配列番号：１６は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
　配列番号：１７は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
　配列番号：１８は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
　配列番号：１９は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
　配列番号：２０は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
　配列番号：２１は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
　配列番号：２２は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ～ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。

Claims (10)

  1. 　エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法。
  2. 　該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である請求項１記載の方法。
  3. 　該微生物が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである請求項１または２記載の方法。
  4. 　該微生物が放線菌、腸内細菌または酵母である請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　該微生物が放線菌である請求項４記載の方法。
  6. 　エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物。
  7. 　ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた請求項６記載の微生物。
  8. 　マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである請求項６または７記載の微生物。
  9. 　放線菌、腸内細菌または酵母である請求項６～８のいずれか１項記載の微生物。
  10. 　放線菌である請求項９記載の微生物。
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